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继代时期添加铜对籼稻成熟胚组织培养的影响



全 文 :生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第1期
收稿日期:2007-08-13
基金项目:湖南农业大学青年科学基金项目(05QN23)
作者简介:李海林(1970-),男,湖南长沙人,农艺师,从事植物学研究
水稻是我国主要的粮食作物[1]。过去我国籼型杂交水稻的研制成功和大面积推广应用为我国粮食产量
的增长提供了重要的保障。但是,目前我国现有水稻品种的产量与品质还不能满足人们生活水平日益提高
的需求,因而改进与提高现有水稻品种的产量与品质成为水稻育种工作的主题。现代育种技术除采用常规
育种技术之外,还需采用基因工程技术对现有籼稻品种进行改良来满足人们生活水平日益提高的需求。国
内外水稻组织培养技术的不断完善,大大推进了以组织培养为基础的水稻遗传工程的发展。总的来说,粳
稻品种容易被转化成功,转化频率高;籼稻转化则较为困难,成功率较低,仅在少数品种中获得成功,造成
这种差异的原因是籼稻的离体培养比粳稻困难[2]。应用水稻成熟胚作为组织培养的外植体能够克服水稻生
长季节的限制,加快实验进程,缩短研究年限[3]。
以 5个农艺性状优良,在生产上有重要应用价值的籼型杂交水稻亲本成熟胚作为外植体进行了铜元
素对愈伤组织褐化和分化影响研究,为以后利用铜元素在短期内提高愈伤组织培养力提供一些科学依
据。
1 材料与方法
1.1 供试水稻品种
选用 I-32A、培矮 64S、R402、T0974和 9311等 5个不同类型的籼型杂交水稻亲本品种种子成熟胚作
为组织培养的外植体材料。
继代时期添加铜对籼稻成熟胚组织培养的影响
李海林 1 殷江南 2
(1湖南农业大学作物生理与分子生物学实验室,长沙 410128;2湖南农业大学教务处,长沙 410128)
摘 要: 以杂交水稻5个优势亲本的成熟胚为材料,研究继代培养添加铜元素对籼稻成熟胚组织培养的影响。结
果表明:铜元素能够有效地降低愈伤组织褐化率、提高愈伤组织分化频率;不同品种对同一铜元素浓度或同一品种对不
同铜元素浓度反应差异很大。
关键词: 铜 成熟胚 组织培养
StudyontheEfectsofMatureEmbryoTissueCultureofIndica
RiceinSubculturePeriodwiththeAdditionofCopper
LiHailin1 YinJiangnan2
(1CropPhysiologyandMolecularBiologyLaboratory,HunanAgricultureUniversity,Changsha
410128;2AcademicAfairsOfice,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128)
Abstract: EfectsofmatureembryotisuecultureofIndicariceinsubcultureperiodwiththeadditionofcopper
wasgiveninthispaperbyusingfivefertilizingparentslinesofmatureembryoasexplants.Theresultindicatethat:the
browningfrequencyofcalusisreducedandthediferentiationfrequencyisimprovedgreatly;diferentvarietiesrespond
diferentlytodiferentconcentrationcopperandthesamevarietiesresponddiferentlytodiferentconcentrationcopper.
Keywords: Copper Matureembryo Tisueculture
2008年第1期
1.2 培养基
1.2.1 诱导培养基 N6基本培养基+1000mg/L脯氨酸(Pro)+2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。
1.2.2 继代培养基 N6基本培养基+1000mg/L脯氨酸(Pro)+2mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+(10,5.0,
2.5,1.25,0)mg/L(CuSO4·5H2O)。
1.2.3 分化培养基 N6基本培养基+2mg/L6-BA+1mg/LNAA+500mg/L水解酪蛋白(CEH)。
1.3 试验方法
1.3.1 上述 5个不同水稻品种设置同一诱导培养基,在同一增殖培养基铜元素浓度设置 5个水平,1种分
化培养基,共计 5个品种与 5种增殖培养基组合成 25种处理。
1.3.2 选取以上各供试水稻品种中饱满成熟种子,将经手工去壳后的糙米,用 75%酒精消毒 1min,再用无
菌水冲洗一次;再将各外植体材料分别用 0.1%的升汞灭菌 10min,用无菌水冲洗 4~5次。
1.3.3 将上述经过消毒的各外植体材料,分别放在加有 3张无菌滤纸的无菌培养皿中,在超净台吹干,然
后,接种至相应诱导培养基,并置于 26℃暗培养箱中进行培养,每个处理分别接种 119粒成熟胚,分 7个培
养皿,每个培养皿接种 17粒成熟胚,10d后分别统计各不同水稻品种的出愈率。
1.3.4 将各水稻品种外植体材料在诱导培养基上培养 10d后,选取诱导成功的愈伤组织,无需进行预分化
培养的愈伤组织将直接转入到分化培养基中进行分化培养,需进行预分化培养的愈伤组织,置于 26℃的暗
培养箱中进行预分化培养 15d后,然后转入到分化培养基中,25~30d后分别统计各不同水稻品种的出苗
率。预分化培养时,每个培养皿接种 17块愈伤组织。分化培养时,每个三角瓶接种 12块愈伤组织,每种处
理方式接种 5瓶。分化期间光照强度为 40μmol·m-2·s-1,光照每天 14h。
1.3.5 干燥处理方法 将愈伤组织放在加有 3张无菌滤纸的培养皿中,用封口膜封好,置于 26℃的暗培养
箱中干燥 2d。
1.4 数据处理方法
采用如下指标衡量各籼稻成熟胚组织培养处理的愈伤组织诱导率和分化率:
出愈率(%)=(产生愈伤组织的种胚数/接种的种胚数)×100%;
褐化率(%)=(褐化的愈伤组织块数/转移的愈伤组织块数)×100%;
绿苗分化率(%)=(分化绿苗的愈伤组织块数/转移的愈伤组织块数)×100%。
所有试验数据均在 Excel和 SPSS软件上进行处理。对不同籼稻成熟胚组织培养处理的出愈率、褐化率
和绿苗分化率分别按试验统计分析方法进行方差分析和显著性测验。
2结果与分析
2.1 铜元素对愈伤组织褐化率的影响
如表 1所示,当在增殖培养基中添加铜元素时,所有供试品种在某一种浓度铜元素的增殖培养基上的
褐化率与对照相比都有不同程度的下降,说明在增殖培养基中添加铜元素能够防止愈伤组织褐化,只是每
个品种所需的铜元素浓度不同。同时也发现不同品种在添加同一种浓度铜元素的增殖培养基或同一品种
在添加不同浓度铜元素的增殖培养基上,愈伤组织褐化率差异也很大。这可能是因为不同品种之间由于基
因型的差异而造成多酚氧化酶活性的不同,从而所
需铜元素浓度不同。
2.2铜元素对愈伤组织分化率的影响
如表 2所示,当愈伤组织增殖培养之后直接接
种到分化培养基上时,经过加有不同浓度铜元素的
增殖培养基上增殖培养的愈伤组织在同一分化培
养基上愈伤组织分化率差异很大。虽然有些品种愈
表 1 不同浓度的铜元素上的愈伤组织褐化率
李海林等:继代时期添加铜对籼稻成熟胚组织培养的影响 141
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
伤组织在不同浓度铜元素的增殖培养基上愈伤组
织褐化率相同,但是在分化培养基上的分化率差
异也很大,说明,不同浓度铜元素对提高愈伤组织
胚性效果明显不同。
当愈伤组织经过干燥处理之后,愈伤组织分
化率都有不同程度地降低和提高 (表 2和表 3)。
对于那些经过干燥处理之后,分化率下降的愈伤
组织,可能是由于干燥时间过长,愈伤组织过度失
水而死亡。对于那些经过干燥处理之后分化率提
高的愈伤组织,可能是由于经过干燥处理之后铜
元素能够更加有效地提高愈伤组织胚性,从而提
高愈伤组织分化率。
3 讨论
籼稻成熟胚愈伤组织褐化率较高,分化率较
低,影响基因工程技术在籼稻品种改良上的应用。
最近一些研究发现,在植物组织培养中添加一些微量元素,能够降低愈伤组织的褐化率和提高愈伤组织的
分化率。
褐变在植物组织培养过程中普遍存在,它是指外植体在诱导脱分化和再分化过程中,自身组织从表面
向培养基释放褐色物质,以至培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步褐变死亡的现象[4]。褐变能否得
到有效控制是植物组织培养能否成功的关键所在[5]。近年来植物组织培养技术发展很快,有关褐变的研究
也越来越深入。褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系[6]。褐化
的机理一般认为是组织中的多酚氧化酶被激活,使细胞中的代谢发生变化,酚类物质氧化产生棕褐色的醌
类物质,后者扩散到培养基中,抑制其他酶的活性,毒害整个愈伤组织,从而造成褐变[7]。
铜是植物正常生命活动所必需的微量矿质元素之一,参与广泛的生命活动[8]。当在分化培养基上添加
各种微量元素时,发现只有铜元素具有明显的促进水稻愈伤组织植株再生的作用[9]。铜元素对植物器官分
化有影响,在水稻愈伤组织培养再生植株中有促进作用,但其作用机制尚不清楚[8]。在增殖培养基中添加
铜元素对愈伤组织的增殖量影响极小,但转移到分化培养基后这些愈伤组织能再生出更多的植株[10]。
铜元素可能作为一种胁迫物质与培养基中激素和培养基中的营养元素相互作用,通过与外植体内源
激素的相互作用,促进愈伤组织中与再生力有关基因的表达,从而促进愈伤组织再生,提高愈伤组织再生
频率。不同品种来源的愈伤组织,在组织培养同一阶段对不同浓度的铜元素具有不同的反应,可能是由于
品种之间基因型差异而造成内源激素的含量不同,从而所需的铜元素浓度和外源激素种类和浓度不同。
虽然在组织培养继代阶段设置了几种不同浓度剃度来筛选不同品种在继代阶段所需的理想铜元素浓
度,取得了一定的效果。但是对于一些品种来说,其愈伤组织的褐化率还比较高,愈伤组织的再生频率还比
较低。因此,以后对不同品种建立其再生体系时,必须根据其培养条件筛选出所需的最佳铜元素浓度。还要
对铜元素影响愈伤组织再生率的机制进行系统的研究,以便更好地利用铜元素来促进基因工程技术在籼
稻品种改良中的应用。
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注:(1)同一列中数据后无一相同字母者表示在 0.05水平上差异
显著(LSD检验)
表 2 不同浓度铜元素处理后的愈伤组织分化率
表 3 干燥处理之后不同浓度铜元素处理的愈伤组织分化率
(下转第150页)
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同[7]。在研究中,两种外植体产生愈伤组织的能力不同,叶片比叶柄愈伤诱导能力强,表现在叶片出愈时间
早,且产生的愈伤组织多、质量也好,这与许多植物的表现一样[8,9]。植物生长调节剂的种类对愈伤组织的
诱导具有十分复杂而重要的影响,本研究表明 IBA和 NAA两种生长素促使叶片和叶柄以器官型进行分
化,而 2,4-D使两种外植体以器官发生型进行分化。通常条件下,生长素和细胞分裂素对诱导和保持愈伤
组织的高速生长是必要的,尤其是当生长素和细胞分裂素配合使用时效果更好,在本实验中也同样证明了
这一点。但在只含有 2,4-D的培养基上,愈伤组织的诱导率较低,产生的量也较少,愈伤的增殖倍数低,并
且不利于干物质的积累。当和一定浓度的 6-BA一起使用时,愈伤组织的诱导率大大提高,产生的愈伤组
织较多且质量好,而且有利于愈伤组织的增殖和干物质的积累。
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