全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
弓形虫膜表面抗原 SAG2蛋白的高效表达及免疫活性分析
聂福旭 1 蒋蔚 2 王权 2 陈永军2 胡永浩1
( 1甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070; 2中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241 )
摘 要: 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫膜表面抗原 SAG2蛋白, 并对其免疫活性进行分析。应用 PCR技
术从刚地弓形虫 RH株的基因组 DNA中扩增编码 SAG2的基因片段,亚克隆至原核表达载体 pET32a( + ), 在大肠埃希菌 (E.
co li) BL21内表达, 并对其表达条件进行优化, W estern b lo tting和 ELISA分析纯化蛋白的免疫原性; 纯化的重组蛋白免疫小鼠
制备多抗, 用间接免疫荧光试验 ( IFA )分析表达蛋白的免疫反应性。成功构建重组质粒 pET32a( + ) tSAG2, 所表达的融合蛋
白大小约为 38 kD。在 IPTG终浓度为 0. 1 mm o l/L、诱导时间 4– 6 h和培养温度 32 条件下,重组 SAG2蛋白主要以可溶性
形式在大肠杆菌中高效表达,每升培养菌液约获得可溶性重组 SAG2蛋白 16 m g。W estern blotting及 ELISA结果显示纯化蛋
白具有良好的免疫原性。 IFA显示重组蛋白的抗血清能够识别刚地弓形虫表面的 SAG2天然蛋白 ,所表达蛋白具有良好的免
疫反应性。截断的 SAG2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白保持了天然蛋白的免疫活性, 为进一步利用该重组蛋
白进行弓形虫病免疫诊断及基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础。
关键词: 刚地弓形虫 SAG2 蛋白表达 免疫活性
Expression and Immunological Activity Analysis on the Surface Protein
SAG2 from Toxop lasma Gondii Strain RH
N ie Fuxu
1 J iangW ei2 W ang Quan2 Chen Yongjun2 Hu Yonghao1
(
1
Co llege of VeterinaryM edicine, Gansu Agr icultural University, Lanzhou 730030;
2
Shanghai Veterinary Research Institute, Shanghai 200241)
Abstrac:t Express the truncated sur face antigen SAG2 ofT oxop lasm a Gondii(T. gond ii) in E. coli and analyze the imm unolog ica l
activ ity of the expressed prote in SAG2. The truncated SAG2 gene fragm ent w ere am plified by PCR from the to ta lDNA ofT. gond ii and
subcloned into a prokaryo tic express ion vector pET32a( + ). A fter identification by restriction enzym es, the expression o f the recomb i
nant pET32a( + ) tSAG2 was induced by IPTG. A fte r purified by N i2+ affinity chrom atography, the prote in w as used to immunize the
ra t. The imm uno log ica l activ ity o f the purified SAG2 was ana ly sed by W estern blotting, EL ISA and IFA ana lysis. The recomb inant
pET32a( + ) tSAG2 w as successfu lly constructed and transfo rm ed intoE. co li BL21( DE3), and the recomb inan t prote in w as high ly ex
pressed in E. coli in conditions of 32 , 0. 1 mmo l/L IPTG and 4- 6 h. About 16 mg solub le recomb inan t prote in can be obta ined every
litre cu ltivation. SDSPAGE andW estern b lo tting analysis showed that the targe t recom binant prote in w ith the mo lecu la r we ight of 38
kD. It cou ld be spec ifica lly recogn ized by serum aga instT. gondii from goa t byW este rn b lo tting and EL ISA. IFA ana ly sis show tha t the
antiserum of SAG2 can recogn ized the nature prote in SAG2 localized in the m embrane surface o fT. gond ii . T rucated SAG2 fragm ent
w as h ighly expressed in E. coli, purified SAG2 m a inta in the immune activ ity of na tura l prote in, wh ich can be used for the further re
search on immun ity de tection and the genetic eng ineer ing subun it vaccine forT. gond ii.
Key words: T oxop lasm a gondii SAG2 Expression Immuno log ical activ ity
收稿日期: 20100201
基金项目:农业公益性行业科研专项经费项目 ( 200803017)
作者简介:聂福旭,男,硕士研究生,研究方向:传染病与病源分子生物学; Em ai:l n iefuxu117@ 163. com
通讯作者:王权, Em ai:l w q1 cn@ yahoo. com. cn
刚地弓形虫 (Toxop lasma gondii )是一种专性细
胞内寄生的原虫,呈世界性分布,能引起人兽共患的
弓形虫病。弓形虫感染可导致孕妇流产、死胎、畸胎
和弱智儿, 能引起免疫功能缺陷或低下病人, 如
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
A IDS病患者、器官移植患者、肿瘤患者等死亡; 弓形
虫病也可导致动物流产、弱胎、死胎、生长受阻及死
亡,给畜牧业造成巨大经济损失 [ 1]。因此, 弓形虫
感染的防治日益受到重视。
刚地弓形虫速殖子表膜是宿主免疫系统识别并
杀伤虫体的主要部位, SAG2是弓形虫速殖子表膜
的重要抗原之一, 有高度的免疫原性和免疫保护
性 [ 2- 6]。其次, 检测血清中特异抗体所用抗原多为
虫源性粗抗原,其成分复杂,直接影响到诊断的特异
性。因此,本研究对弓形虫膜表面抗原 SAG2基因
进行截断表达,并制备了纯化蛋白的鼠抗血清,为进
一步建立弓形虫血清学诊断方法和进一步研究弓形
虫的入侵机制及弓形虫的疫苗奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 虫种、菌株与质粒
刚地弓形虫 RH株由上海兽医研究所液氮保
种。大肠埃希菌 (E. coli) DH 5、BL21、pET32a( + )
原核表达载体均由本实验室保存。
1. 2 主要试剂
限制性内切酶 BamH I、Sa1 I、T4DNA连接酶、
DNA M arker为日本 TaKaRa公司产品; 2 ! PCR
TaqM ix购自广州东盛生物科技有限公司; 树脂型基
因组 DNA提取试剂盒为上海赛百盛基因技术有限
公司产品;琼脂糖由英国 OXO ID公司提供;琼脂糖
凝胶回收 DNA试剂盒为美国 AXYGEN公司产品;
质粒回收试剂盒为北京博大泰克公司产品; 蛋白质
M arker为美国 Promega公司产品; H is B ind Resin
纯化试剂盒为德国 Novagen公司产品; HRP标记山
羊抗小鼠 IgG (H + L)及 FITC标记山羊抗小鼠 IgG
(H + L)均为上海威奥生物科技有限公司产品。其
余试剂均为国产分析纯。
1. 3 引物设计与合成
根据刚地弓形虫 RH株 SAG2基因的已知序列
( GenBank登录号: FJ825705) , 利用 primer5. 0针对
其开放阅读框 ( ORF)设计引物,预期扩增基因片段
为 449 bp。在上游引物 5∀端引入 BamH I酶切位
点, CAA为保护性碱基;在下游引物 5∀端引入 Sa1 I
酶切位点, CAT为保护性碱基。引物交由上海生物
工程公司合成,引物设计如下:
P1: 5∀CAAGGATCCTCCACCACCGAGACG3∀
P2: 5∀CATGTCGACGAGCCCGTGAGAGACAC3∀
1. 4 弓形虫速殖子的收集、冻干以及 DNA的提取
从液氮中取出保种的弓形虫 RH 株复苏, 腹腔
接种小鼠, 3 d后用 2 mL的灭菌生理盐水冲洗腹
腔, 收集腹腔液, 2 782 ! g离心 15m in, 弃上清液,虫
体用 PBS洗 3次,用上海赛百盛树脂型基因组 DNA
提取试剂盒提取 DNA。
1. 5 SAG2基因的 PCR扩增
以提取的刚地弓形虫 RH株基因组 DNA为模
板进行 PCR扩增。反应体系为 2 !TaqM ix 12. 5( L、
上游引物 1 L、下游引物 1 L、DNA模板 1 L、加
入 ddH2O至 25 L; 反应条件为 94 预变性 5m in,
94 变性 50 s, 62 退火 45 s, 72 延伸 50 s, 共 30
个循环; 最后 72 延伸 10 m in。扩增产物经 1%琼
脂糖凝胶电泳鉴定, PCR产物用琼脂糖凝胶回收试
剂盒回收。
1. 6 重组表达质粒的构建和鉴定
PCR产物和空质粒 pET32a( + )分别用限制性
内切酶 Sa1 I、BamH I双酶切,酶切后用琼脂糖凝胶
回收试剂盒回收。将回收产物用 T4 DNA连接酶进
行连接,转化感受态细胞 E. coli DH5,挑取单个菌
落培养,提取质粒, 酶切鉴定。将阳性克隆送至上海
英俊生物科技有限公司测序。
1. 7 重组质粒在大肠杆菌中的表达和纯化
1. 7. 1 表达产物的 SDSPAGE分析 分别将空质
粒 pET32a( + )和重组表达质粒 pET32a( + ) tSAG2
转化感受态细胞 E. co li BL21( DE3), 将重组质粒接
种于 10 mL含氨苄青霉素 ( Amp)的 LB液体培养
基, 于 37 、220 r/m in振摇培养至吸光度 ( A600值 )
达 0. 4– 0. 6时, 加入终浓度为 1. 0 mmol /L的
IPTG,继续培养 4– 6 h,离心收集菌体,加入蛋白上
样缓冲液,煮沸 8m in左右,进行 SDSPAGE分析。
1. 7. 2 不同 IPTG浓度下表达产物的 SDSPAGE分
析 细菌培养方法同上, A600值达 0. 4 - 0. 6时, 加
入终浓度分别为 0. 1、0. 4、0. 7和 1. 0 mmol /L的
IPTG进行诱导表达, 将收集的菌体超声破菌后, 分
别取上清进行 SDSPAGE蛋白电泳, 确定最佳的
IPTG终浓度。
1. 7. 3 不同诱导温度下表达产物的 SDSPAGE分
析 细菌培养方法同上, 加入 IPTG后, 诱导温度
174
2010年第 4期 聂福旭等:弓形虫膜表面抗原 SAG2蛋白的高效表达及免疫活性分析
分别为 25 、32 、37 进行诱导表达, 分别取上
清进行 SDSPAGE蛋白电泳,确定最佳诱导温度。
1. 7. 4 重组蛋白 SAG2的纯化 用 N ovagen公司
的 H is B ind Resin纯化试剂盒亲和凝胶柱纯化融
合蛋白, 将表达后的菌体, 用 PBS洗涤, 后用 B ind
ing Buffer进行重悬,经超声破碎,收集上清, 经 045
m滤膜过滤后, 按照试剂盒步骤纯化并收集
蛋白。
1. 8 重组 SAG2蛋白的鉴定
W estern blotting检测融合蛋白的免疫原性。以
1#1 000稀释的山羊抗弓形虫 RH株的血清为一抗,
1#8 000稀释的标记辣根过氧化物酶的兔抗山羊血
清为二抗, ECL显色。
ELISA分析融合蛋白的免疫原性。将纯化后的
rSAG2( 200 g /mL)用碳酸盐包被液 1#100、1#200、
1#400、1#800倍比稀释后, 每孔加入 100 L, 4 包
被过夜,后用 PBST洗涤 3次, 用 1%明胶封闭 2 h,
PBST洗涤后将阳性血清及阴性血清分别按 1#50、
1#100、1#200、1#400、1#800进行倍比稀释, 每孔加
入 100 L, 37 孵育 1. 5 h, 用 PBST洗涤 3次。加
入辣根酶标记兔抗山羊 IgG ( 1#6 000) 100 L, 37
孵育 1. 5 h。洗涤后加入 TMB显色液, 显色 8 m in
左右, 用 2M浓硫酸终止反应。测 A450值。
1. 9 rSAG2蛋白的免疫反应性分析
用纯化的 rSAG2 蛋白按照常规方法免疫
BALB /c,制备抗 SAG2蛋白的阳性血清。将小鼠体
内收集的弓形虫速殖子洗涤后涂片, 室温风干 2 h
后,用丙酮进行固定, PBS洗涤后加入 1#400倍稀释
的抗 SAG2多抗血清 40 L, 37 孵育 1. 5 h, PBS洗
涤后加入 1#100倍稀释的 FITC标记的山羊抗小鼠
IgG 40 L, 37 孵育 1. 5 h, PBS洗涤后风干, 通过
荧光显微镜观察。
2 结果
2. 1 SAG2基因的扩增
扩增产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳, 可见单一条
带,其相对分子质量约为 450 bp左右,与预期的扩增
片段相符,空白对照组无特异性扩增条带 (图 1)。
M. DL2 000标准分子量; 1.空白对照; 2. SAG2基因的 PCR扩增产物
图 1 SAG2基因片段扩增结果
2. 2 重组原核表达质粒的双酶切鉴定
重组质粒 pET32a( + ) tSAG2经 BamH I、Sa1 I
双酶切后可见 5 900 bp、450 bp大小的两条带,其大
小与理论预测值相符 (图 2), 表明获得了正确的重
组质粒 pET32a( + ) tSAG2。
M1. DL2 000标准分子量; 1. 重组质粒 pET32 aSAG2经
B amH I和 Sa l I双酶切产物; 2.重组质粒 pET32 aSAG2经
B amH I单酶切产物; M2. DL15 000标准分子量
图 2 pET32a( + )tSAG2重组质粒经限制性
内切酶酶切鉴定
2. 3 测序结果及同源性分析
DNA测序结果表明, 与已发表的 RH 株的
SAG2基因序列 ( GenBank登录号: FJ825705)相比,
其同源性为 99. 8%, 在第 420位碱基由 T∃ C, 该突
变有可能是在 DNA聚合酶扩增时的随机误差造成
的, 它属于同义突变, 所编码的氨基酸不变。经
DNAS tar软件比对, 插入基因片段的核苷酸序列与
刚地弓形虫 NED株 ( GenBank登录号: AF357579 )
核苷酸同源性达到 99. 8%, 与刚地弓形虫 MAS株
( G enB ank登录号: AF357580 )相比较, 核苷酸同源
性达到 97. 7%。
2. 4 重组质粒在大肠杆菌中的表达和纯化
2. 4. 1 表达产物的 SDSPAGE分析 截断 SAG2
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
蛋白的相对分子质量约为 16 kD, 加上 pET32a( + )
空载体表达的蛋白约为 22 kD, 推测融合蛋白为约
为 38 kD。含重组质粒 pET32a( + ) tSAG2的菌液,
经 IPTG诱导后, 其表达产物经 12% SDSPAGE电
泳,可见在约 38 kD处有一较为明显的表达产物条
带,而未诱导的重组菌和空质粒对照菌则没有显示
此带 (图 3) ,这与预期的结果相符。
M.蛋白质分子质量标准; 1. pET32 a( + ) tSAG2未经 IPTG
诱导表达; 2. pET32a( + )未经 IPTG 诱导表达; 3. pET32a
( + ) tSAG2经 IPTG诱导表达; 4. pET32a( + )经 IPTG诱
导表达
图 3 pET32a( + ) tSAG2表达产物的 SDSPAGE分析
2. 4. 2 不同 IPTG浓度下表达产物的 SDSPAGE分
析 在温度 37 、转速为 220 r/m in, 不同 IPTG浓度
下进行诱导表达, 结果表明 IPTG浓度对于 rSAG2
蛋白表达的影响不是很大 (图 4)。
M.蛋白质分子质量标准; 1- 4.分别为 IPTG为
0. 1、0. 4、0. 7和 1. 0mm ol /L条件下的诱导表达
图 4 pET32a( + )tSAG2在不同 IPTG浓度下
表达产物的 SD SPAGE分析
2. 4. 3 不同诱导温度下表达产物的 SDSPAGE分
析 在 IPTG终浓度为 0. 1 mmo l/L、转速为 220 r/
m in,温度分别为 25 、32 、37 条件下进行诱导
表达, 结果表明当诱导温度为 32 时, 重组蛋白表
达量略高 (图 5)。
M.蛋白质分子质量标准; 1- 3.分别为 IPTG为 0. 1 mm ol /L,
温度为 25 、32 、37 条件下的诱导表达
图 5 pET32a( + )tSAG2在不同温度诱导下的表达
产物的 SDSPAGE分析
2. 4. 4 rSAG2融合蛋白的纯化 将制备的菌体裂
解液上清液经 H is B ind k it纯化试剂盒纯化后, 获
得了较纯的 SAG2融合蛋白,浓度为 2. 5mg /mL, 其
纯化产物进行 SDSPAGE蛋白电泳 (图 6)。
M.蛋白质分子质量标准; 1.未纯化的 rSAG2; 2.纯化的 rSAG2
图 6 重组蛋白纯化后的 SDSPAGE分析
2. 5 重组蛋白的鉴定
2. 5. 1 W estern b lo tting检测融合蛋白的免疫原
性 纯化的后 SAG2融合蛋白能被感染弓形虫的山
羊阳性血清识别, 在约 38 kD处出现显色很深的条
带, 而空质粒对照则在该处没有条带 (图 7)。说明
了此融合蛋白具有良好的免疫原性。
M.蛋白质分子质量标准; 1.空载体对照; 2.纯化后的 rSAG2
图 7 表达产物的W estern b lotting分析
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2010年第 4期 聂福旭等:弓形虫膜表面抗原 SAG2蛋白的高效表达及免疫活性分析
2. 5. 2 ELISA分析融合蛋白的免疫原性 根据方
阵滴定测定抗原最佳包被浓度为 1#100( 2 g /mL) ,
血清的最佳稀释度为 1#100; rSAG2蛋白能被弓形
虫感染的山羊血清所特异识别,而不与阴性血清反
应 (表 1)。可见融合蛋白具有很好的免疫原性,能
区分弓形虫阴阳性血清。
表 1 间接 ELISA方阵的滴定结果
血清稀释度 抗原稀释度
1#100 1#200 1#400 1#800
1#50 ( + ) 1. 28 1. 142 0. 941 0. 786
1#100 ( + ) 1. 012 0. 932 0. 812 0. 744
1#200 ( + ) 0. 836 0. 784 0. 652 0. 52
1#400 ( + ) 0. 748 0. 625 0. 59 0. 491
1#800 ( + ) 0. 659 0. 486 0. 402 0. 332
1#50 ( - ) 0. 085 0. 082 0. 087 0. 090
1#100 ( - ) 0. 092 0. 085 0. 086 0. 091
1#200 ( - ) 0. 076 0. 074 0. 083 0. 087
1#400 ( - ) 0. 082 0. 085 0. 076 0. 084
1#800 ( - ) 0. 082 0. 078 0. 076 0. 072
2. 6 SAG2蛋白的免疫反应性分析
结果如图 8所示, 通过荧光显微镜观察,可见绿
色荧光主要分布在刚地弓形虫的表面 (图 8A ),在
阴性对照中看不到特异性的绿色荧光 (图 8B )。由
此可见, 所表达的 SAG2重组蛋白制备的小鼠免疫
血清能够识别虫体表面的天然抗原 SAG2,并且进一
步说明此蛋白是位于刚地弓形虫表面。
图 8 间接免疫荧光试验 ( IFA)分析 SAG2
蛋白免疫反应性
3 讨论
弓形虫速殖子表面抗原 SAG2 ( P22)蛋白是刚
地弓形虫主要表膜抗原之一,被认为是弓形虫重要
的致病因子之一。由于 SAG2蛋白除介导弓形虫速
殖子的入侵过程外,还可以增强免疫动物抵抗感染
的能力,具有免疫保护作用,故 SAG2抗原很早就受
到国内外学者的重视。Grimwood等 [ 8]的研究表明,
膜表面的分子在弓形虫的早期入侵过程中起很重要
的作用,用抗 SAG2的单克隆抗体中和 SAG2后可将
速殖体固定在宿主细胞膜表面阻止其入侵。M ish
im a等 [ 9]的研究表明, 重组 SAG2蛋白与福氏佐剂联
合免疫可保护 17%的 BALB /c小鼠抵抗弓形虫攻击
感染。Li等 [ 10]使用 rSAG2 ELISA检测孕妇患者血
清, 20例急性患者中有 18例呈阳性,有效率为 90%;
70例慢性患者有 69例呈阴性,有效率为 986%。故
rSAG2可有效区分孕妇的急、慢性感染。因此,
SAG2可以作为免疫诊断及基因工程疫苗的候选抗
原, 由于纯化天然 SAG2蛋白制备工艺复杂且得量
较少,利用基因工程的方法是大量制备高纯度的
SAG2抗原的可行之路。
Tomavo等 [ 11]研究发现 SAG2的 N端前导信号
肽与 C端锚锭表膜的氨基酸序列具有高度疏水性。
雷明军等 [ 12]保留疏水性的 C末端进行表达,表达蛋
白能被兔抗弓形虫阳性血清识别, 但是体外表达的
可溶性蛋白表达量较低。为了使 SAG2蛋白在大肠
杆菌中以可溶性形式高效表达, 本研究针对 SAG2
蛋白的成熟多肽进行表达, 去除序列中 N端的疏水
性信号肽及 C端的疏水性氨基酸, 构建的重组质粒
pET32a( + ) tSAG2经充分诱导后,以融合蛋白的形
式在 E. coli内表达,通过优化表达条件使融合蛋白
在上清中高效表达, 且 SAG2融合蛋白具有 6 !H is
标签便于纯化,为后续工作提供了便利条件。免疫
印迹及 ELISA试验显示该重组蛋白能够被感染弓
形虫的山羊血清识别,表明其保持了天然蛋白的免
疫原性。 IFA试验显示 SAG2蛋白的抗血清能够与
天然 SAG2抗原特异性结合, 表明重组蛋白保持了
天然蛋白的免疫反应性。
影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素很多,
在本试验中发现, 影响 SAG2融合蛋白表达的条件
有温度、IPTG及 PH等多方面的影响因素。其中温
度影响最大,诱导温度以 32 为最佳, 37 诱导常
常会使一些蛋白聚集形成包涵体而失去活性, 以及
蛋白在较高温度下易被蛋白酶降解, 而造成蛋白表
达量的降低, 这与张舒婕等 [ 11]报道一致。 IPTG对
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
蛋白表达量的影响不大, 为了减小诱导剂对目的蛋
白的毒性作用,采用终浓度为 0. 1 mmo l/L来进行诱
导表达,这与方东山等 [ 12]报道的一致。
本研究利用原核表达系统, 获得了具有免疫
活性的重组 SAG2蛋白, 并用纯化的重组 SAG2
蛋白作为包被原建立的间接 EL ISA方法可明显
区分弓形虫阴阳性血清 , 这为血清学方法检测弓
形虫病奠定了基础。用重组蛋白制备的多克隆
抗体能够很好的识别弓形虫表面 SAG2蛋白, 为
进一步研究弓形虫的入侵机制和弓形虫的疫苗
奠定基础。
参 考 文 献
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