全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
互补与蓝白斑筛选机制的探究
周玉亭 曹建斌
(运城学院生命科学系,运城 044000)
摘 要: 针对高校生物科学实验教学中存在的问题, 着重探究了基因重组试验中的 互补与蓝白斑筛选机制, 精心设
计了 5组试验, 结果指出,经双酶切的质粒载体自身不能环化,也不能成功转化;蓝白斑筛选中的蓝斑通常来源于商品载体中
的环状质粒或者线性载体自连后的转化产物;重组子一般为白斑, 但在一定条件下, 白斑也会变成蓝斑。在此基础上作了进
一步的讨论, 为今后的教学实践和科学研究提供借鉴和指导。
关键词: 互补 蓝白斑筛选 重组子
The Research intoM echanism of complementation
and Bluewhite Screening
Zhou Yuting Cao J ianbin
( Yuncheng College, D epartm ent of Lif e Science, Yuncheng 044000)
Abstrac:t Based on the questions o f b io log ical exper iments in co llege teach ing, the research exp lored them echan ism ofcomp le
m enta tion and bluewh ite screen ing and prec isely designed 5 exper im ents. The resu lts show ed that p lasm id vector could no t form loop it
self or transform successfu lly. The b lue patch can be commonly from circu la r plasm id o r transfo rm ation products o f se lflig ation. The re
comb inants usua lly displayw hite patches, but the w hite patches can becom e blue under spec ific cond itions. The resu lts provided d irec
tions fo r future research and teach ing practice.
Key words: com plem entation B luewh ite screen ing Recomb inan t
收稿日期: 20100322
基金项目:运城学院 2009年度院级基础研究项目 ( JC2009020)
作者简介:周玉亭,男,副教授,研究方向:植物学; Ema i:l ycxyzyt@ 163. com
通讯作者:曹建斌,男,硕士, Em ai:l cao jianb in2006@ 126. com
基因工程 ( gene eng ineering)是 20世纪 70年代
以后兴起的一门新技术,即用人工的方法,把遗传物
质 DNA分离出来, 在体外进行基因切割、连接、重
组,然后再转移到生物体内并进行表达的技术。基
因工程中的关键一步是将目的基因与 DNA载体连
接成重组 DNA, 获得重组子, 并把重组子筛选出来。
近年来,建立了许多方法来筛选重组子,其中较为常
用的是利用 互补原理, 根据菌落的蓝白颜色进行
筛选 [ 1]。
互补是指 E. coli 半乳糖苷酶的两个无活
性片段 ( N端片段和 C端片段 )组合而成为功能完
整的酶的过程。现在使用的许多质粒载体都带有
一个 E. coli DNA的短片段, 其中含有 半乳糖苷
酶 N端 146个氨基酸的编码信息及调控序列。在
这个编码区中插入了一个多克隆位点, 可在此处
插入外源 DNA片段。这种类型的载体适用于可编
码 半乳糖苷酶 C端部分的宿主细胞。尽管宿主
和载体编码的两个片段都没有活性, 但他们能够
融合为具有酶活性的蛋白质, 在含有底物 Xgal的
培养基中形成蓝色菌落。当外源 DNA片段插入到
质粒的多克隆位点后, 导致 N端片段丧失 互补
能力, 因此, 带有重组质粒的宿主细胞将形成白色
菌落。
基因重组与蓝白斑筛选是现代基因工程的关键
技术之一,因此也是目前我国高校生命科学专业开
设的基础实验之一。笔者在教学实践中,针对基因
重组这一实验分别参考了魏群主编的 分子生物学
实验指导 !第 1版和第 2版 [ 2, 3] , 结果却显著不同:
2010年第 8期 周玉亭等: 互补与蓝白斑筛选机制的探究
按第一版的方案,将目的基因和载体用单一酶切后,
简单地沉淀回收, 连接转化, 在 LB平板上长出了
蓝、白斑,取得了预期的结果;而按照第 2版方案,将
目的基因和载体用双酶切,产物经电泳分离、切胶回
收,再连接、转化, 结果在 LB平板上只长出了白斑,
而不能长出如教材中所预期的蓝斑。由此, 笔者认
为,有必要对蓝白斑筛选的机制问题进行一次探讨,
诸如: 在转化与蓝白斑筛选操作中,线性的载体能否
够成功转化,形成蓝斑的载体从哪里来,重组载体转
化后是否一定会形成白斑,为何有些白斑会变蓝,重
组转化只有白斑出现是否属于正常现象, 为了回答
这些问题,设计了本试验。
1 材料与方法
1. 1 试剂、质粒及菌株
DNA聚合酶、限制性内切酶 Sp e I和 N co I、T4
DNA连接酶等来源于大连宝生物 TaK aRa公司,核
酸分子量标准为 T IANGEN公司产品, 琼脂糖为上
海 Sangon公司产品; LB培养基、氨苄青霉素、IPTG、
Xga l为北京鼎国公司产品;其余试剂均为国产分析
纯。克隆载体 pGEM T V ector为 Promega公司产品;
受体菌 E. coli TOP10为 T IANGEN公司产品。杜仲
过氧化物酶 Eucomm ia ulm oid es perox idase a基因
( PODa, AY714072)片段 ( 3∀端, 长度为 630 bp的
一段序列, 下同 )。重组质粒 ( PODa片段 + pGEM
V ector)。
1. 2 PODa片段、pGEM T Vector的重组与转化
利用 PCR技术, 将目的基因 PODa从重组质粒
( PODa片段 + pGEM Vector)中扩增出来, 经琼脂糖
凝胶电泳分离并切胶回收后, T4 DNA连接酶, 于
16# 温度下与载体 pGEM T V ecto r连接过夜。然后
将连接产物转化 E. coli TOP10菌株,在含有 IPTG和
Xga l的 LB平板上筛选重组子。
1. 3 空载体 pGEM T Vector的转化
将商品载体 pGEM T V ector转化 E. coli TOP10
菌株; pGEM T V ector用 T4 DNA连接酶作用后, 转
化 E. coli TOP10菌株, 方法同 12。
1. 4 重组质粒的转化
将重组质粒 ( POD a片段 + pGEM Vector)直接
转化 E. coli TOP10菌株, 然后筛选重组子, 方法同
1. 2。待菌落长出来后,提取重组质粒 [ 1]。
1. 5 含目的基因 PODa的重组质粒的酶切、连接、
转化
将重组质粒 ( PODa片段 + pGEM V ector)采用
Sp e I和 N co I双酶切后, 经琼脂糖凝胶电泳分离并
分别回收,获得 PODa基因片段和线性质粒。再将
二者用 T4 DNA连接酶重新连接、转化后, 筛选重组
子, 方法同 1. 2。
1. 6 线性质粒的转化
将 1. 5中双酶切后获得的线性质粒转化 E. coli
TOP10菌株,方法同 1. 2。
2 结果与分析
2. 1 目的基因 PODa与载体 pGEM T V ecto r的重组
转化
基因 PODa与载体 pGEM T Vector重组后, 在
LB平板上筛选重组子。结果显示,在平板上长出两
种颜色的菌落。重组质粒转化子为白斑,而未重组
质粒转化子为蓝斑。
2. 2 载体 pGEM T Vector的转化
将商品载体 pGEM T Vector转化 E. coli TOP10
菌株,结果显示,只在 LB平板上长出少数几个蓝色
的菌落。说明商品载体 pGEM T V ector中存在着非
线性的环化载体。在 T4 DNA连接酶作用后, 蓝斑
显著增多,说明部分载体发生自连环化。
2. 3 重组质粒的转化
重组质粒 ( PODa片段 + pGEM V ector)的转化
效率要比连接产物的转化效率高, 涂板 16 h后,
E. coli TOP10菌落出现白斑,几乎长满了整个平板,
继续培养至 40 h,菌落中有些白斑变为蓝斑,说明培
养基中有少量的 Xgal被降解。
2. 4 含目的基因 PODa的重组质粒的酶切、连接、
转化
重组质粒经 Sp e I和 N co I双酶切后, 获得
POD a基因片段和线性质粒 (图 1)。将二者对应
的条带进行切胶、回收、纯化, 再连接、转化后培
养, 在 LB平板上长出白色的菌落, 但无蓝色菌落
出现。
2. 5 线性质粒的转化
将 1. 5中双酶切后获得的线性质粒转化 E. coli
TOP10菌株,在 LB平板上没有长出任何菌落, 说明
线性质粒不能成功转化。
219
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
M. DNA M aker; 1, 2.重组质粒; 3. 重组质粒双酶切后线
性载体与目的基因分离
图 1 重组质粒的双酶切结果
3 讨论
在基因工程技术中,将外源基因 DNA插入到质
粒载体上,构建重组质粒时,外源 DNA片段与质粒
载体的连接以及转化过程都存在一定的效率, 因此
最后生长出来的菌落并不是都带有目的基因的。这
就需要采用特殊的方法筛选出可能含有目的基因的
重组体克隆。
本试验通过 5种方案来研究质粒的转化过程及
互补与蓝白筛选机制。试验结果证明:
表 1 转化试验结果汇总
序列 转化用 DNA 来源说明 T4连接酶连接 转化结果 补充说明
1 PODa片段、pGEMT Vector PODa为 PCR产物 T4 蓝斑 +白斑 常规 PCR产物克隆
2 pGEMT Vector Prom ega公司 T4 蓝斑 线性载体自连
pGEMT Vector Prom ega公司 无 蓝斑 可能存在少许环状质粒
3 重组质粒 从阳性克隆中提取并电泳纯化 无 白斑 阳性对照
4 PODa片段、pGEM Vector 分别经 Spe I、N co I双酶切并电泳纯化 T4 白斑 DNA重组
5 pGEM Vector 经 Spe I、N co I双酶切并电泳纯化 无 无 载体无法自连,转化失败
( 1)线性质粒载体转化不成功。经双酶切的质
粒载体自身不能环化,也不能成功转化。在大肠杆
菌中尚未发现线性质粒的存在,酶切后的线性质粒
载体如果进入大肠杆菌后有可能遇到自身复制上的
障碍, 或者被宿主细胞中的酶所降解,因而其转化菌
在筛选培养基上不能长成菌落。
( 2)蓝斑是环状质粒转化子形成的。 pGEM T
V ecto r载体是在 pGEM载体的基础上改造而成, 两
个 3∀端都有突出 T,很多 DNA聚合酶在进行 PCR扩
增时会在 PCR产物双链 DNA每条链的 3∀端加上一
个突出的碱基 A,刚好能与 pGEM T V ector 3∀端的 T
互补连接,可以提高 PCR产物的连接和克隆效率。
进行转化后, 在含有 IPTG、Xgal的平板上培养时,
可以通过蓝白筛选,判断载体中有无 DNA片段的插
入。理论上讲,末端带有 T碱基的载体是无法自我
连接成环状的,而试验又证明线性质粒又不能成功
转化, 所以, 蓝斑只能是环化质粒转化子形成的。由
此, 可能的接近合理的解释是商品 pGEM T V ector
载体中存在少量环状质粒和平末端的线性载体 (末
端无突出的 T碱基, 在 T4连接酶作用下少数可以自
连成环状 ) ; 在参考魏群的方法 [ 2, 3]进行基因重组
时, 单酶切方案中有蓝斑出现,是由于载体自连; 而
双酶切方案中,只有白斑而不能长出蓝斑的原因是:
双酶切后的载体无法自连, 非重组的线性载体又不
能转化。
( 3)一般转化后的重组子会形成白斑,有些情
况下这些白斑会逐渐转变成蓝斑。白斑是由于外
源 DNA插入 LacZ基因中, 造成 互补失败,以至
于不能降解生色底物 Xga;l对于时间长了白斑会
变成蓝斑的现象, 这里给出一个合理的解释: DNA
插入后, LacZ会表达并合成出融合蛋白, 在一定条
件下 (如插入 DNA序列不长, 且不改变 LacZ的读
码框 ) ,融合蛋白还有着较低的酶活性, 经过较长
时间后, 也会有少量 Xga l被降解, 释放出蓝颜色
220
2010年第 8期 周玉亭等: 互补与蓝白斑筛选机制的探究
来。在试验中, 有些白色菌落并不一定是真正的
重组子,因为载体自身的缺失或非目的基因的插
入, 都有可能使转化的细胞获得相同的特征, 所
以, 重组质粒转化宿主细胞后, 对转化菌落必须进
一步筛选和鉴定。
参 考 文 献
[ 1] S amb rook J, Ru ssel lDW.分子克隆实验指南 [M ]. 北京: 科学出
版社, 2002.
[ 2] 魏群. 分子生物学实验指导 [ M ] . 北京: 高等教育出版社,
1999: 12.
[ 3] 魏群.分子生物学实验指导 (第 2版 ) [M ] .北京: 高等教育出版
社, 2007: 11.
全国中文核心期刊 中国农业核心期刊
欢迎订阅 2011年 生物技术通报 !
生物技术通报 !是中国农业部主管、由中国农业科学院农业信息研究所主办、中国农业
科学院生物技术研究所和中国农学会高新技术农业应用专业委员会合办的国家级综合性科技
刊物。中国核心期刊遴选数据库来源期刊、中国学术期刊综合评价数据库来源期刊、中国科学
引文数据库来源期刊等。
本刊报道国内外生物技术领域基础研究成果及其在农、林、牧、渔及医药、食品、轻工、环保
领域中的应用和产业化趋势。内容包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程、蛋
白质工程以及生物工程的应用、研究现状和新的实验技术与方法等。 生物技术通报 !设有专
家论坛、综述与专论、研究报告、技术与方法、成果与应用等栏目;报道内容新,信息量大,实用
性强。主要读者对象是从事农业、医药、食品、环保等生物技术领域研究的科研人员、主管部门
管理人员、生物技术产业策划人员、风险投资者和高校师生等。
生物技术通报 !还刊登与生物技术有关的各类广告及会讯。
生物技术通报 !为月刊, 大 16开, 128页, 每月 26日出版, 每期定价 25元, 全年定价
300元。
中国标准连续出版物号: CN 11- 2396 /Q,国际标准刊号: ISSN 1002- 5464。
订阅办法:在当地邮局订阅,邮发代号为 18- 92,国外发行代号为 BM 5607,也可直接向编
辑部订阅 (免邮费 ),挂号需每期另加 3元。
联系电话: 010- 82109925 82109903
E - ma i:l b io tech@ ma i.l caas. ne.t cn
邮 编: 100081
地 址: 北京中关村南大街 12号信息所
收 件 人: 生物技术通报 !编辑部
221