全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
基因工程抗体研究进展
李菁 林彤 宋帅 高闪电 邵军军 丛国政 独军政 常惠芸
(中国农业科学院兰州兽医研究所 国家口蹄疫参考实验室 家畜疫病病原生物学国家重点实验室
农业部畜禽病毒学重点开放实验室 ,兰州 730046)
　　摘 　要 : 　随着对分子生物学研究和抗体分子结构功能的深入研究 ,利用细胞工程和遗传工程对抗体分子进行改建并赋
予其新的功能 ,进而开发了新的抗体应用领域 ,使单克隆抗体技术又向前发展了一步。基因工程抗体是按人类设计所重新组
装的新型抗体分子 ,可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性 ,去除或减少无关结构 ,从而可克服单克隆抗体在临
床应用方面的缺陷。
关键词 : 　基因工程抗体 人源化抗体 小分子抗体 核糖体展示
Advances in Genetic Engineer ing Antibody
L i J ing　L in Tong　Song Shuai Gao Shandian Shao Junjun Cong Guozheng Du Junzheng　Chang Huiyun
( Key Laboratory of Anim al V irology of M inistry of Agriculture, S tate Key Laboratory of Veterinary E tiological B iology,
N ational FMD Reference Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institu te, Chinese Academ y of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046)
　　Abs trac t: 　W ith the development of research in molecular biology and structure, function of antibody, antibody was rebuild by cell
and genetic engineering and had a new function, thereforeit was app lied in many fields, which attribute the development of monocle anti2
body. Genetic engineering antibody was reassembled under design, which reserve and increase the specificity and biologic activity of nat2
ural antibody, remove and decrease the irrespective structure, getting rid of the defection of monocle antibody in clinical app lication.
Key wo rds: 　Genetic engineering antibody Humanized antibody M icromolecular antibody R ibosome disp lay
收稿日期 : 2009204223
基金项目 :国家科技支撑计划 (2006BAD06A14, 2006BAD06A10)
作者简介 :李菁 (19832) ,女 ,在读硕士 ,研究方向 :分子病毒学 ; E2mail: ljwy831114@163. com
通讯作者 :常惠芸 (19652) ,女 ,博士 ,研究员 ,主要从事口蹄疫病毒分子生物学和免疫学研究工作 ; E2mail: changhuiyun@126. com　　抗体在生物医学领域中的应用极为广泛 ,其制备技术经历了从多克隆抗血清、单克隆抗体到基因工程抗体等 3个发展阶段。1975 年 , Kohler和 M l2stein建立了体外细胞杂交融合的杂交瘤细胞 ,产生了仅针对某一特定抗原决定簇、纯度很高的单克隆抗体。由于单克隆抗体的高度特异性 ,使其在细胞生物学、基础医学、临床诊断及其他领域得到广泛应用。但同时单克隆抗体也存在一些缺陷 ,如完整抗体分子大 ,大部分抗体是鼠源性抗体 ,应用于人体会产生抗鼠抗体反应 (HAMA )等 ,因而妨碍了其在临床上的应用。为了克服大分子单克隆抗体的缺点 ,人们利用基因工程技术制备了人鼠杂交和完全人源 化的抗体 ,减少抗体中的鼠源成分 ,尽量保留原有抗体的特异性 ,此技术主要是将免疫球蛋白基因结构与功能同 DNA重组技术有机结合起来 ,在基因的水平上将免疫球蛋白分子进行重组后导入转染细胞后表达 ,这类抗体被称为第三代抗体。基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体 ,主要包括两部分 :一是对已有的单克隆抗体进行改造 ,包括单克隆抗体的人源化 (嵌合抗体、人源化抗体 )、小分子抗体 ( Fab, ScFv, dsFv, diabody, m inibody等 )以及抗体融合蛋白的制备 ;二是通过抗体库的构建 ,使得抗体不需抗原免疫即可筛选并克隆新的单克隆抗体。
2009年第 10期 李菁等 :基因工程抗体研究进展
1 人源化抗体
1. 1 嵌合抗体
嵌合抗体 ( chimeric antibody)属第一代人缘化
抗体 ,有 60% ～70%的人源区域 ,是目前研究较多
且较为成熟的基因工程抗体 ,它是应用 DNA重组技
术将鼠源单抗的 V区基因与人免疫球蛋白的 C区
基因相连接 ,构建成嵌合基因 ,插入适当质粒 ,转染
相应宿主细胞表达产生的。其中可变区具有结合抗
原的功能 ,而恒定区则具有抗体效应功能、免疫原性
和种属特异性。嵌合抗体的 Fc段可补充细胞毒效
应分子功能 [ 1 ] ,并可延长抗体在血清中的半衰期。
这种技术保留了完整的鼠单抗可变区序列 ,其亲和
力和特异性都得到了保证 ,但也保留了鼠可变区的
异源性 ,仍可能诱导产生 HAMA。
1. 2 CDR移植抗体
CDR移植抗体 (CDR2grafted antibody)是 20世
纪 90年代发展起来的一项新技术 ,是在嵌合抗体的
基础上 ,利用基因工程技术用人的 FR替代鼠 FR形
成更为完全的人缘化抗体 ,即除了 3个 CDR是鼠源
的外 ,其余全部是人缘结构 ,属第二代人缘化抗体。
但单纯 CDR移植难以保证亲本鼠单抗的亲和力和
特异性得到再现 ,因为具有支持作用的 FR不仅为
CDR的构想提供了环境 ,有时还参与抗体位点正确
构象的形成 ,甚至参与抗原的结合 [ 2 ]。因此该技术
需要考虑两方面的问题 :选择合适的人类受体模板
和识别插入人源抗体的鼠源模板上的关键残基。最
常用的方法是选择与鼠源抗体有高同源性的人源抗
体。另有研究人员在此基础上还进行了表面氨基酸
残基人源化和表位印模选择工作 ,以降低其免疫原
性。CDR移植抗体是人源化中最常用的策略。
2 小分子抗体
2. 1 单链抗体
单链抗体 ( single chain antibody, scFv)是抗体分
子中保留抗原结合部位的最小功能片段 ,分子量约
为完整抗体分子的 1 /6,是用基因工程方法将抗体
重链和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组
蛋白 ,在大肠杆菌中表达成一单链多肽 ,并在细菌体
内折叠成只由重链和轻链可变区构成的一种新型的
抗体。与抗体分子相比 , scFv在药代动力学上表现
出了更好的组织穿透力 ,用于治疗时可进入一般抗
体不能达到的部位。同时 ,由于抗原结合面不变 ,抗
体片段拥有全部结合特异性。单链抗体的独特之处
在于其多肽接头 ,多肽接头可设计为具有特殊功能
的位点 ,如金属螯合、连接毒素或药物等 ,以用于影
像和临床治疗。单链抗体优越性在于可通过包含体
大量表达、易于基因工程操作 ,尤其易于构建抗体融
合蛋白 ,具有分子小、免疫原性低、无 Fc端、不易与
具有 Fc受体的靶细胞结合、对肿瘤组织的穿透力强
等特点 ,可作为药物、毒素、放射性核素、细胞因子导
向肿瘤的有价值分子。
2. 2 双特异性单克隆抗体
双特异性单克隆抗体 ( bispecificmonoclonal anti2
bodies, B sAb,双抗 )是通过化学偶联、细胞工程 (双
杂交瘤细胞 )和基因工程方法制备的一种单克隆抗
体的特殊类型 [ 3 ]。它有两个抗原结合位点 ,可分别
结合两种不同的抗原表位 ,即结构上双价、功能上单
价。它实际是一种杂交分子 ,两条 H链之间与两条
L链之间的结构不同 ,两个 Fab片段也不同。早期
的双特异性抗体是用化学重组法制备 ,量少且活性
较低。1983年 , M ilstein等在单克隆抗体的原理上
进一步运用杂交 2杂交瘤技术 ,以生物学方法制备出
双特异性单克隆抗体。该抗体其中一个臂可与靶细
胞表面的抗原结合 ,另一个臂则可与效应物 (如药
物、效应细胞等 )结合 ,从而直接将效应物导向靶组
织细胞。研究发现 ,这种靶向作用不受特异性受体
和靶细胞上 MHCⅠ类分子及其刺激分子参与等约
束 ,且当肿瘤细胞不存在时 ,效应细胞不被激活 [ 3 ]。
2. 3 二硫键稳定抗体
二硫键稳定抗体 ( disulfied2stablized Fv, dsFv)是
在单链抗体的基础上发展起来的一类新型基因工程
抗体 ,它是将抗体重链可变区 (VH )和轻链可变区
(VL )的各一个氨基酸残基突变为半胱氨酸 ,通过链
间二硫键连接 VH和 VL可变区的抗体 [ 4 ]。通用的突
变位点是重链的 44位和轻链的 100位或重链的
105位和轻链的 43位。 dsFv最显著的优点是生化
性质稳定 ,能够耐受环境条件的剧烈作用。
2. 4　Fab片段
将重链 Fd基因与完整的轻链基因 5′端接上细菌
的信号序列 ,所表达的蛋白在细菌信号肽的引导下可
分泌到周质腔 ,信号肽被信号肽酶所裂解 ,生成的 Fd
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
段和轻链在周质腔中完成立体折叠和链内、链间二硫
键 ,形成异二聚体 ,成为有功能的 Fab。这种小分子
抗体具有抗体的活性 ,其大小为完整 IgG的 1 /3。另
外 ,因其不含有 Fc段、分子量小、免疫原性低 ,穿透力
强 ,可与多种药物及放射性同位素偶联 ,多用作导向
药物的载体和显影。但其主要在原核细胞内表达 ,折
叠性有待解决 ;且仅有 1个抗原结合位点 ,与抗原的
亲和力低 ,故在肿瘤治疗上有其优越性 [ 5 ]。
3 某些特殊类型的抗体
3. 1　双功能抗体
双功能抗体 ( bifunctional antibody, BfAb)经人工
设计构建的双特异性抗体由两个不同的抗原结合位
点组成 ,将一种抗体分子与另一种功能分子 ,如药
物、酶或放射性核素结合 ,使功能分子导向靶部位 ,
并激发具有导向性的免疫反应 ,又称为双功能抗体。
3. 2 抗原化抗体
抗原化抗体 ( antigenized antibody, AbAg)是把编
码蛋白质抗原表位的核苷酸片段插入重链 CDR3序
列中进行表达 ,从而产生具有天然抗原表位构象和
免疫原性的新型抗体。
3. 3 内抗体
细胞内抗体 ( intrabody)主要是指在细胞内合成
并作用于细胞内组分的抗体 ,亦称内抗体 ,其中
gp120的 Fab段和抗 Tat ScFv已进入临床试用。
314　抗体酶
抗体酶 (Abzyme)是抗体与抗原非共价键结合 ,
作为表位的抗原是低能态分子 ,结构稳定。酶与底
物以疏水作用为主 ,但底物为高能态分子 ,不稳定。
抗独特型 b2B可以模拟底物表位 ,诱导产生抗体分
子 ,当它作用与底物时 ,引起底物分解或其它改变。
由于酶分子易失活 ,抗体酶本质是抗体 ,分子相当稳
定。用它来代替酶促进化学反应 ,能简化程序 ,带来
可观效益 ,现已研制出分支酸盐变位酶、脂酶和肽酶
的抗体酶 ,催化反应良好。此外 ,通过基因工程、蛋
白质工程和化学修饰等方法也可制得催化抗体。首
先人工合成基因 ,然后将编码的基因转入细菌或酵
母的表达系统 ,采用突变等手段随机产生抗体 ,经筛
选和纯化可得催化抗体 ,或对抗体进行化学修饰 ,引
入酶的催化集团 ,从而把抗体改造成催化抗体。
通过化学等方法把脂质体嵌入或偶联上特异性
抗体制成免疫脂质体 ( immunoliposome, IL )目前已
成为具有广泛应用前景的靶向释药系统。将抗体分
子片段与其它蛋白融合 ,可得到具有多种生物学功
能的融合蛋白 ,如免疫毒素 ( immunotoxin)、免疫细
胞因子 ( immunocytokine)、免疫黏附素 ( immunoadhe2
sin) ,在治疗中有着良好的应用前景。
4 人源性单抗的研制
4. 1 噬菌体抗体库技术
噬菌体抗体库技术是从外周血淋巴细胞或脾细
胞中提取 RNA 或基因组 DNA,设计核酸引物 ,用
PCR技术扩增出整套的抗体基因片段如 Fab或 scFv,
通过随即重组 ,插入噬菌体或噬菌粒表达载体中 ,与
噬菌体外壳蛋白基因 PⅢ或 PⅧ连接 ,感染大肠杆
菌并以融合蛋白的形式使抗体片段表达展示于噬菌
体表面 ,形成含有全套抗体谱 ( repertoire)的噬菌体
抗体库 ,利用抗原 2抗体特异性结合进行筛选、富集 ,
并扩增所需克隆 [ 6, 7 ]。
噬菌体展示技术是将编码外源肽或蛋白的
DNA片段插入噬菌体的外壳蛋白共同表达于噬菌
体表面 ,以利于配体的识别和结合 ,而插入的 DNA
片段对噬菌体的生物学特性无大的影响 [ 8 ]。
4. 1. 1 丝状噬菌体 丝状噬菌体包括 f1、fd、M13
衍生的载体表达系统。这类噬菌体的基因组为闭合
环状的单股正链 DNA ( ssDNA) ,基因组 DNA的长度
可随插入 DNA片段大小不同而变化 ;编码 10种蛋
白质 ,它们在分子量和拷贝数上有很大的差别 ,其中
应用较多的是次要衣壳蛋白 PⅢ、PⅥ、PⅦ、PⅨ和主
要衣壳蛋白 PⅧ。PⅢ是噬菌体的吸附蛋白 ,每个噬
菌体平均含有 5个拷贝 ,分子量为 4. 2 ×104 ,其前体
在 N端含有 18个氨基酸的信号肽。 PⅢ作为外源
性插入部位的优点是装载量大 ,甚至可容纳 5 ×104
外源片段 ;拷贝数少 ,有利于分离到高亲和性的表
位。PⅧ含量丰富 ,每个噬菌体含有 2 700～3 000拷
贝 ,分子量为 5. 2 ×103 ,其前体含有一个 23氨基酸
的信号肽。PⅧ作为外源基因插入部位的优点是表
达的抗体效价较高 ,但抗体亲和力较低。Gao等 [ 9 ]
将 VH和 VL基因分别连接到 PⅦ、PⅨ的 N2末端 ,经
重叠 PCR扩增、酶切消化后整合入载体 ,使之在噬
菌体表面以异二聚体形式表达 ,成功地构建了一个
噬菌体抗体库。这类载体表达系统的缺点 :一些较
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2009年第 10期 李菁等 :基因工程抗体研究进展
大插入片段在增殖时易发生缺失 ;包装效率低 ,只有
重组 DNA链中一条以 ssDNA形式合成包装到病毒
颗粒 ;宿主细胞在噬菌体感染后会发生变化。
4. 1. 2 噬菌粒 噬菌粒是噬菌体和质粒的混合
体 ,含有单链噬菌体的复制原点和基因间隔区间及
至少一种外壳蛋白编码序列 ( PⅢ或 PⅧ)。噬菌粒
作为载体应用最广泛 ,其优点 :转化率高 ,比噬菌体
高 2～3个数量级 ,可产生大量 DNA及抗体蛋白 ;既
可以表达可溶性 Fab又可表达附着性 Fab;在抗体
库扩增时 ,融合蛋白渗漏表达水平低 ,毒性小。但
是 ,此类载体需要有辅助噬菌体来产生单链基因 ,并
组装成有感染力的噬菌粒。
4. 2 核糖体展示
核糖体展示技术 [ 10 ]的核心是利用体外核糖体
表达载体构建 ScFv 抗体库 , 并于体外转录为
mRNA ,体外翻译表达 ,随后以固相化的抗原分子亲
和筛选出核糖体 mRNA2ScFv复合物中的高亲和力
ScFv。这种技术在试验中不用任何细胞 ,是第一个
完全在体外筛选有功能蛋白的方法。该技术克服了
其它一些蛋白质筛选技术 ,如噬菌体展示需转化细
菌或真核细胞 ,因效率不高而降低库容 ,减少抗体多
样性的局限 ,并避免了宿主随细胞基因组复制过程
中可能丢失而产生的库容下降 ,同时亦解决了因抗
体筛选条件不利于宿主细胞生存而导致抗体丢失这
一难题。由于核糖体展示技术的体外翻译、体外筛
选的特点 ,大大缩短了试验周期 ,具有省时、省力、方
便、快速的特点。
1997年 Plukthun实验室 Hanes等 [ 11 ]的多聚核
糖体展示技术 (polyribosome disp lay)进行改进建立
了核糖体展示技术 ,可在体外筛选或改造功能蛋白
(如抗体 )。首先构建核糖体展示的 DNA模板 ,然
后依次体外转录、体外翻译和亲和筛选 ,转录产物
mRNA不含任何终止密码子 ,在体外翻译过程中核
糖体会停留在 mRNA的 3′2末端 ;在体外翻译和亲和
筛选是保证核糖体不会从 mRNA上解离 ,使筛选蛋
白的基因型和表型以 mRNA2核糖体 2蛋白复合物的
形式偶联在一起。经过每轮展示 ,筛选蛋白一般能
够被富集 100～1 000倍。整个过程完全在体外进
行 ,不经转化 ,可以进行大容量库 ( > 1011 )的构建和
筛选 ,可以方便地引入突变 ,调整筛选条件和选择压
力 ,因此可以筛选到高亲和力的蛋白分子及进行其
定向进化的研究 [ 12 ]。
1997年 Roberts和 Szostak与 Nemoto分别独立
设计了另外一种与核糖体展示类似方法 ,称为mRNA展
示技术或 RNA2多肽融合技术 (RNA2pep tide fusion)
或体外病毒技术。这个展示系统是利用嘌呤霉素分
子将 mRNA分子和其所编码的多肽共价结合起来。
嘌呤霉素与单链 DNA连接物的 3′端连接 ,然后这个
DNA连接物再与文库编码的 mRNA 3′端连结。当
mRNA在体外翻译时 ,核糖体到达 mRNA和 DNA的
结合点并稳定下来 ,嘌呤霉素进入核糖体氨酰化位
点 ,并在氨酰转移酶的作用下与所编码的多肽偶联。
mRNA2DNA2嘌呤霉素分子文库可在体外翻译 ,然后
用固相化的靶分子将纯化的 RNA2多肽复合物淘选
出来 ,像核糖体展示系统那样 ,这个复合物可通过
RT2PCR得到进一步的扩增 [ 13, 14 ]。
其它体外筛选技术还有 1998年 A rnold等 , 1999
年 Forrer等建立的体外筛选酶活性技术 ( selection
for enzymatic activity in vitrcl) ; 1999年 Doi和 Yana2
gawa建立的 STABLE技术在油包水乳剂中模拟活
细胞区域化进行翻译和筛选 ;以及 Actinova公司的
共价展示技术 ( covaeent disp lay)等 [ 15 ]。
5 展望
基因工程抗体的发展已使抗体制备技术进入了
一个全新的时代 ,此项技术已广泛深入到生物医学中
的许多领域 ,尤其是噬菌体抗体库技术的建立 ,使得
不经过免疫、利用抗原直接从库中筛选特异性抗体成
为可能 ,使抗体的制备变得简单易行 ,稳定有效 ,使人
源抗体的制备有了突破 ,这是抗体工程领域的重大进
展。这极大地推动了各种性能优良抗体及多功能抗
体融合蛋白的开发和应用 ,而且在蛋白质纯化工程中
也有广阔的应用前景。随着分子生物学、分子免疫学
的发展及噬菌体抗体库技术的成熟 ,人们可以根据需
要改造和制备各种人和动物用抗体。可以预见 ,一个
随意定向地制造抗体的时代即将到来。
参 考 文 献
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2010年部分生物、农林类学术期刊联合征订表
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激光生物学报 42 - 194 双月刊 120 www. jgswxb. net jgswxb@hunnu. edu. cn
菌物学报 2 - 499 双月刊 480 http: / / journals. im. ac. cn / jwxtcn / jwxt@ im. ac. cn
昆虫知识 2 - 151 双月刊 150 www. ent - bull. com. cn entom@ ioz. ac. cn
林业科学 82 - 6 月刊 300 www. linyekexue. net linykx@ forestry. ac. cn
人类学学报 2 - 384 季刊 100 www. ivpp. ac. cn acta@ ivpp. ac. cn
山地农业生物学报 66 - 66 双月 100 http: / /web. gzu. edu. cn / jou / jou / Sd. xb@163. com
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生物工程学报 82 - 13 月刊 780 http: / / journals. im. ac. cn /cjbcn / cjb@ im. ac. cn
生物技术通报 18 - 92 月刊 300 biotech@mail. caas. net. cn
生物技术通讯 82 - 196 双月 150 http: / / swtx. chinajournal. net. cn swtx@263. net
生物信息学 14 - 14 季刊 48 xxsw. chinajournal. net. cn cjbioinformatics@ yahoo. cn
微生物学报 2 - 504 月刊 660 http: / / journals. im. ac. cn /actam icrocn / actam icro@ im. ac. cn
微生物学通报 2 - 817 月刊 576 http: / / journals. im. ac. cn /wswxtbcn / tongbao@ im. ac. cn
武汉植物学研究 38 - 103 双月刊 180 http: / /whzwxyj. cn editor@ rose. whiob. ac. cn
畜牧兽医学报 82 - 453 月刊 240 www. xm syxb. com xm syxb@263. net
遗传 2 - 810 月刊 600 www. chinagene. cn yczz@ genetics. ac. cn
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营养学报 6 - 22 双月刊 108 http: / /yyxx. chinajournal. net. cn / yyxx@chinajournal. net. cn
云南植物研究 64 - 11 双月刊 150 http: / / journal. kib. ac. cn bianji@mail. kib. ac. cn
植物遗传资源学报 82 - 643 双月刊 120 www. zwyczy. cn
Zwyczyxb2003@ sina. com
Zwyczyxb2003@163. com
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