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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
肉葡萄球菌 tat-gfp融合基因的构建与表达
于长燕1 郑秀2 朱燕2 孟庆艳1 王梦晓1 高强1
(1天津科技大学生物工程学院 工业微生物教育部暨天津市重点实验室，天津 300457;2天津科技大学后勤服务集团，天津 300457)
摘 要: 将 PCR扩增的肉葡萄球菌铁离子过氧化物酶基因(fepB)的双精氨酸转运(Tat)信号肽 DNA 序列与绿色荧光
蛋白基因(gfp)亚克隆到 pCX9 质粒中构建可表达的 tat-gfp融合基因，再将形成的 pCX19-Tat-GFP质粒电转化转入肉葡萄球菌
宿主中。提取阳性克隆子质粒进行酶切验证，表明表达载体 pCX19-Tat-GFP成功地构建并转化。用木糖诱导重组菌株后，分
别使用荧光显微镜和 SDS-PAGE检测外源 GFP蛋白的表达分泌情况。结果显示，菌体能够发出绿色的荧光，且蛋白电泳能够
在细胞质与细胞壁组分中检测到 GFP蛋白条带，表明肉葡萄球菌宿主可以将表达载体 pCX19-Tat-GFP 表达的 GFP 在细胞质
中正确折叠，并以活性形式转运到细胞壁部分。
关键词: 肉葡萄球菌 双精氨酸转运(Tat) 信号肽 融合基因 绿色荧光蛋白(GFP) 质粒
Construction of tat-gfp Fusion Gene and Its
Expression in Staphylococcus carnosus
Yu Changyan1 Zheng Xiu2 Zhu Yan2 Meng Qingyan1 Wang Mengxiao1 Gao Qiang1
(1Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry Education ＆ Tianjin City，College of Biotechnology，
Tianjin University of Science ＆ Technology，Tianjin 300457;2Logistic Service Group，Tianjin University of Science ＆ Technology，Tianjin 300457)
Abstract: PCR-amplified fepB-tat fragment of Staphylococcus carnosus TM300 and green fluorescent protein (gfp)gene were sub-
cloned into plasmid pCX19 to generate the expressible tat-gfp fusion gene，and the resulting plasmid pCX19-Tat-GFP was transformed
into S． carnosus TM300 host by electroporation． The positive clones were identified by double restriction enzyme digestion． By xylose in-
duction，the target protein was observed active in vivo by fluorescence microscopy and also detectable in protoplast and cell wall fractions
of S． carnosus TM300 host by SDS-PAGE，but not in the culture broth． The results suggested that Tat-GFP fusion protein produced by
this recombinant was folded correctly in cytoplasm and actively translocated in cell wall，but not released extracellularly．
Key words: Staphylococcus carnosus Twin-arginine-translocation (Tat) Signal peptide Fusion gene Green fluorescent pro-
tein (GFP) Plasmid
收稿日期:2011-01-24
基金项目:国家“973”项目(2007CB714305，2011CB707401) ，科技部国际合作计划项目(2007DFB31620) ，天津市自然科学基金重点项目
(08JCZDJC15100)
作者简介:于长燕，女，硕士研究生，研究方向:微生物与生化药学;E-mail:ych-588@ 163． com
通讯作者:高强，男，教授，研究方向:微生物遗传育种;E-mail:gaoqiang@ tust． edu． cn
国内外研究人员从发酵火腿与香肠中分离出了
多种葡萄球菌，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)
就是其中主要的菌株之一［1］。肉葡萄球菌与金黄
色葡萄球菌等其他葡萄球菌相比，不产生任何毒素、
溶血素、凝固酶或聚集因子，是葡萄球菌属中被完全
确认的食品级 GRAS(generally regarded as safe)菌
株［2］，该属中其他菌株则均为致病菌或条件致病
菌。因肉葡萄球菌在肉制品的风味形成过程中起关
键性的作用，所以目前该菌主要应用于肉制品发酵
行业，是发酵香肠的主要初始发酵剂的商业菌
种［3］。肉葡萄球菌的胞外蛋白水解活性很低，因此
该菌株可以用作优良的基因克隆宿主菌［4］。20 世
纪 80 年代后，肉葡萄球菌在其外源基因转化系统和
克隆用载体方面已有较大的发展，肉葡萄球菌作为
选择性克隆宿主菌，不仅在分子遗传学方面用来研
究葡萄球菌属相关代谢途径，而且还能用于产生和
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
分泌异源蛋白。
多数在细胞质内合成的蛋白质被从细胞质传递
到细胞膜、周质空间或胞外，这种蛋白质被称为分泌
型蛋白质。分泌型蛋白质的共有特征是在 N-末端
连有一段信号肽，根据其信号肽的结构，可以将其分
为分泌型(Sec)信号肽、双精氨酸转运(Tat)信号肽
和脂蛋白(Lip)信号肽等［5］。Sec 信号肽转运的蛋
白前体在转移之前并不发生折叠，而 Tat信号肽则
是转运折叠后的蛋白质［6，7］。目前微生物外源基
因表达及分泌常用的 Sec 系统往往存在宿主菌局
限性和表达分泌缺陷性，即宿主菌种类少，产物易
形成包涵体、不能正确折叠及只能分泌到周质空
间等处。此外，并非所有的蛋白都适合用 Sec 系统
分泌，而 Tat信号肽的分泌特性能够有效地解决这
些缺陷。
绿色荧光蛋白(GFP)是一种广泛使用的报告
蛋白，在宿主细胞中可被蓝色光线稳定地激发出
绿色荧光。本研究使用 GFP 作为报告蛋白，构建
了 S． carnosus宿主中表达 tat-gfp 融合基因的载体，
为进一步研究其他外源蛋白在肉葡萄球菌中通过
Tat转运系统正确分泌奠定了试验基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1． 1． 1 菌株与质粒 宿主菌 S． carnosus TM300 菌
株、无启动子的大肠杆菌 － 肉葡萄球菌穿梭质粒
pBT2(Cmr、Ampr)与木糖诱导的 pCX19 质粒(Cmr)
均由德国图宾根大学馈赠［8］。E． coli DH5α 本实验
室保存。
1． 1． 2 主要试与剂与仪器 Taq DNA聚合酶、1 kb
DNA Marker 和 DNA Marker Ⅲ购于天根生化科技
(北京)有限公司;T4 DNA 连接酶、限制性内切酶
EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ、NdeⅠ和低分子量
蛋白质 Marker购自 TaKaRa公司。引物由北京华大
基因公司合成。
Bio-Rad Molecular Imager ChemiDocTM XRS +
Imaging System 凝胶成像系统，Eppendorf Mastercy-
cler PCR 仪，NIKON ECLIPSE TE2000-U 荧光显
微镜。
1． 2 方法
1． 2． 1 FepB-tat 信号肽的扩增与 pBT2-Tat 载体的
构建 根据 S． carnosus TM300 基因组中铁离子过氧
化物酶 fepB 基因(GenBank 登录号为 AM295250)
Tat信号肽序列的上游以及下游延伸 15 个氨基酸的
位置设计引物。上游引物 5-TACATTGGATCCTAG-
GAGGTGACGATATGACACAAGACAAGC-3(下划线
部分为 BamH I 酶切位点) ;下游引物 5-TCTCCTA-
AGCTTATCAAACATCGACTTGAAAGAAAAAATGCC-
3(下划线部分为 Hind Ⅲ酶切位点) ;使用玻璃微珠
法［9］提取肉葡萄球菌的基因组为模板，进行 PCR反
应扩增片段。片段经纯化回收后，与 pBT2 质粒同
时使用 BamH I和 Hind Ⅲ双酶切，回收相应大小的
DNA片段，使用 T4连接酶在 16℃过夜连接。使用
CaCl2法转化进入 E． coli DH5α，提取转化子的质粒，
进行双酶切验证。
1． 2． 2 gfp 基因的扩增与 pBT2-Tat-GFP 载体的构
建 根据已报道的 gfp基因序列，设计相关引物扩增
gfp基因。上游引物:5-CAAGTCGACAAGCTTAGTA-
AAGGAGAAGAACTTTTCACTG-3(单、双下划线部
分分别为 Sal I、Hind Ⅲ酶切位点) ;下游引物为:5-
GGCGCTAGCGAATTCTTATTTGTATAGTTCATCCAT-
3(单、双下划线部分分别为 Nhe I、EcoR I 酶切位
点)。以含 gfp 基因的核酸分子为模板，进行 PCR
扩增获得大小为 738 bp 的 GFP 的开放阅读框架
(orf)片段，再经纯化回收后，与 pBT2-Tat 质粒同时
使用 Sal I和 Nhe I双酶切，回收相应大小的 DNA片
段，T4连接酶 16℃过夜连接。使用 CaCl2法转化进
入 E． coli DH5α 宿主中，提取转化子质粒，并进行双
酶切验证及测序验证。
1． 2． 3 pCX19-Tat-GFP 质粒的构建 同时将质粒
pBT2-Tat-GFP和 pCX19 使用 BamH I 和 EcoR I 进
行双酶切，1%的琼脂糖凝胶电泳回收相应的片段，
并纯化回收。使用 T4连接酶 16℃连接过夜。参照
Lfblom等［10］的方法将连接产物电转化进入肉葡萄
球菌。对转化子质粒进行酶切验证。
1． 2． 4 GFP的诱导表达 分别接种阳性重组菌株
S． carnosus TM300 /pCX19-Tat-GFP、阴性对照菌株
S． carnosus TM300 和 S． carnosus TM300 /pCX19 于 5
mL LB液体培养基中，37℃、150 r /min 过夜培养;转
接 0． 5 mL 过夜培养物于 50 mL LB 液体培养基中，
37℃、150 r /min培养;培养 4 h 后，分别在以上菌株
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2011 年第 8 期 于长燕等:肉葡萄球菌 tat-gfp融合基因的构建与表达
的培养基中加入诱导剂木糖至终浓度 5 mg /mL，
35℃、150 r /min继续培养 12 h，诱导绿色荧光蛋白
基因的表达，诱导产物的分子量应为 27 kD。
1． 2． 5 表达产物绿色荧光蛋白的检测
1． 2． 5． 1 荧光显微镜观察 将 1． 2． 4 中培养的菌
液，各取 2 μL滴在载玻片并盖好盖玻片后，置于荧
光显微镜下观察各个菌液的产荧光情况。
1． 2． 5． 2 SDS-PAGE 分析 根据 Meissner 等［11］的
方法，分别提取阳性重组菌株与阴性对照菌株细胞
壁、原生质体和发酵液中的蛋白组分，使用 5%的浓
缩胶和 12%的分离胶进行 SDS-PAGE检测。
2 结果
2． 1 pBT2-Tat载体构建的验证
使用 BamH I和 Hind Ⅲ双酶切已构建的 pBT2-
Tat载体，应得到 6 970 bp和 146 bp的片段，本试验
结果与预期一致，说明 Tat 信号肽成功地克隆到
pBT2 载体中(图 1)。
M1． 1 kb DNA Marker;1． pBT2-Tat /BamH I + Hind Ⅲ;
M2． DNA Marker Ⅲ
图 1 重组质粒 pBT2-Tat的 BamH I和
Hind Ⅲ双酶切鉴定
2． 2 pBT2-Tat-GFP载体的验证
随机挑取转化子进行培养并提取质粒，对重组
质粒 pBT2-Tat-GFP 进行 BamH I 和 EcoR I 双酶切
验证，应释放出 6 970 bp 和包含 Tat 和 GFP 的 860
bp片段。图 2 显示的试验结果与预期一致，说明重
组质粒 pBT2-Tat-GFP构建成功，DNA测序结果也表
明 gfp基因已被正确的克隆(数据未显示)。
M． DNA Marker Ⅲ;1． pBT2-Tat-GFP /BamH I + EcoR I
图 2 重组质粒 pBT2-Tat-GFP的 BamH I和
EcoR I双酶切鉴定
2． 3 pCX19-Tat-GFP质粒的构建
从重组质粒 pBT2-Tat-GFP获得的融合基因 tat-
gfp片段，通过酶切位点 BamH I 和 EcoR I 导入
pCX19 质粒中构建重组质粒 pCX19-Tat-GFP。重组
子质粒的双酶切验证预期会出现 4 134 bp和 860 bp
的条带，图 3 所示的试验结果证明重组质粒 pCX19-
Tat-GFP 构建成功。pCX19-Tat-GFP 质粒示意图如
图 4 所示。
M． 1 kb DNA Marker;1． pCX19-Tat-GFP /BamH I + EcoR I
图 3 重组质粒 pCX19-Tat-GFP的 BamH I和
EcoR I双酶切鉴定
2． 4 荧光显微镜观察
使用 Nikon ECLIPSE TE2000-U 荧光显微镜观
察木糖诱导的菌液，结果(图 5)显示，构建成功的重
组菌株能发出绿色荧光，而对照菌株均无绿色荧光，
说明构建成功的载体中 GFP能够表达并正确折叠，
是具有活性的蛋白质。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
图 4 pCX19-Tat-GFP质粒的示意图
A． S． carnosus TM300 /pCX19;B． S． carnosus TM300 /pCX19-
Tat-GFP
图 5 荧光显微镜观察结果
2． 5 SDS-PAGE结果
分别提取转化子和对照菌株的细胞壁部分和原
生质体部分的蛋白质，进行蛋白电泳分析(图 6) ，同
时也对其发酵液部分进行了蛋白电泳分析(图 7)。
M．蛋白质 Marker;1． S． carnosus TM300 细胞壁;2． S． car-
nosus TM300 /pCX19 细胞壁;3，4． S． carnosus TM300 /pCX19-
Tat-GFP细胞壁;5． S． carnosus TM300 原生质体;6． S． carno-
sus TM300 /pCX19原生质体;7，8． S． carnosus TM300 /pCX19-
Tat-GFP原生质体
图 6 各转化子细胞壁和原生质体中
蛋白质的 SDS-PAGE分析
图 6 和图 7 表明，在 S． carnosus TM300 宿主细
胞壁和原生质体部分均能检测到目的蛋白，但在发
酵液中尚未检测到目的蛋白。说明 GFP 在宿主细
胞质中成功表达并正确折叠后，被转运并滞留在细
胞壁中，但未能分泌到发酵液中。
M．蛋白质 Marker;1． S． carnosus TM300;2． S． carnosus
TM300 /pCX19;3，4． S． carnosus TM300 /pCX19-Tat-GFP
图 7 各转化子发酵液中蛋白质的 SDS-PAGE分析
3 讨论
分泌型质粒可以不经宿主细胞破壁而直接将外
源蛋白分泌到宿主细胞外，因此，在外源蛋白的分泌
表达与表面展示以及口服活体疫苗研究开发等领域
得到了较为广泛的应用。Sec 型分泌系统是原核与
真核生物分泌胞外蛋白的主要途径，虽然 Staphylo-
coccus carnosus 的 Sec 型分泌系统已经得到较为广
泛的研究，但因该系统需要在 Sec 信号肽与目的蛋
白之间插入一个来自 Staphylococcus hyicus脂肪酶的
前肽(pro-peptide)才能实现分泌过程［10］，而且分泌
后的前肽部分无法被剪除，仍保留在目的蛋白的 N-
末端，因此 S． carnosus 现有的 Sec 型分泌系统的应
用受到了极大的限制。
近年发现的双精氨酸转运 Tat 系统由于能够高
效转运处于折叠状态的蛋白质底物，从而成为国际
上蛋白质转运研究的一个热点前沿。在与 S． carno-
sus相关的研究中，Meissner等［11］利用 E． coli的三甲
胺基-N-氧化物还原酶(trimethylamine N-oxide reduc-
tase，TorA)的 Tat信号肽和 GFP的 N-末端精确连接
并置入相应的 E． coli 穿梭质粒载体后，分别导入革
兰氏阳性的 S． carnosus、Bacillus subtilis和 Corynebac-
terium glutamicum 宿主细胞中，发现 GFP 均可全部
被 TorA 的 Tat 信号肽转运出细胞膜外，但对于 S．
carnosus，没有荧光活性的 GFP 全部滞留在细胞壁
中;对于 B． subtilis，GFP则全部被转运至胞外上清液
中，但同样没有荧光活性;只有 C． glutamicum 宿主
中的活性 GFP被全部有效地转运至胞外上清液中，
说明 E． coli的 TorA的 Tat信号肽可以高效地将折叠
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2011 年第 8 期 于长燕等:肉葡萄球菌 tat-gfp融合基因的构建与表达
的 GFP模式蛋白转运出以上 3 株革兰氏阳性菌宿
主细胞外，但折叠正确与否则取决于宿主，而且这 3
种宿主也均含有与 E． coli 类似的 Tat 转运酶;张明
等［1 2］也证实与 E． coli的 TorA的 Tat 信号肽融合的
GFP模式蛋白在 Tat 转运酶的作用下，可以正确的
折叠方式被传输至大肠杆菌宿主细胞的周质空间;
Biswas等［1 3］将 S． carnosus TM300 基因组中 fepB 基
因的 Tat信号肽分别与 Staphylococcus hyicus 脂肪酶
原与 A蛋白结合后，成功地将脂肪酶原与 A蛋白分
泌到培养基中，但转运过程仍需要脂肪酶前肽的
参与。
本研究将 S． carnosus TM300 基因组中 fepB 基
因的 Tat信号肽与 gfp基因在大肠杆菌 －肉葡萄球
菌穿梭质粒 pBT2 中构建出 tat-gfp 融合基因，再将
tat-gfp融合基因与表达载体 pCX19 连接后电转化
进入肉葡萄球菌，获得了能够在细胞质中正确折
叠的活性 GFP，并成功地以活性形式转运到细胞
壁中。虽然 GFP 目前尚未成功分泌到发酵液中，
但是与之前的国际研究相比，取得了很大的进展，
并为进一步实现目的蛋白成功分泌到细胞壁外，
乃至相关的系统生物学与合成生物学等研究奠定
了试验基础。
致谢:诚挚感谢德国图宾根大学(Eberhard-Karls-Univer-
sitaet，Tuebingen，Germany)的 Friedrich Gtz 教授为本研究提
供 S． carnosus TM300 菌株及 pBT2 与 pCX19 质粒。
参 考 文 献
［1］Schleifer KH，Fischer U． Description of a new species of the genus
Staphylococcus:Staphylococcus carnosus． International Journal of Sys
tematic and Evolutionary Microbiology，1982，32(2) :153-156．
［2］李宗军，江汉湖，李罗明．侗族传统发酵肉的微生物特性．中国微
生态学杂志，2002，14(1) :19-22．
［3］Papamanoli E，Kotzekidou P． Characterization of Micrococcaceae iso-
lated from dry fermented sausage． Food Microbiology，2002，19(5) :
441-449．
［4］Gtz F． Staphylococcus carnosus:a new host organism for gene clo-
ning and protein production． Journal of Applied Microbiology，1990，
69(S19) :49-53．
［5］王玠，王正祥．地衣芽孢杆菌 DSM13 分泌蛋白信号肽分析．天然
产物研究与开发，2007，19(3) :383-389．
［6］ Berks BC． A common export pathway for proteins binding complex
redox cofactors． Molecular Microbiology，1996，22(3) :393-404．
［7］Cristóbal S，de Gier JW，Nielsen H，et al． Competition between Sec-
and Tat-dependent protein translocation in Escherichia coli． The EM-
BO Journal，1999，18(11) :2982 -2990．
［8］Cramton SE，Gerke C，Gtz F． In vitro methods to study staphylococ-
cal biolilm formation． Methods in Enzymology，2001，336:239-255．
［9］赵文怡，高强，谯娜娜，等． 玻璃微珠法提取葡萄球菌基因组
DNA的研究．现代食品科技，2010，26(2) :154-156，202．
［10］Lfblom J，Ronqvist N，Uhlén M，et al． Optimization of electropora-
tion-mediated transformation:Staphylococcus carnosus as model or-
ganism． Journal of Applied Microbiology，2006，102(3) :736-747．
［11］Meissner D，Vollstedt A，Van Dijl JM，et al． Comparative analysis of
twin-arginine (Tat)-dependent protein secretion of a heterologous
model protein (GFP)in three different Gram-positive bacteria． Ap-
plied Microbiology and Biotechnology，2007，76(3) :633-642．
［12］张明，潘仁瑞，余增亮，等．利用荧光蛋白对大肠杆菌蛋白质 Tat
转运系统的研究． 生物化学与生物物理学报，2003，35(8) :
702-706．
［13］Biswas L，Biswas R，Nerz C，et al． Role of the twin-arginine translo-
cation pathway in Staphylococcus． Journal of Bacteriology，2009，191
(19) :5921-5929．
(责任编辑 狄艳红)
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