全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
混合菌发酵 L山梨糖生产 Vc前体
2酮基 L古龙酸研究进展
吕淑霞 1 赵朔 1 杨宇 1 张忠泽2 陈宏权3
( 1沈阳农业大学生物科学技术学院,沈阳 110866; 2中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳 110016; 3东北制药总厂 V c公司,沈阳 110028 )
摘 要: 利用混合菌发酵 L山梨糖生产 2酮基L古龙酸 ( 2KGA),再经化学转化合成维生素 C ( Vc), 是我国工业生产
Vc的主要途径,具有简化工艺, 减少污染,降低能耗等诸多优点。从菌系组合、菌种选育、代谢途径与酶学特性、工程菌构建、
伴生作用机制及发酵工艺等方面出发,综述混合菌发酵 L山梨糖生产 Vc前体 2KGA的研究现状和最新进展 ,并提出进一步
研究和探索的方向。
关键词: 混合菌发酵 L山梨糖 2酮基L古龙酸
Research Progress on Vc Precursor of 2KGA
Production ThroughM ixed Fermentation from Lsorbose
Lv Shux ia
1
Zhao Shuo
1
Yang Yu
1
Zhang Zhongze
2
Chen Hongquan
3
(
1
College of Biological Science and T echno logy, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866;
2
Institute of App lied Ecology, A cadem ia Sinica, Shenyang 110016;
3
N or theastPharmaceuticalG eneral Factory of Vitam in C Company, Shenyang 110028)
Abstrac:t Them ixed fe rm enta tion to produce 2ke toLgu lon ic acid ( 2KGA), as the precursor of V itam in C ( V c) transform
from Lso rbo se, is them ajorm ethod o fVc industr ial production in China. Th is m ethod has the advantages of sim ple ope ra tion, less po llu
tion and low er consumption. In this paper, the latest progresses o fm ixed fe rm entation to produce 2KGA are rev iew ed from the aspects of
stra ins comb ination, h ighy ie lding stra ins screen ing, m etabo lic mechan ism, enzym atic character istics, construction of the recomb inant
stra ins, bioeffects o f cocu ltured bacte ria fo r 2KGA produc ing and ferm entation cond itions optim ization, and the pro spective resea rch
fie lds w ere a lso prov ided.
Key words: M ixed ferm enta tion Lsorbose 2ke toLg luon ic ac id
收稿日期: 20110218
基金项目:沈阳市科学技术计划项目 ( F10205155, 105018300 )
作者简介:吕淑霞,女,博士,教授,研究方向:微生物生化与分子生物学; Em ai:l lushux ia@ hotm ai.l com
2酮基L古龙酸 ( 2ketoLgu lonic acid, 2KGA )
是维生素 C ( v itam in C, V c)合成的重要前体,主要采
用 莱氏法和 二步发酵法 进行工业生产。 莱氏
法 以 D葡萄糖为原料,经催化加氢制取 D山梨醇,
然后由生黑葡萄糖酸杆菌 ( G luconobacter m elanoge
nus)或醋酸杆菌属 ( Acetobacter sp. )的某些菌株发
酵生成 L山梨糖, 再经酮化、化学氧化和水解等几
步反应合成 2KGA。 二步发酵法 即在 莱氏法
第一步发酵的基础上, 再采用氧化葡萄糖酸杆菌
(G luconobater oxydans )和巨大芽孢杆菌 ( Bacillus
megaterium )混合菌发酵将 L山梨糖转化为 2KGA,
俗称糖酸转化 [ 1]。
采用混合菌发酵生产 2KGA具有简化工序, 降
低能耗,减少有毒药品使用和环境污染等诸多优越
性; 存在的问题主要是混合菌搭配经验依赖性较强
和生产批次间稳定性较差等。针对第二步发酵需要
两种菌共同参与这一特性, 国内外学者对其不断进
行多方面优化改造的研究,包括新混合菌系组合、优
良菌株选育、代谢途径、酶学特性、工程菌构建、伴生
作用机制及发酵工艺等研究, 以期进一步提高糖酸
2011年第 5期 吕淑霞等 :混合菌发酵 L山梨糖生产 Vc前体 2酮基 L古龙酸研究进展
转化效率和 2KGA产量,改善生产工艺流程。
1 研究现状
11 菌系组合
我国首创的 V c二步发酵法第二步是混合菌
发酵, 由产酸菌 (俗称小菌 )和伴生菌 (俗称大菌 )以
一定比例搭配混合后, 进行发酵生产 2KGA。对于
混合菌发酵菌株的组合,国内外进行了大量研究,旨
在提高发酵产酸率,并更加适合工业化生产。
V c工业生产常用的产酸菌为氧化葡萄糖酸杆
菌 ( G luconobacter oxydans) , 伴生菌为巨大芽孢杆菌
( Bacillus m egaterium )、蜡状芽孢杆菌 ( Bacillus
cerues)或苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuring iensis) [ 2 ]。
我国学者研究发现, 在 V c二步混合菌发酵中, 可作
为伴生菌的还有短小芽孢杆菌 ( Bacillus pum ilus )、
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌 (Ba
cillus lichenitorm is)、软化芽孢杆菌 ( Bacillus macer
ans)、条纹假单胞菌 ( P seudomonas striaia )、掷孢酵
母 ( Sporobiomyces roseus)和类脱发假丝酵母 ( Candi
da parap silosis)都能对产酸菌的生长与产酸产生不
同程度的促进作用。日本的 Takeda化学工业公司
使用氧化葡萄糖酸杆菌 (G luconobacter oxydans)与芽
孢杆菌属 (Bacillus)、假单胞菌属 (P seudomonas)、变
形菌属 (P roteus)、柠檬酸菌属 ( C itrobacter )、欧文氏
菌属 (E rw inia)和埃希氏菌属 (E scherichia )等中的一
种微生物混合均能将 L山梨糖氧化为 2KGA, 这样
大大提高了混合菌系组合的选择范围 [ 3]。 Takagi
等 [ 4]采用嗜麦芽黄单胞菌 (Xanthomonas maltoph il
ia )作为伴生菌也获得良好的发酵结果。
12 优良菌种选育
从自然界分离筛选具有生产目标产物能力的菌
种,是获得适合大规模工业生产所需优良菌种的首
选方法。Lee等 [ 5 ]以 2KGA作为唯一碳源筛选到含
有高活性的 L山梨糖脱氢酶和 L山梨酮脱氢酶的
微生物,从而为高产 2KGA菌种的筛选提供一条新
途径。杨伟超等 [ 6]建立了一种以测定伴生菌进入
对数期早晚和对数期持续长短为基础的高效伴生菌
的快速初筛方法, 较传统方法工作量小, 筛选效率
高,适合大规模初筛应用。
诱变育种不仅能改良菌种性状, 有效提高混合
菌的糖酸转化率,而且方法简便易行,对条件和设备
要求较低,至今仍广泛应用于高产菌株的选育工作,
对于 2KGA产量和经济效益的提高具有重要的实
践意义。郭礼强等 [ 7]采用苏云金芽孢杆菌经紫外
线 (UV )、亚硝基胍 ( NTG )及两者的复合诱变, 获得
1株高效伴生菌株 UN366,该菌与氧化葡萄糖酸杆
菌混合发酵使平均糖酸转化率提高 632% ,且经连
续 5代转接发酵试验后, 仍保持稳定性状。Xu等 [ 8]
利用 N +、H +分别注入巨大芽孢杆菌和氧化葡萄糖
酸杆菌,选育出一系列糖酸转化率突破 90%的高产
菌系。
随着空间生物学的蓬勃兴起和迅速发展, 空间
诱变已成为微生物诱变育种的一种有效方法。继郭
立格等首次利用 神州四号 飞船搭载 V c生产菌株
并成功筛选出高产、高效菌株后, 汲涌等 [ 9]选取 3株
性状不同的 Vc二步发酵生产菌搭载于 神舟七号
飞船进行空间诱变,在 12 000株诱变菌株中选出 12
株转化率提高 5% - 7%的优良菌株,将新菌株应用
于大规模生产,转化率提高 4% - 5%。
13 发酵工艺优化
由于 V c二步发酵法的第二步是采用产酸菌
和伴生菌混合培养,最佳发酵工艺条件需兼顾两菌
的最佳生长条件和产酸菌的最佳产酸条件。通过优
化营养条件和环境因子等发酵条件可有效地调节混
合菌的生理状态,促进两菌之间的比例协调,使其达
到最佳发酵状态 [ 10]。与单菌发酵相比,混合菌代谢
规律更加复杂。
营养是微生物生长代谢的物质基础, 微生物从
其生存环境中获取生命活动所需的各种营养成分。
山梨糖是 2KGA工业生产中产酸菌的双功能营养
物, 一般采用流加山梨糖的工艺来避免因底物的初
始浓度过高而产生的菌体代谢异常。采用最优恒速
流加山梨糖分批发酵的效果明显优于间歇加糖 [ 11]。
添加蔗糖能够有效提高高渗条件下伴生菌的生长能
力, 促使生物活性物质的分泌,进而促进产酸菌的生
长和产酸 [ 12 ]。无机盐作为微生物生长不可缺少的
六大营养物之一,需要量虽少,但直接影响菌体生长
和代谢产物的形成。适当浓度的 Fe3+、Mn2 + 和
Mg
2+能够显著促进细胞生长或产酸, 在最佳组合
下, 2KGA产量比优化前提高 1444% [ 13]。 La3 +、
Ce
3 +、Nd3+和 Sm3+ 等轻稀土离子在低浓度条件下
51
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
能显著提高山梨糖消耗速率并促进 2KGA合成,缩
短发酵周期 [ 14]。
微生物生长除了需要必要的营养条件, 也离不
开适宜的环境条件。温度在不同生长时间及时进行
协调控制, 有利于 2KGA的积累 [ 15]。针对混菌发
酵体系中不同菌株对 pH 的不同需求, 导向性地采
用分阶段 pH控制可提高 2KGA生产效率 [ 16 ]。在
发酵过程中采用分阶段供氧模式进行分批发酵,表
现出良好的发酵状态, 能够保持较高的耗糖速
度 [ 17]。在发酵开始后 12 h,添加 10 000U /mL浓度
的溶菌酶,破坏伴生菌的细胞壁,使其迅速裂解释放
胞内活性物质,从而促进产酸菌生长和产酸 [ 18 ]。目
前工业中通常采用分批发酵生产 2KGA, Takagi
等 [ 4]采用混合菌系 K etogulonicigenium vulgare DSM
4025和 Xan thomonas maltophilia IFO 12692进行二
级连续发酵, 当稀释速率均为 00430 /h, 2KGA产
量可达到 1185 g /L。
14 产酸菌的代谢途径及酶学研究
我国 Vc二步发酵法 产酸菌代谢途径被证实
为 L山梨酮途径: L山梨糖 L山梨酮 2KGA。
参与代谢途径中催化第一步反应的酶是 L山梨糖
脱氢酶 ( Lsorbose dehydrogenase, SDH ), 催化第二步
反应的酶是 L山梨酮脱氢酶 ( Lsorbosone dehydro
genase, SNDH )。SDH对 L山梨糖有很高的专一性,
SDH活性决定产酸量, 产酸量与产酸菌细胞数目成
正比; SNDH需要 NAD+或 NADP+作为辅因子, L山
梨酮是其最适底物 [ 19]。 L山梨酮途径 中 2KGA
并非代谢反应终点, 产酸菌的细胞质中存在 2KGA
还原酶 ( 2ketoLgu lonic ac id reductase, KGR )能将
2KGA还原成 L艾杜糖酸 ( Lidon ic ac id) , 导致产
酸量降低: L山梨糖 L山梨酮 2KGA L艾杜
糖酸 [ 20]。由于该酶能降解 2KGA而使 2KGA的产
量降低 3% - 5% [ 21 ] ; 如果能通过同源重组利用基
因敲除技术使 KGR基因沉默,可望达到阻断副产物
代谢途径,进而提高 2KGA产量的目的。
Sug isaw a 和 H oshino 等 [ 22, 23] 从 G luconobacter
m elanogenusUV 10的细胞膜和细胞质中分离 SDH
和 SNDH。其中, SDH定位于细胞膜上, 相对分子质
量为 576 kD,以 FAD为电子受体; SNDH存在于细
胞浆中, 相对分子质量为 536 kD, 以 NAD( P) +为
电子受体。郝爱鱼等 [ 24] 从 K etogulonigenium sp.
WB0104中分离到可直接转化 L山梨糖为 2KGA
的一种 SDH, 主要存在于细胞质部分, 其酶活力是
膜分布的 2267倍。这里的普通酮古龙酸菌 (K e
togulonigenium sp. )就是氧化葡萄糖酸杆菌 ( G lu
conobacter oxydans)的重新命名 [ 25]。蒋宇扬等 [ 26]研
究发现, KGR是以 NAD( P) H 为辅酶,是由相对分
子质量分别为 53 kD和 32 kD的两个亚基组成的相
对分子质量为 90 kD的二聚体,可能含有糖类组分。
KGR是一个典型的 M ichaelisMen ten氏酶, 对 2
KGA作用的 Km值为 342 103mo,l最适作用 pH
为 65, 最适作用温度为 30 。
15 基因工程菌株构建
利用基因工程手段,将与转化相关的基因转入
到同一株微生物中,构建成一步发酵工程菌,既可充
分利用 V c二步发酵法 糖酸转化率高的优势,又可
进一步简化工艺, 减少浪费, 全面提升我国 V c生产
的竞争力,继续保持世界领先水平。目前利用基因
工程技术构建一步发酵工程菌的研究已取得一定
进展。
日本 Roche研究中心从普通酮古龙酸菌 DSM
4025中确定了山梨糖脱氢酶编码的基因 A1、A2、
A3,以及山梨醇脱氢酶基因 B。将山梨醇脱氢酶基
因 B导入 DSM 4025中, 可实现从 D山梨醇一步发
酵生成 2KGA;将醇醛脱氢酶基因 A和 B的嵌合体
导入 DSM 4025,由 D山梨醇发酵生产 2KGA的产
量最高可达 773 g /L[ 27]。M iyazak i等 [ 28, 29] 发现
DSM 4025不仅可以转化 L山梨糖生成 2KGA,且能
够以 D山梨醇、L山梨糖、L古洛糖和 L山梨酮为
底物直接合成 V c,并从 DSM 4025中纯化得到能够
催化 L山梨酮直接生成 V c的以 PQQ为辅基的 L
山梨酮脱氢酶 1( SNDH1) , 获得其编码基因并成功
在大肠杆菌表达。
华北制药集团新药研究中心与病毒基因工程国
家重点实验室合作完成了小菌普通酮古龙酸菌
WB0104全基因组序列的测定, 为研究其重要的代
谢功能基因、代谢流分析以及代谢网络重建,以及开
展 V c生产菌株的改造和生产工艺的改进提供最直
接的依据 [ 30 ]。军事医学科学院生物工程研究所的
科研人员应用 DotELISA方法及功能检测从小菌基
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2011年第 5期 吕淑霞等 :混合菌发酵 L山梨糖生产 Vc前体 2酮基 L古龙酸研究进展
因组文库中筛选得到具醇醛脱氢酶活性的阳性克
隆,发现了糖酸转化关键酶 SDH 的基因, 并确定
SDH前端有一段与蛋白的周质定位相关的信号肽,
去除该信号肽后 SDH的表达量虽有所增强,但会影
响 SDH的体内产酸作用 [ 31- 33]。
16 伴生菌和产酸菌的关系
伴生菌单独培养生长良好, 其生长最适碳源是
葡萄糖, 最适 pH是 72。伴生菌细胞没有合成 2
KGA的全部酶系, 不能代谢 L山梨糖, 也不产生 2
KGA。产酸菌单独培养生长较弱,产酸量低,传代困
难,但产酸菌细胞内含有合成 2KGA的全部酶系,
SDH酶活力基本上与产酸菌的细胞量成正比, 与伴
生菌的细胞量多少无关 [ 34]。伴生菌与产酸菌混合
培养则产酸菌生长快且产酸量高。然而, 伴生菌究
竟是通过什么方式对产酸菌起伴生作用, 一直是业
界研究的热点和难点, 也是制约 2KGA产量、转化
率和生产强度进一步提高的关键。
目前,研究者比较一致的观点认为,伴生菌是通
过释放某种生物活性物质以促进产酸菌的生长和产
酸。魏东芝等 [ 32]曾提出伴生菌在发酵初期会分泌
某种生长因子促进产酸菌细胞的生长。吕淑霞
等 [ 33]发现, 分子量在 30 - 50 kD范围内和大于
100 kD的大菌胞外液组分,均能通过缩短产酸菌的
延迟期,对产酸菌的生长和 2KGA的合成产生明显
的促进作用。其中, 30- 50 kD范围的伴生菌胞外
液中的活性组分为一种蛋白质,其表观分子量约为
35 kD,由一种亚基构成, 且该蛋白含金属铁和锌元
素。中国科学院离子束生物工程重点实验室的研究
结果表明,伴生菌主要是通过其生长过程中的碱性
分泌物和胞外液中的活性蛋白对产酸菌起到了伴生
作用。碱性分泌物中和发酵体系中积累的 2KGA,
使系统中的 pH 值保持恒定, 有利于产酸菌的生长
和增殖;胞外液中的活性蛋白激活并提高产酸菌
关键代谢酶 SDH的活力, 从而提高产酸菌的糖酸
转化效率, 使混合菌发酵体系中 2KGA的得率增
加, 该活性蛋白的相对分子质量约为 58 kD[ 34, 35]。
基于以上试验研究, 工业化生产中更希望发展一
种高效、简单、易于操作的调控手段, 使伴生菌适
时地、定向地释放活性物质, 以促进产酸菌的生长
和产酸。
2 展望
利用产酸菌和伴生菌混合菌发酵 L山梨糖生
产 V c重要前体 2KGA是我国 V c生产的主要工艺
方法, 处于国际领先地位。近年来, 在菌种选育、发
酵条件、代谢途径和酶学研究等各个方面都取得了
一定的研究进展, 以产酸菌糖酸转化途径及相关基
因的研究最为突出。但对伴生菌的伴生作用机制了
解较少,伴生菌产生的活性物质特性、其形成规律及
伴生菌起重要作用的相关基因均鲜见报道。因此,
对于混合菌发酵 L山梨糖生产 Vc的前体 2KGA应
深入进行以下方面的研究和探索: ( 1)促进产酸菌
生长与产酸的不同伴生菌的作用机理; ( 2)与伴生
菌作用有关的活性物质是否具有类似结构; ( 3)活
性物质基因挖掘及其功能的系统深入研究; ( 4)利
用现代生物技术构建基因工程菌株以期实现 V c第
二步以 L山梨糖为底物的单菌发酵。
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(责任编辑 狄艳红 )
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