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藏药山莨菪组织培养技术研究



全 文 :生物杖术通报
· 研究报告 · 刀了口百万 乙口     ’     年增刊
藏药山食著组织培养技术研究
徐文华 周国英 陈桂深 孙等
中国科学院西北高原生物研究所 , 西宁   
摘 要  以 田 间栽培两年生 山蓑芳幼芽休眠芽 、带叶柄幼叶为外植体 , 通过器官培养分化芽的途径达到
快速繁殖的 目的 。  基本培养基附加  一      ·  一 ’   一    一      ·  一 ’  和 一      ·  一 ’ , 适于
丛生芽的诱导与增殖  附加  ,  一      ·  一 ‘ 十      ·  一 ’ 十  一    ·  一 ’ , 适于愈伤组织 的诱导与继代
培养 , 诱导率高达        培养基附加      ·  一 ’      的蔗糖 , 适于生根诱导 , 生根率为   。
关键词  山筐营 组织培养 愈伤组织 诱导
                        
     一            
                        
     加       如群 ,       哪      ,   咭  刃  
                         一                                 
            咭 公          ,                                          
         即  ! ∀                         !            一      ·  一 
     一      ·  一   一    一      ·  一      曲                 !  ! ∀#∃%&∀∋ ( ∃)%∗
+ , − ∀)∃− . &/ 0 ∗  − 1 · L 一 1 2 , 4 一 D + 0 . Z m g · L 一 I N A A + o . Z m g · L 一 1 6 一 B A w a s s u i t ab l e fo r t h e i n d u e t i o n a n d s u b -
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.
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.
2 %
.
1 / Z M S m
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u m 俪th l .om g · L 一 ’N A A a n d 3 o g . L 一 l s u e ro s e
w a s s u i t ab l
e fo r t h e i n d u e t i o n o f ro o t s
.
T h e i n d u e t i v i t y o f ro o t i n g w a s 1 0 0 %
.
A s e p t i e s e e d i n g o f A
. t a 了烤“tic 璐 ean be 卿iek-
ly ProPaga ted by shoot eulture .
K ey w o rd s : Anisodo ta鳍以ie。 ( M axim . )P aseher T issu e eulture C allu s In duetion
IJ 蓑若〔Anisodo ta鳍urieus (M ax im .)paseher〕
俗称樟柳参 , 藏医音译唐冲那保 , 属茄科(So lan ac e-ae)山蓑若属 (A nisoduS Link et O tt。 ) 多年生草本植
物 , 具有肉质粗大的主根 。 为青藏高原特有珍稀植
物 , 生于海拔 2 20 一 4 Z o m 的山坡 、路旁 、河滩 、沟
旁及避风向阳的山谷 , 在我国主要分布于西藏东部 、
青海 、 四川 、云南西北部 、甘肃等地[’〕。 其全草含多
种生物碱 , 主要含山蓑若碱 (anisodam ine) , 根含樟
柳碱 (anisodine) 、 蓑若碱 (hyoseyam ine) 、东蓑若碱
(seopolam ine) 、 托品碱 (tro pine)等生物碱[’1 。 山蓑
若作为传统的藏药 , 具有麻醉 、解痉 、镇痛 、解磷中毒
等多种功效【’一 4 〕。 目前 , 对山蓑若的研究主要集中
于对其药效有效成分的分析 、药理作用 、临床应用及
栽培技术等方面[’ 一 6 〕。 国外有关山蓑若的研究也有
相继的报道 , 对山蓑若植物体内的生物碱和类黄酮
也进行了测定〔7〕。 采用组织培养技术 , 通过器官培
养分化芽的途径进行组织培养快速繁殖研究 , 这对
山蓑若优质种苗繁育可能有一定的潜在应用价值 。
有关山蓑蓉组织培养快速繁殖形成再生植株尚未见
报道 。
基金项目:国家中西部重点项 目(20 1BA 90 1A 47 )
作者简介:徐文华( 1974 一 ) , 女 , 硕士 , 助理研究员 , 从事植物组织培养和青藏高原药用植物资源培育方 面的研究;E 一 m ail : w hx u0 2 @
1 6 3
.
e o m
,
Te
l
:
(
0 9 7 1
)
6 1 5 9 6 3 0 1 3 8 9 7 2 2 1 7 2 9
通讯作者 :陈桂深 , E 一 m ail : gc c h 即@ nw ipb · ac · cn
生物技术通报 B to te ch noto gy 200 8 年增刊
1 材料与方法
1.1 材料
山蓖若(AnisoduS tan君“tic 。 ( M ax im
. ) Pa seher) ,
春季(3 月份)取大田栽培两年生植株上的幼芽(也
称休眠芽)为初始培养材料 。
1
.
2 方法
1.2 .1 无菌芽的获得 春季(3 月份) , 取大田栽培
两年生植株的幼芽为初始培养材料 。 流水冲洗干净
后在超净工作台上 ,将芽用 0.2% 的氯化汞 (H gCI :)
溶液消毒5 一 s m in , 无菌水冲洗 4 一 6 次后接种到已
备好的启动培养基上 。 暗培养一周后 , 转人光照下
培养 。
2
.
2
2
.
2
生长条件
培养基 以 M S 为基本培养基 , 附加不同
质量浓度的激素 , 蔗糖 3飞.L 一 ’ , 琼脂粉 6.09 · L 一 ’ ,
p H
二 5
.
8 。 启动培养基 :¹ :M S + 6 一 B A I . 0 一 2 . 0( 单
位:m g · L 一 ’ , 下 同) 十 IA AO . 2 一 0 . 5; º : M s +
N A A I
.
0 + 6 一 B A 2
.
0 + Z T3
.
0
。 前期分化培养基 :
» :M s + N AA I.0 + 6 一 B A 3 . o + z 竹 .0 ;后期芽增殖培
养基:¼ :M S + N A A I.0 + 6 一B A 3 . O 。 生根培养基 :
½ :M S( l/ZM S ) + N A AO .5 一 1 . 0 + 蔗糖 1.5 一 3 .
0 % 。 愈伤组织诱导培养基 :¾ :M S 十 K 叨 一 1 . 0 +
N A A O 一 0
.
5 + 6 一B A O 一 0
.
5 + 2 , 4 一D I
.
0 一 3
.
0 。
1
.
2
.
2
.
2 培养条件 培养温度为(25 士 l) ℃ , 光源为
日光灯 , 光照强度为 1 50 一 Z 0 0 lx , 光照时间为
12h · d 一 l 。
1
.
3 生长与分化情况
1.3 .1 丛生芽的诱导培养 将获得的无菌芽 , 暗培
养一周后 , 转人光照下培养。 3 一 s d 后 , 幼芽开始生
长 , 小叶长大 、舒展 、变绿 , 在启动培养基¹ 上芽生长
缓慢 , 有分化 , 但分化率不高 , 一般每个芽分化出 2
一 3 个不定芽 。 在启动培养基º 上接种一周后 , 芽
有明显的分化迹象 , 基部膨大 、有少量愈伤组织形
成 , 块状愈伤组织上多个芽分化 , 分化速度快 , 分化
率高 , 平均有 3 一 7 个芽 , 形成丛生芽 。
1
.
3
.
2 增殖培养 将丛生芽切割 , 接种到培养基»
上 , 2 周左右即可分化 , 每瓶丛生芽都能分化出大量
的芽 , 芽数明显多于培养基º , 平均芽数 ro 个以上 。
在芽分化趋于稳定 、考虑成本的情况下 , 将丛生芽转
接到培养基¼ 上 , 在继代培养中分化稳定 , 分化率
100% , 平均芽数都在 ro 一 巧 个 。
1
.
3
.
3 根的培养和植株再生 将高约 3 一 sc m 的
芽丛分割成单芽 , 接种于诱根培养基½ 上 ;20 一 2 5d
后 , 根开始形成;35d 后的生根率达 ro o% , 且形成株
高7.0 一 8 . s c m 的再生植株 。
1
.
3
.
4 愈伤组织诱导和继代培养 从大田取山蓑
若带叶柄幼叶用流水冲洗3遍后 , 用 0.2% 的 HgC1 2
溶液消毒4.sm in , 无菌水冲洗 4 一 5 次后接种到备
好的培养基¾ 中进行愈伤组织诱导 。 接种后先进行
一周左右的暗培养后再放置于光照条件下培养 。
2 结果与分析
2.1 不 同激素配比培养基上芽分化的比较
将灭好菌的幼芽接种于激素 6 一B A 和 IAA 不同
配比的四种培养基上 , 接种 巧d 后统计观察表明
(表 1) ,休眠芽在编号为 Fl 一 F4 的4 种培养基上芽
生长缓慢 , 有分化 , 但分化率明显不高 , 一般每个芽
分化出 2 一 3 个不定芽(图 1.a) , 分化率都没有超过
30% 。 一般认为 , 细胞分裂素和生长素比值高有利
于芽的分化 , 但不同的生长素和分裂素种类同样也
影响芽的分化 。 激素 6 一B A 有利于促进芽的分化 ,
从我们的实验结果看出 , 在 6 一 B AI . 0 一 2 . 0 m g · L 一 ’
的条件下芽都有分化能力 ,但分化率不高 , 分析原因
可能跟选择的生长素的种类 IA A 有关。
表 1 6 一 B A 和 认A 不同组合对芽分化的影响
培养基编号 激素L 一 1 ) 外植体数
分化率
(% )
死亡率
(% )
6 一B A I A A
2 5
.
8
2 1
.
4
,‘6J‘l了n一”6
l0
2
.
0 0
.
2
Fl尺邪
F4 2.0 0.5 72 18.1 72 .2
将初期分化的不定芽切割后接种于 N AA 、 6 -
B A

Z T ( 玉米素)3 种激素不 同配 比的 4 种培养基
上 , 编号为 F5 、 F6 、户 和 F8 。 接种一周后芽有明显
的生长 、分化迹象 , 芽基部膨大 、变疏松 , 有少量的愈
伤组织形成 , 块状组织上多个芽分化(图 1.b ) , 分化
速度快 , 分化率高 , 平均有 3 一 7 个芽 , 形成从生芽 。
接种 30 d 后统计结果如下 (表 2 ) 。
年增刊 徐文华等:藏药山蓑若组织培养技术研究 23 1
将丛生芽切割 , 转接到加大了激素 6 一B A 量的
培养基上 , 芽生长速度快 , 生长健壮 , 2 周左右每瓶
丛生芽即可分化出大量的芽(图 1.C) , 芽数明显增
多 , 平均芽数 10 个以上 。 在芽分化趋于稳定 、考虑
成本的情况下 , 将丛生芽转接到没有添加玉米素
(zT) 的培养基上 , 在继代培养中分化稳定 , 分化率
100% , 平均芽数在 10 一 1 5 个 。
表2 6 一 B A 、 N A A 、 Z T 不同组合对芽分化的影响
〕b b le 2 E fe ets of 6 一 B A , N A A a n d ZT d i fe re n t e o n e e n t r a t i o n o n di fe re n t i a r i o n rat e s o f b u d
培养基编号 激素(mg · L 一 ’) 外植体数 分化率(% ) 平均分化芽数/个
o10
l0
3.2
5.6
zT50住N A A 6 L一 B A
FS 0 2
.
0
F6 0
.
5 2
.
0
0 2
.
0
FS 1
.
0 2
.
0 3
.
0 1 0 1 (X) 7
.
2
2
.
2 再生苗的生根培养
山蓑若组培再生苗多为丛生芽 , 将继代增殖形
成的高约3 一 sc m 的健壮无根苗切割成单芽 , 接种
于编号为G l 、 G2 、 G 3 、 G4 、 G S 的生根诱导培养基上 ,
2 0
一 25 d 后 , 根开始形成;35 d 后的最高生根率达
100% , 且形成株高7.0 一 8 . sc m 的再生小植株(图
d ) 。
再生苗在不同基本培养基 、不同激素和蔗糖浓
度的诱根培养基中 , 其生根时间 、数量不同。
表3 不同激素和蔗糖浓度对试管苗生根的影响
培养基编号 起始长根时间
mg · L
蔗糖
(% ) 接种芽数
第 35 d时生根率
(% ) 平均每个苗长根数
GI 1.0 3 , 0 1 0 第 15d 56 .8 3.0
1.0
0 .5
l0
l0
第 07d
第 1ld
1o
76.9
G23
G4 0.5 3.0 10 第 10d 80.3 5.0
GS 1.0 1.5 10 第 09d 94.6 5.2
注 :G I 为 M S 基本培养基 ;G2 、 C 3 、 G4 、 G5 为 l/2 M S 培养基 ;附加不同浓度的激素(NAA )和蔗糖 , 见表3 , p H = 5 . 8
实验结果 (表 3) 表明:虽然各组合均可诱导生
根 , 但诱根率、诱根时间 、数 目明显不同。 基本培养
基 M S 和 1/ZM S 相比较 , 起始长根时间 1/2 M S 的要
比 M S 的早约一周 , 且从生根率上也可以看出 M S培
养基上生根率比 1/2 M S 培养基上的要低 , M S 上 的
诱导率为 56 .8% 、 1 /2 M S 培养基上的最高诱导率达
到 10 0% , 所以可 以确定山蓑若诱根基本培养基选
降低无机盐浓度的 1/ 2M S 效果较佳 。 相同基本培
养基的条件下 , 激素和蔗糖浓度对山蓑若生根有明
显 的影 响 。 在 NA A 浓度 相 同的情况 下 , 3 % 和
1.5% 的蔗糖浓度对生根率有显著影响 , N A AI . o m g
·
L
一 ’条件 下诱 导率 分别 为 10 % 和 94 . 6% ,
N A A O
.
s m g
·
L
一 ’条件下诱导率分别为 80 .3% 和
76.9% , 可以看出高蔗糖浓度条件下根诱导率高于
低蔗糖浓度下的 。 同样在蔗糖浓度一致的情况下 ,
激素 N A A 及其所加的量对山蓑若的生根也有明显
的影响 , 0 . s m g · L 一 ‘和 1.om g · L 一’N A A 浓度下 , 诱
根率不同 , 3 % 蔗糖条件下的诱导率分别为80 .3%
生物杖术通报 召勿te ch n olo gy 200 8 年增刊
a丛生的2一3 个不定芽 h膨大组织分化形成多个芽
芽的增殖及生长 d根的诱导
。幼叶诱导形成愈伤组织
图 1 山蓖著组织培养系列图
和 100% , 1 . 5 % 蔗糖浓度下的诱导率分别为 76 .9%
和 94 .6% , 可 以看出 N AAI .om g · L 一 ’浓度下根的
诱导率都要 比 0.sm g · L 一’浓度下的根诱导率高。
所以在山蓑若组培苗诱根的过程中同时考虑激素和
碳源(蔗糖)的用量是非常必要且很关键的一步 。
影响试管内生根的因素 , 如基本培养基 、蔗糖浓
度 、植物激素、光照 、温度等对诱根培养都是很重要
的 。 大多数诱根培养基都使用低盐浓度的培养基 ,
如 1/ZM S 或 l/ 3M S 培养基 。 降低无机盐浓度 , 有利
于生根 , 而且根多 , 发根也快 。 本实验结果也证明了
这一点 。 虽然生根比较慢 ,但只要根原基一形成 , 根
原基的伸长就很快 , 随继代时间增长生根能力也有
所提高 。
2
.
3 愈伤组织 的诱导和继代培养
本试验初步研究了以山蓑若带叶柄幼叶为外植
体 , 愈伤组织的诱导情况 。 将幼叶切成 0.SCm x 0.
sc m 大小的块 , 接至不同的培养基 (编号为 I、 n 、
1

W ) 上诱导愈伤组织 。 可 以看出 , 幼叶在四种培
养基上均能诱导出愈伤组织 , 但在不同激素配比的
培养基上诱导率有显著的差异 。 在W 培养基上愈伤
年增刊 徐文华等:藏药山蓑若组织培养技术研究 233
组织诱导率最高 , 达到 93 .2% , 而且愈伤组织启动
期为接种后的第 17d , 接种后幼叶膨胀 、 拱起 、长大 ,
逐渐切口 四周有小量颗粒状的突起形成 , 以后在颗
粒状的突起上形成大量的愈伤组织(图 1.e) 。
表 4 不同激素种类和浓度对幼叶愈伤组织诱导的影响
培养基编号 激素 外植体 愈伤组织启动期 第 5 周时诱导率(% ) 长势(m g · L 一 ’ )
2
,
4

D
n†门」勺山内」0 3
,
0
.
0 3
.
0 0 0
0
.
5 0
.
5 1 7
0
.
2 0
.
2 5 9
第 25 天
第 20 天
第 24 天
第 17 天
67 .9
8 1.9 + +
十 十 +
nWnI
注:+ + , 十 十 十分别表示一般和良好
在 I培养基上 , 只有激素 2 , 4 一 D , 且用量为最大
值 3.om g · L 一 ’, 愈伤组织接种后第 25 d 开始启动形
成 , 5 周后的诱导率为62 .0% , 跟其他 3 种培养基相
比 ,其诱导率最低 , 说明 2 , 4 一 D 虽为愈伤组织形成的
诱导剂 ,但其用量过高或单一使用对愈伤组织的诱
导都不是最佳的 。 n 号培养基中附加生长素 KT , 虽
对愈伤组织的启动日期有所提前 , 但诱导率和 I 号
相比 , 没有太大的区别 。 所以进行山蓑若愈伤组织
诱导 , 选择 K T 和 2 , 4 一 D 搭配不是最佳的 。
l 号培养基与W 培养基相比 , 其 2 , 4 一 D 浓度为
W 号培养基的一半 , 增加了细胞分裂素 6 一B A 的量 ,
但诱导率没有 W 号的高 , 1 号培养基诱导率为 81 .
9% , 比W 号培养基低 12.3% ;从生长情况也可以看
出 , 愈伤组织在W 号培养基上生长最好 。 所以可以
说明 , 进行激素种类 、浓度 , 且激素之间的合理配比
是诱导愈伤组织时一定严格考虑的问题 。 在W 号培
养基上进行愈伤组织的继代培养 , 愈伤组织生长良
好 , 呈淡黄色 、结构致密 , 每20 一 2 5 d 转代一次 。
3 讨论
以栽培山蓑若植株上的休眠芽为初始培养外植
体材料 , 建立了山蓑若离体快速繁殖体系 , 成功的获
得了再生植株以及愈伤组织快速增殖体系 。 山蓑若
植株上的休眠芽经诱导可分化出大量丛生芽 , 诱根
培养后能形成正常植株 。 用带叶柄的幼叶可诱导形
成愈伤组织 , 成功的建立 了培养细胞快速繁殖体系 。
在诱导芽分化过程中 , 芽的分化情况跟所加激
素的种类和浓度有着很大的关系 。 植物生长素配合
一定量的细胞分裂素共同影响不定芽的生长 、分化 。
休眠芽在6 一B A 与 IA A 不同组合的四种培养基上生
长缓慢 , 一般每个芽分化出 2 一 3 个不定芽 , 分化率
没有超过 30 % 。 一般认为 , 细胞分裂素和生长素比
值高有利于芽的分化 , 但不同的生长素和分裂素种
类同样也影响芽的分化 。 激素 6一 B A 有利于促进芽
的分化 , 从我们的实验结果看出 , 在 6 一 B AI . 0 一 2 .
o m g
·
L
一 ’的条件下芽都有分化能力 , 但分化率不
高 , 原因可能跟选择的生长素的种类 IA A 有关 。 将
不定芽切割后接种于 N A A 、 6 一 B A 和 ZT (玉米素)3
种激素不同组合的四种培养基上 , 芽生长速度快 , 分
化率高 , 都达 10 % , 平均能分化出 3 一 7 个芽 , 在继
代培养过程中形成大量丛生芽 。 在诱导根分化过程
中 , 不同基本培养基 、不同激素和蔗糖浓度对山蓑若
再生苗生根有显著影响 。 1/ 2 M S 培养基比 M S 培养
基更适宜山蓑若诱根 。 在 1/2 M S 培养基 中附加
NA AI .om g · L 一 ’和 3.0% 的蔗糖条件下 , 起始长根
时间为最早 , 第7d时有白色根原基形成 、突起 ;平均
每个苗长 5.5 个根 , 且 35 d 后的生根率为 10 % 。
在 N A A 和蔗糖浓度都减半下生根率都不及 1.om g
·
L
一 ’和 3.0 % 时高 。 研究发现 , 愈伤组织在不同激
素组合的培养基上诱导率有明显的不同 , M S 附加
N A胡.Zmg · L 一 l , 6 一 B A o . Z m g · L 一 l , 2 , 4 一D 2 . o m g ·
L
一 ’的培养基中出愈率为最高 , 93 . 2 % , 且愈伤组织
启动期为最早 , 为接种后后的第 17 d 。 而且通过本
实验还说明 , 2 , 4 一D 虽为愈伤组织形成的诱导剂 , 但
其用量过高或单一使用对愈伤组织的诱导都不是最
生物杖术通银 B io te chn oto gy B “le 血 2008 年增刊
佳的 。 所以可以说明 , 进行激素种类 、浓度 , 且激素
之间的合理配比是诱导愈伤组织时一定严格考虑的
问题 。 在W 号培养基上进行愈伤组织的继代培养 ,
愈伤组织生长良好 , 呈淡黄色 、结构致密 。
高等植物 ,尤其是药用植物的组织培养 , 越来越
引起人们的关注 。 山蓑若也是常用中药材 , 但它的
药用根部属多年生 , 生长缓慢 , 用组织培养方法可以
改善其生产状况 。 查阅文献 , 对山蓑若的研究主要
集中于对其有效药效成分的分析、药理作用 、临床应
用及栽培技术等方面 。 采用组织培养技术 , 通过器
官培养分化芽的途径进行快速繁殖 , 对山蓑若优质
种苗繁育可能有一定的潜在应用价值。 目前已经得
到了山蓑若的愈伤组织 , 其药用有效成分的分析和
细胞的悬浮培养 , 还有待于进一步研究 。
参 考 文 献
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1 9 9 1
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1 4 2
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( 上接第228 页)
该区域植物对于元素的吸收能力大小顺序是 :
N a 、 S r 、 K 、 Z n 、 M g 、 N i 、 P b 、 C u 、 M n 、 C a 、 Li 、 C o 、 C d 、 F e
和 Cr, 植物对于 N a 富集系数达到13.228 ,其富集能
力明显大于其余 14 种元素;其次为 Sr 、 K 和 Zn 富集
系数介于 1 一 ro 之间 , 其余均小于 1.0 。
参 考 文 献
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