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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
c2flag2ago3质粒在人 293细胞系中的表达
及 AGO3蛋白复合物的细胞定位
刘丽丽　王荣富
(安徽农业大学生命科学学院 ,合肥 230036)
　　摘 　要 : 　将 c2flag2ago3质粒转入人 293细胞系中 ,使 c2flag2ago3基因稳定表达 ,为进一步研究 AGO3蛋白复合物的结构、
功能奠定了基础。利用亲和标签 flag对目标蛋白进行检测和监测 ,将已合成的 c2flag2ago3质粒和用于对照的质粒 si2ago3 (能
使 ago3基因沉默的质粒 )导入人 293细胞系中 ,在荧光镜下观察转染效果。RT2PCR法检测基因含量 ,蛋白印迹法 (WB )检测
人 293细胞表达的 flag2ago3,并对其蛋白复合物进行细胞定位。结果显示 , c2flag2ago3质粒和 si2ago3质粒成功地导入人 293细
胞系中 ,免疫细胞化学显示 c2f lag2ago3基因在细胞中高表达、并检测到 AGO3复合物定位于细胞质中。AGO3复合物在细胞
中可稳定表达 ,为进一步研究 AGO3蛋白复合物的构成及其在人体中的功能奠定了基础。
关键词 : 　flag标签 　c2flag2ago3质粒 　人 293细胞系 　AGO3蛋白复合物
The Expression of c2flag2ago3 Plasm id in Human 293 Cell L ine
and the Localization of AGO3 Prote in Compounds
L iu L ili　W ang Furong
( School of L ife Science, Anhui Agricultural Universty, Hefei 230036)
　　Abs trac t: 　 It was to transfect c2flag2ago3 p lasm id into human 293 cell line to make the c2flag2ago3 stable exp ression , and investi2
gate the structure and function of AGO3 p rotein compounds in human. The methods of affinity tags on the target p rotein were used , then
the c2flag2ago3 p lasm id and the control si2ago3 p lasm id which can cause ago3 gene silence were transfect into human 293 cell line, and
the effectwas observed through the fluorescence m icroscope. was observed RT2PCR detected gene content. Flag2ago3 p rotein was tested
by western blot with mouse anti2flagMonoclonal antibody, and located the AGO3 p rotein compounds in cell. Results indicated that the
c2flag2ago3 and the si2ago3 p lasm id were inducted successfully in the human 293 cell line and the high exp ression of the ago3 was com2
firmed by immuncytochem ical method. It also p roved that the AGO3 compounds located in the cytop lasm.
Key wo rds: 　Flag tag　c2flag2ago3 p lasm id　Human 293 cell lines　AGO3 p rotein compounds
收稿日期 : 2009203218
作者简介 :刘丽丽 ,女 ,在读硕士 ,专业 :生物物理 ; E2mail: lili_liu8401@163. com
通讯作者 :王荣富 ,男 ,安徽肥东人 ,教授 ,博士 ,主要从事植物生理生态教学和研究 ; E2mail: rfwang@ ahau. edu. cn　　1998年由 Fire等 [ 1 ]首次发现并命名了 RNA干扰 (RNA interferenc, RNA i)。在 RNA i技术的研究进展中 , A rgonaute蛋白家族也被科学家揭开了神秘的面纱。A rgonaute家族分为 Ago 和 Piwi两个亚枝 [ 2 ] , A rgonaute蛋白大约 100 kD ,具有 PAZ ( Piwi2A rgonaut2Zwille)和 P IW I[ 3 ]结构域。科学研究证实AGO成员广泛存在于生物体内与小 RNA分子结合形成一种沉默复合体 ( RNA induced silencing com2p lex, R ISC)识别 [ 4 ]靶分子并介导基因沉默。例如 , 在拟南芥中发现 10个 AGO成员 [ 5 ]其中 AGO4蛋白可以介导修改染色质 [ 6 ] ,在果蝇中有 5个 AGO蛋白成员 [ 7 ] ,在人体中有 8个 AGO蛋白成员 [ 8 ] ,在哺乳动物细胞中证明 AGO1和 AGO2蛋白与启动子 DNA结合介导转录沉默 [ 9 ]。由于转入的 ago3基因在细胞中很难稳定表达 [ 10 ] ,因而对 AGO3蛋白的结构、功能尚不清楚。Flag是一个由十几个氨基酸组成的蛋白标签 ,由目的蛋白 ( target p rotein)和标签 ( tag)共同构成的
2009年第 7期 　　刘丽丽等 : c2flag2ago3质粒在人 293细胞系中的表达及 AGO3蛋白复合物的细胞定位
蛋白嵌合体 ,常标记于重组蛋白质的氨基端以帮助
分析靶蛋白的生物学功能 ,用于目的细胞暂时不易
得到或目的细胞转染效率非常低基因靶点的筛选。
本实验利用亲和标签 ( flag)对目标蛋白进行检测和
监测的方法 ,将已合成的 c2flag2ago3质粒导入人 293
细胞系中 ,使其稳定表达并对其蛋白复合物进行检
测及细胞定位 ,为进一步研究 AGO3蛋白及其复合
物的结构、功能奠定了基础。
1　材料和方法
111　材料
11111　细胞、质粒、引物和菌株 　细胞 293细胞由
中国科学学院生物物理研究所提供。 si2ago3质粒 ,
带有 flag标签的 ago3质粒由上海吉玛制药有限公
司合成。引物 c2flag2ago3引物 , Ago3引物 , si2ago3
引物和β2actin引物由北京三博远志生物技术有限
责任公司合成。大肠杆菌 DH5α菌株由中国科学学
院生物物理研究所提供。
11112　抗体 　一抗兔源的 anti2actin;二抗辣根酶标
记山羊抗兔 lgG ( H + L ) 2B 22301;一抗鼠源的 anti2
flag tag单克隆抗体 ;二抗辣根酶标记山羊抗鼠的
lgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ,为 Santa
Cruz产品 ;山羊抗鼠的多克隆抗体 ,该抗体上耦联
有荧光物质 cy3, 550 nm的激发光下显红色。
11113　试剂 　质粒提取试剂盒从 Q IAGEN公司购
买 ;质粒转染试剂盒 (L ipofectam ine2000)购自 GIB2
CO公司 ; DNA marker、Taq酶购自 Gibco公司 ;逆转
录酶、O ligo ( dT) 15 Primer酶购自 Promega公司 ; Trizol
购自 Invitrogen公司 ;硝酸纤维素膜 ; X2光片 ;化学发
光试剂购自北京中山公司 ,为 Santa Cruz产品 ,分 A
和 B两种试剂。
112　方法
11211　293细胞的培养 　细胞培养需要 :合适的细
胞培养基 ;优质血清 ;无菌无毒细胞培养环境 ;合适
的生长温度、气体条件。而且要及时换液、传代 ,用
显微镜观察其生长状态 (图 1)。
11212　脂质体转染 　将生长良好的 293细胞以
2. 0 ×105 /m l的密度 ,以每孔 2 m l的接种量接种于 6
孔板上 , 24 h后换成无血清的 DMEM血清 ,以 L ipo2
fectam ine2000作为转染试剂 ,转染 si2ago3质粒和 c2
flag2ago3质粒于 293细胞中 (脂质体 ∶质粒质量 =
图 1　正常 293细胞生长形态
5μl∶1μg) , 24 h后换成含 10%胎牛血清的 DMEM
培养基继续培养 ,用倒置荧光显微镜观察 (图 2)。
图 2　转入 si2ago3质粒 48 h的 293
图 3　转入 c2m yc2ago3质粒 48 h的 293细胞
11213　RT2PCR检测 　提取正常 293细胞和已转染
过 si2ago3 质粒和 c2flag2ago3 质粒 293 细胞的总
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RNA ,通过 RT ( reverse transcrip tion)反应合成 cD2
NA。按照 Promega公司的 RT2PCR说明书操作。将
产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳。
11214　蛋白印迹法 (W estern blotting) 　用含 1%脱
脂奶粉的 TBST溶液稀释抗体。检测 flag2ago3融合
蛋白用鼠源的 anti2flag tag单克隆抗体 (工作浓度为
1∶300) ;同时检测β2actin蛋白质 ,一抗兔源的 anti2
actin; (工作浓度为 1∶300)。室温摇过夜。TBST洗
膜 3次 ,每次 5 m in。二抗分别为辣根酶标记山羊抗
兔 lgG(H +L ) 2B 22301;辣根酶标记山羊抗鼠的 lgG
(工作浓度为 1∶4 000) ,室温摇 40 m in, TBST洗膜 2
次 ,每次 15 m in。X片显影。
11215　免疫荧光法 　根据抗原抗体反应的原理 ,用
一抗鼠源的 anti2flag tag单克隆抗体识别 flag片段 ,
再用耦联有荧光物质 Cy3的二抗 (山羊抗鼠的多克
隆抗体 )与一抗相结合 ,最后封片用 O lympus全反射
共聚焦显微镜观察 ,对 AGO3复合物进行定位。
2　结果
211　RT2PCR检测结果
RT2PCR结果 (图 4)显示 , c2flag2ago3质粒已被
成功地转入 293细胞中 ,并且其 ago3基因含量要明
显比转染 si2ago3质粒的 293细胞和正常 293细胞
中的 ago3基因含量高。而且证实了只有转染有 c2
flag2ago3质粒的 293 细胞中具有 f lag2ago3 基因。
此结果为进一步检测 f lag2ago3在 293细胞中的蛋
白表达奠定了基础。
212　si2ago3质粒和 c2flag2ago3质粒在 293细胞中的
表达
W estern blotting结果 (图 5)表明 , flag2ago3融合
蛋白在 293细胞系中可以稳定表达 (泳带 4) ,而泳
带 2, 3中未发现有 flag2ago3蛋白 ,泳带 5为β2actin
的蛋白表达。此试验为进一步对目标蛋白 (AGO3
蛋白复合物 )在 293细胞中的定位提供了条件。
213　免疫荧光定位检测结果
免疫荧光结果如图 6所示。图 6中的蓝色荧光
为用 DAP I标记过的染色体发出的荧光。DAP I可
以与染色体结合 ,是一种专门染细胞核的染料 ,其在
紫外光的激发下可以发出蓝光 ,可以帮助确定细胞
核的相对位置 ,因此表明了细胞核的位置 ,红色为二
1和 11分别为 DNAmarker2000; 2, 3, 4分别为转入 si2ago3质粒的 293
细胞 ,正常 293细胞和转入 c2flag2ago3质粒的 293细胞中 ago3基因
的含量 ; 5, 6, 7分别为转入 si2ago3质粒的 293细胞 ,正常 293细胞和
转入 c2flag2ago3质粒的 293细胞中β2actin基因含量 ; 8, 9, 10分别为
转入 si2ago3质粒的 293细胞 ,正常 293细胞和转入 c2flag2ago3质粒
的 293细胞中有 flag2ago3基因的含量
图 4　RT2PCR检测结果
1, 6为蛋白 marker; 2, 3, 4分别为转入 si2ago3质粒的 293细胞、正常
293细胞和转入 c2flag2ago3质粒的 293细胞中 flag2ago3蛋白的表达 ;
5为转入 c2flag2ago3质粒的 293细胞中β2actin的蛋白表达
图 5　W estern blotting检测结果
图 6　AGO3复合物在人 293细胞中的定位
(下转第 140页 )
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以诱导 iNOS生成 ,影响细胞的氧化应激。因此 ,本
试验采用 LPS刺激 HUVECs。
血管内皮细胞主要由 iNOS通过 L2精氨酸途径
合成 NO。多种炎症信号 ,如 LPS、TNF、IL21β、干扰
素α等均可诱导血管内皮细胞 iNOS表达上调 ,促
进 NO的合成 [ 5 ]。大量生成的 NO能与氧气或过氧
化物 (O2 2)结合分别形成具有强氧化功能的氧自由
基 ROS(OONO～)或 RNOS(NO2、N2O3 )而发挥细胞
毒作用。一方面这些自由基使巯基蛋白和脂质过氧
化 ;另一方面 ,这些氧自由基可通过脱氨基作用、
DNA环的断裂、耗竭谷胱甘肽的储备来诱导 DNA
的损害 ,从而促进炎症和细胞损伤 [ 6, 7 ]。
红花在临床上主要以水煎液人药 ,红花黄色素
为红花水溶性组分 ,它是红花抗血栓有效组分 ,红花
黄色素所含主要成分为 HSYA [ 8 ] ,具抗血小板激活
因子的作用 [ 8 ] ,因此 , HSYA作为抗凝药物在血管疾
病的治疗中具有很好的应用前景。同时 ,研究表明
HSYA具有抗炎 ,抗氧化作用 ,但其具体作用机理还
不明确。本试验研究了 HSYA 对 LPS作用后 HU2
VECs表达的 iNOS的影响 ,结果表明 HSYA可以抑
制 LPS诱导的 iNOS的表达上调 ,减少 NO生成。该
研究为治疗血管炎症疾病提供了新的思路。
参 考 文 献
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7　 KettelerM, BorderWA, Noble NA. Am J Physiol , 1994, 267: 197
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8　 W u W , L i JR, Chen WM, el a1. Chin Pharm J, 2002, 37: 743～745.
(上接第 136页 )
抗在 550 nm的激发下发出的荧光 ,二抗与一抗结合
而其中一抗又是与 flag片段相结合 ,因此 ,可以表明
AGO3复合物被定位于细胞质中。
3　讨论
A rgonaute蛋白具有 N端、中间区、P IW I区和 PAZ
四个区域 , PAZ去可识别单链 siRNA的 3′端 ,在 RNA i
基因沉默途径中起着至关重要的作用 ,在焦酚火球菌
研究中发现 N端、中间区和 P IW I区在 PAZ区域上形
成一个新月状 ,该结构产生了带正电的凹槽 ,可能是
核酸结合位点 [ 11 ]。在结构中还发现具有活性部位
(A sp2A sp2H is)。人体中有 8个 AGO 蛋白成员 ,对
AGO1、AGO2、AGO3、AGO4 活性进行检测 , 发现
AGO2、AGO3具有相同的 (A sp2A sp2H is)活性部位 ,
但是只有 AGO2蛋白具有降解功能 , AGO3蛋白情况
仍未清楚。因此本试验利用亲和标签 ( flag)对目标
蛋白进行检测和监测的方法 ,将 c2flag2ago3质粒转
入人 293细胞系 ,使 AGO3蛋白在细胞内稳定表达
并对其进行细胞定位 ,为进一步检测 AGO3蛋白复
合物的结构、功能奠定了基础。
参 考 文 献
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