全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-05
基金项目:天津市科委重点攻关项目(043182711)
作者简介:李丹(1982-),女,硕士研究生,研究方向:蓝藻基因工程,E-mail:linmolidan@yahoo.com.cn
通讯作者:施定基(1939-),男,研究员,研究方向:蓝藻基因工程
人肿瘤坏死因子 (hTNF-α,humanTumorNecrosisFactorα)是一种由内毒素激活的巨噬细胞产生的并
对癌细胞有杀伤作用,而对正常细胞无细胞毒作用的非种属特异性活性的蛋白质细胞因子[1]。目前 hTNF-α
基因已在大肠杆菌中得到成功表达,并进行了Ⅲ期临床试验。但是大肠杆菌含有内毒素,对人体毒副作用
较大,且表达产物常形成包涵体,产品的分离纯化工艺复杂,成本高。
随着蓝藻分子生物学的进展使蓝藻成为继大肠杆菌和酵母之后的新一代转外源基因的表达宿主,受
到广泛的重视。自 20世纪 90年代以来,已有多个药物蛋白的基因在蓝藻中得到表达[2]。蓝藻有生长迅速、
培养成本低、通常不含内毒素、表达产物不形成包涵体等特点,适合制备口服重组药物。
中国科学院植物研究所在国家自然科学基金和海洋“863”支持下,已得到转 hTNF-α基因的海洋聚球
藻 7002,但是表达率很低,仅有 0.08%,而且生长较慢。要使转基因生物有产业化前景,至少有两个要求,
葡萄糖浓度对转基因聚球藻表达hTNF-α和光合作用的影响
李丹 1 崔莹 1 施定基 1,2 王学魁 1 段睿 1 张芃芃 2 宋东辉 1
(1天津科技大学海洋科学与工程学院,天津 300457;2中国科学院植物研究所,北京 100093)
摘 要: 为了开发海洋药物,把人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)转入海洋单细胞蓝藻聚球藻7002。然而,转基因聚
球藻的hTNF-α表达率很低,仅为可溶性蛋白的0.08%,这不利于进一步纯化。不同浓度的葡萄糖对转TNF-α聚球藻的
生长、hTNF-α的表达和光合作用的影响。当葡萄糖浓度为 125mmol/L,hTNF-α 的表达率达到最高,是不含葡萄糖的
6.57。此外,当葡萄糖浓度为75mmol/L时,藻细胞的净光合作用速率达到最大,是光自养藻细胞的1.69倍。在各种葡萄糖
浓度下,藻细胞对葡萄糖的吸收都不明显。
关键词: 人肿瘤坏死因子-α 转基因聚球藻 葡萄糖 光合作用
EfectsofGlucoseonPhotosynthesisandExpressionofhTNF-α
inTransgenicSynechococcussp.
LiDan1 CuiYing1 ShiDingji1,2 WangXuekui1 DuanRui1 ZhangPengpeng2 SongDonghui1
(1DepartmentofMarineScienceandEngineering,TianjinUniversityofScience&Technology,Tianjin300457;2Instituteof
Botany,ChineseAcademyofSciences,Beijing100093)
Abstract: In ordertoempolderoceanmedicine,thisworkwastotransferhTNF-α to marineunicelular
Synechococcussp7002.ButtheexpresionofTumorNecrosisFactor-α(TNF-α)inTransgenicSynechococcussp.was
too low,which wasonly0.08%,and itwasalso adverseto industrialization.Thispaperreported theefectsof
concentrationofglucoseonthegrowthofTransgenicSynechococcussp.,expresionofTNF-α andPhotosynthesisof
transgenicSynechococcussp.Whentheconcentrationofglucosewere125mmol/L,theexpresionofTNF-α were
maximalthosewere6.57foldofthecultivationwithoutglucose.Moreover,glucosehadastimulativeefecton
photosynthesisoftransgenicsynechococcussp.Thenetphotosynthesisweremaximalwhentheconcentrationofglucose
was75mmol/L,whichmeansitwas1.69foldofphotoautotrophic.TherewasnoObviousefectcausedbyconcentration
ofglucoseforglucoseconsumption.
Keywords: TNF-α TransgenicSynechococcussp Glucose Photosynthesis
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
即目的产物表达率高和转基因生物生长快。光合作用是藻细胞生长的基础。已有研究表明,葡萄糖可影响
蓝藻的光合电子传递。Aoki和 Katoh在研究 Synechococcussp.的质醌库功能和容量时,发现外源葡萄糖、果糖
可促使质醌还原[3]。汪晶等也证明了葡萄糖对转 hTNF-α聚球藻的生长有促进作用[4],但是其对 hTNF-α表
达的影响还未见报道。通过摸索葡萄糖的最优浓度,明显提高了 hTNF-α的表达量,而且对不同浓度的葡
萄糖对藻细胞光合作用的影响进行了分析。
1 材料与方法
1.1 种子液培养
转 hTNF-α基因聚球藻(Synechococcussp.withhTNF-αgene)由本研究室段睿同学构建(待发表)。选用
MA培养液[5],pH调整到 8.2,加入终浓度为 50μg/ml的硫酸卡那霉素。从平板上挑取单藻落接入到试管(含
有终浓度为 50μg/ml的硫酸卡那霉素),光照振荡培养,温度 35℃,平均光强 100μmol·m-2·s-1,转速 130r/
min[4]。一周后,将藻液从试管扩大到 250ml的锥形瓶(含有终浓度为 50μg/ml的硫酸卡那霉素),同样条件
下培养,8d后即可用作种子液。
1.2 加入不同浓度的葡萄糖培养蓝藻
向 150ml培养液中加入 5ml种子液,培养至第 8d,分别向其中加入已灭菌的葡萄糖母液,使葡萄糖的
终浓度分别为 0mmol/L、25mmol/L、50mmol/L、75mmol/L、100mmol/L、125mmol/L、150mmol/L。隔天取藻测定
藻细胞生长及 TNF-α表达情况(每 1个实验都做 3组平行)。分别在第 8d和第 10d用氧电极测定其光合作
用强度。
1.3 藻细胞干重的测定
培养过程中隔天取样,用 UV-7504型分光光度计测量藻液在 750nm的吸光值,用细胞干重与 OD750的
关系式转化为干重(Y):Y=0.5598OD750。
1.4 培养液中硝酸根含量的测定
采用酚二磺酸分光光度法[6]测定加入葡萄糖 2d后的培养液中硝酸根含量,检测外加碳源对藻细胞吸
收氮源的影响。
1.5 转基因聚球藻的细胞破碎
将藻样先冻融 12h以上,在冻融的样品中加入 50μl50mg/ml的溶菌酶,30℃温浴 1h,加入 10μl1mmol/l
KCl,30℃温浴 30min,最后 4℃,12000r/min离心 10min。
1.6 总可溶性蛋白测定
Folin酚试剂法[7],以牛血清白蛋白为基准。
1.7 TNF蛋白含量检测
双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)[8,9]检测 TNF-α蛋白的含量。每孔(96孔板)加入已稀释的蛋白样品
100μl,用酶标仪测定 OD450的值,按 TNF-α含量占总可溶性蛋白的百分数来表示 TNF-α基因表达率(%)。
1.8 pH值的测定
每隔 3d取样用 pH计测定 pH值的变化。
1.9 残糖测定(葡萄糖氧化酶终点比色法)
培养液中残糖含量的检测用葡萄糖试剂盒检测(上海申索试剂有限公司)。
1.10 转基因聚球藻光合作用的检测
在特定时间取藻液,用 HanstechDW/1型 Hanstech氧电极测定转基因藻的光合作用强度,其温度由
DH-2120(上海嘉鹏科技有限公司、上海伊利仪器制造有限公司)通过循环水控制在 26℃,光源为红色发光
二极管,通过 ORT1型光量子计标定。从不同条件培养下的摇瓶中取 2ml藻液,加入氧电极反应室中测定
净光合放氧。测定藻液在 678、720和 750nm的光吸收值(每个样品做 3组平行)。按下列公式[10]确定样品的
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叶绿素 a浓度:叶绿素 a浓度(μg/ml)=14.96(OD678-OD750)-0.616(OD720-OD750)
2 结果与讨论
2.1 葡萄糖浓度对转 hTNF-α聚球藻生长的影响
2.1.1 不同浓度的葡萄糖下转 hTNF-α聚球藻藻细胞干重的变化 对数生长期是藻细胞生长最旺盛的时
期,在转基因蓝藻即将进入对数生长期(第 8d)时加入葡萄糖对藻的生长有明显的促进作用。从图 1中可
以看出,藻细胞干重随着培养天数的增加一直呈上升趋势,以光自养的聚球藻作对照,葡萄糖浓度范围从
25mmol/L到 150mmol/L,均不同程度地促进了藻的生长。且随着葡萄糖浓度的增高,这种促进作用越明显。
当葡萄糖浓度为 150mmol/L时,对转基因聚球藻生长的促进作用最明显,藻细胞的干重是不加葡萄糖的
1.73倍。由于蓝藻细胞中三羧酸循环是不完全的,葡萄糖在蓝藻细胞中主要是通过磷酸戊糖途径被分解利
用的[11~13],葡萄糖的存在很可能弥补了碳源的不充分,并使细胞在碳源利用中所消耗的 ATP和 NADPH有
所节省,促进了藻细胞的生长,进而缩短了藻细胞的培养周期。
2.1.2 不同浓度的葡萄糖下藻细胞对氮源的吸收情况 随着藻细胞密度的增加,氮源不断地被消耗。葡萄
糖浓度的变化影响了藻细胞对氮源的吸
收 (表 1)。当葡萄糖浓度为 125mmol/L
时,培养液中剩余的氮源含量仅为不加
葡萄糖的 35.2%,说明外源葡萄糖不仅向
藻细胞提供了足够的碳源,而且促进了
藻细胞对氮营养源的吸收,使得细胞增长速度加快,在规模培养中有利于节约成本。但是,并不是葡萄糖浓
度越高,越有利于藻细胞对氮源的吸收。当葡萄糖浓度为 150mmol/L时,这种促进作用不如葡萄糖浓度为
125mmol/L时明显,这可能是由于过高浓度的葡萄糖产生的自由基对藻细胞有损害作用,影响了藻细胞对
营养源的吸收。
2.2 不同浓度葡萄糖下培养基 pH的变化情况
表 1 葡萄糖浓度对转基因聚球藻细胞吸收氮源的影响
图 1 葡萄糖浓度对转基因聚球藻生长影响 图 2 葡萄糖浓度下转基因聚球藻培养基 pH变化
如图 2所示,添加葡萄糖进行培养时,培养液明显有变酸的趋势,且葡萄糖浓度越高,这种趋势越明
显。这是因为葡萄糖被利用时产生了少量的有机酸,导致溶液的 pH下降。不添加葡萄糖的培养液的 pH值
在培养过程却有所升高,并且在第 6d左右有一个快速升高的过程,可能是藻在这一时期刚刚进入生长对
数期,对碳源的需求有一个突然增加的阶段,而这时藻液中的CO2被迅速消耗,从而导致pH值的快速上升[14],
随后又稍微下降。培养过程中,即使不对 pH值进行调节,藻也能稳定生长。这说明,蓝藻有很好的自我调
节能力。
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2.3 混合培养过程中葡萄糖浓度的变化
如图 3所示,在混合培养过程中,无论外源葡萄糖浓度为多少,葡萄糖的浓度都呈微弱的下降趋势。蓝
藻不同于其它的原核生物,其内呼吸作用很低,并且在暗中只能有限的利用碳源,也不同于真核生物,因其
不具有完全的 TCA循环[17],一些 TCA循环的关键酶如 α-异戊二酸脱氢酶,琥珀酸脱氢酶等的缺乏,导致一
些底物很难被利用。即便如此,外源葡萄糖还是明显促进了 hTNF-α的表达和转基因聚球藻的光合作用,
有研究表明,在对蓝藻进行混合培养时,外源葡萄糖充当着一个信号体的角色,它的存在提高了己糖激酶
(一个与蓝藻光合作用有关的酶)的活性,并且发挥着诱导剂的作用[18],进而在消耗很少的提前下也能明显
促进藻细胞的光合作用和外源基因的表达。
2.4 葡萄糖浓度对 hTNF-α表达的影响
添加葡萄糖不仅使藻细胞生长周期缩短,而且 hTNF-α表达率也大幅度增加。从图 4中可以看出,以光
自养型的聚球藻作对照,葡萄糖浓度范围从 25mmol/L到 150mmol/L,藻细胞中 hTNF-α的表达率均明显提
高,随着浓度增高,表达率随之升高,葡萄糖浓度为 125mmol/L时,藻细胞培养至第 12d,hTNF-α的表达率
最高,是不加葡萄糖(到第 22d才达到表达高峰)的 6.57倍,实验表明,葡萄糖不仅促进转基因蓝藻的生
长,对 hTNF-α的表达也有明显的促进作用,而且使 hTNF-α的表达高峰提前,缩短了培养时间。
自 13d以后,hTNF-α的表达率呈下降趋势,这是由于在对数生长中期,大部分能量都用于合成藻细胞
自身需要的物质,影响了 hTNF-α的合成。但是,此时 hTNF-α的蛋白量依然呈上升趋势,只是占总可溶性
蛋白的比率在下降而已。在转基因聚球藻培养至 23d时,hTNF-α的表达率又出现一个小的表达高峰,这是
由于转基因藻生长后期,总可溶性蛋白变化不再明显,而此时 hTNF-α蛋白已积累到一定量,所以又会出
现一个小的表达高峰。
当葡萄糖浓度为 150mmol/L时,hTNF-α的表达率有所降低,说明只是在一定范围内,葡萄糖浓度越
高,对 hTNF-α表达越有利。当葡萄糖浓度过高时,葡萄糖产生的自由基的毒害作用不仅会影响藻细胞的
正常新陈代谢,而且会使 cAMP的浓度降低,阻碍 cAMP与基因激活蛋白 CAP的结合,从而抑制了 lac操纵
子的转录[15],影响了 hTNF-α的合成。
图 3 混合培养时葡萄糖浓度的变化 图 4 不同葡萄糖浓度对 hTNF-α表达的影响
2.5 不同浓度葡萄糖下转基因聚球藻的光合作用
取生长到第 8d的藻液,测定它们光合作用强度均约为 75μmolO2mg-1Chlh-1,即在加入葡萄糖之前,各
瓶藻液的最大放氧量基本一致。然后向其中加入葡萄糖,使终浓度分别为 0mmol/L、25mmol/L、50mmol/L、
75mmol/L、100mol/L、125mmol/L和 150mmol/L,2d后,取藻液,测定它们各项光合作用参数(表 2)。
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在加入葡萄糖 2d后,转基因聚球藻藻细胞的最大光合作用速率有不同程度的提高,尤其是在葡萄糖
浓度为 75mmol/L时,藻细胞的最大光合作用速率是光自养藻细胞的 1.69倍,光合效率(α)是光自养藻细
胞的 3.41倍。Aoki和 Katho[3]及 Mi[16]等人的研究成果都说明外源葡萄糖提供的电子如同内源淀粉、葡萄糖
等提供的电子一样可以进入 PQ-cytb/f并流向 PSI,提高了跨内囊体膜质子梯度和细胞的光合磷酸化水
平,从而促进了转基因聚球藻的光合作用。
从表 2还可得出,加入葡萄糖后,葡萄糖在促进藻细胞光合作用的同时,也加大了藻细胞的呼吸作用,
说明外源葡萄糖活化了转基因蓝藻的新陈代谢系统。此外,葡萄糖的加入提高了藻细胞对光的敏感性,光
饱和点(Ik)和光补偿点(Ic)都有所降低,说明葡萄糖有利于光在藻细胞中的传导,降低了藻细胞对光的需
求,至于这种传导机制的变化还需要进一步研究。
然而,并不是葡萄糖浓度越高,对藻细胞的光合作用促进越明显,当浓度为 100mmol/L时,其对光合的
促进作用小于 75mmol/L,这一现象与葡萄糖促进 hTNF-α表达情况类似。这些现象说明,在进行转基因聚
球藻优化培养时,葡萄糖的浓度是有一定限制的,过高的葡萄糖浓度不仅降低了对 hTNF-α表达的促进作
用,而且对藻细胞的光合系统也有一定的破坏。
3 结论
研究了不同葡萄糖浓度下的转基因聚球藻 7002的混合陪养生长状况,结果表明,随着葡萄糖浓度的
增加,转基因藻的细胞干重得到明显提高,当葡萄糖浓度为 150mmol/L时,藻细胞的干重是不加葡萄糖的
1.73倍。添加葡萄糖后溶液的 pH值有很大的降低,但是,适应后的转基因聚球藻仍能够正常生长。在一定
范围内,随着葡萄糖浓度的增加,转基因聚球藻藻细胞吸收氮源的能力,hTNF-α的含量以及藻细胞的光合
作用都得到不同程度的提高。当葡萄糖浓度为 125mmol/L,对藻细胞对氮源的吸收和 hTNF-α表达的促进
作用最为明显。当葡萄糖浓度为 75mmol/L时,藻细胞的光合作用速率达到最大。混合培养对藻细胞的生
长、hTNF-α表达以及藻细胞的光合作用都有一定的促进作用,并且缩短了培养周期,节约了成本。但是外
加葡萄糖的浓度有一定的限制,为了方便后续的纯化工作,应最大程度的提高 hTNF-α的表达,所以,在进
行混合培养时,选择的葡萄糖浓度应为 125mmol/L。
参考 文献
1 OldLJ.Science,1985,230:630~632.
2 施定基.藻类基因工程制备重组药物.第 7届海洋湖沼药物学术研讨会论文集,大连:2001.
3 AokiM,KatohS.PlantCelPhysiol,1983,24:1379~1386.
4 汪晶,康瑞娟,施定基,等.过程工程学报,2004,4(2):136~140.
5 HechtU,MohrH.Physiologiaplantarum,1990,78:379~387.
6 StevensSE,PatersonCOP,MyersJ.JPhycol,1973,9:427~430.
7 汪家政,范明.蛋白质技术手册.北京:科学出版社,2000,42～47.
表 2 葡萄糖浓度对转基因聚球藻光合作用的影响
李丹等:葡萄糖浓度对转基因聚球藻表达hTNF-α和光合作用的影响 159
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
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参考 文献
1 张建平,谢洁,张素萍,等.科学通报,1999,4(5):495~498.
2 DoughertyTJ.SeminSurgOncol,1989,5(1):6~16.
3 FooteCS.PhotochemPhotobiol,1991,54:659.
4 OchsnerM.PhotochemphotobiolB,1997,39:1~18.
5 WesleyM.Sharman,CynthisM,etal.DDT,1994,4(11):507~517.
6 陈杰波,欧敏锐,等.海峡药学,2003,15(6):8~12.
7 MorcosNC.LasersSurgMed,1988,8(1):7~10.
8 蔡心涵,何立明,等.中国海洋药物杂志,1995,14(1):15~18.
9 HeJA,HuYZ,JiangLJ.BiochemBiophysActa,1997,1320(2):165~174.
10 李冠武,王广策,温伯贵,等.肿瘤防治杂志,2001,8(4):353~356.
11 李冠武,王广策,等.激光生物学报,1997,6(3):1119~1121.
12 蔡春尔,吴庆磊,何培民.生物技术通讯,2005,16(5):518~521.
13 随正红,张学成.海洋科学,1998,22(4):24~27.
14 OheochaC.PhysiologyandBiochemistryofAlgae,1962,421.
15 Galand-IrmouliAV,PonsL,LuconM,etal.JChromatogrB,2000,739(1):117~123.
16 纪明候.海藻化学.北京:科学出版社,1997.
17 陈小强,龚兴国,等.浙江大学学报(理学版),2005,32(4):438~441.
18 黄蓓,张平,孙兆奇,王广策.激光生物学报,2006,15(5):471~477.
8 焦奎,张书圣.酶联免疫分析技术及应用.北京:化学工业出版社,2004,136~137.
9 TilgH.CanJGastroentrol,2001,15(10):661~668.
10 PackerL,GlazerAN.Cyanobacteria,In:AbelsonJN,SimonMI(eds).Bacteria.Amsterdam:AcademicPress,1988,167:766~778.
11 PearceJ,LeachCK,CarNG.JGenMicrobiol,1969,55:371~378.
12 CheungWY,GibbsM.PlantPhysiol,1966,41:731~737.
13 PearceJ,CarNG.JGenMicrobiol,1969,54:451~462.
14 姚南瑜编著.藻类生理学.大连:大连工学院出版社,1987,182~185.
15 SchroeckhV,HartmannM,Birch-HirschfeldE,RiesenbergD.ApplMicrobiolBiotechnol,1992,36(4):487~92.
16 MiH-L,EndoT,SchreiberU,OgawaT,AsadaK.PlantCelphysiol,1994,35:163~173.
17 PeterF,TheBlue-greens.GreatBritain.EdwardArnoldLtd,1983,34~35.
18 RolandF,ElenaBaena-Gonzalez,JenSheen.PlantBiology,2006,57:675~709.
160