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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
原子力显微镜对人羊膜间充质干细胞成脂分化的观察
陈茜1 肖盼2 陈剑2 蔡小芳1 蔡继业1
(1暨南大学化学系，广州 510632;2 暨南大学附属第一医院眼科，广州 510632)
摘 要: 观察人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)成脂分化前后超微结构及其机械性
能的变化，以期进一步了解 hAMSCs在体外成脂分化的过程。用流式细胞仪分析细胞表面分子表达情况，油红 O 染色检测
hAMSCs成脂分化情况，原子力显微镜观察(AFM)分化前后超微结构及机械性能的变化等。结果显示，流式细胞检测显示，
CD34，CD45，HLA-DR，呈阴性表达，CD29，CD90 呈阳性表达;油红 O 染色可见脂肪细胞胞质中有大小不等的圆性红色脂肪滴;
AFM观察诱导后的 hAMSCs表面有脂滴状的颗粒，粘弹力增大，硬度减小。运用 AFM可以清晰观察到诱导前后形貌及机械性
能变化。
关键词: 羊膜间充质干细胞 成脂分化 AFM 超微结构
Observation of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells
Differentiation to Lipoblast By AFM
Chen Qian1 Xiao Pan2 Chen Jian2 Cai Xiaofang1 Cai Jiye1
(1Department of Chemistry，Jinan University，Guangzhou 510632;
2Department of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510632)
Abstract: It was to realize the lipoblast differentiation process of human amniotic mesenchymal stem cells，(hAMSCs)in vitro
through observing the ultra-structure and the mechanical properties changes from hAMSCs to lipoblast The cell surface antigenic char-
acteristics of the cultured hAMSCs were analyzed by flow cytometry Confirmation of hAMSCs differentiation by oil red staining The ul-
tra-structure and the mechanical properties changes were observed by atomic force microscopy(AFM) The flow cytometry analyses re-
vealed that the expression of surface antigens，such as CD29，CD90 was positive;but CD34 CD45，and HLA-DR(MHC class Ⅱ)were
negative After oil red staining，lipoblast-differentiating cells cytoplasm were full of lipid vacuoles. Under AFM，lipid vacuoles were ob-
served and the visco-elasticity increased，the stiffness decreased after induction The ultra-structure and the mechanical properties chan-
ges could be distinctly observed under AFM.
Key words: hAMSCs Lipoblast differentiation AFM Ultra-structure
收稿日期:2010-01-29
基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(6057825) ，海外及港澳合作研究基金项目(30828023)
作者简介:陈茜，女，硕士研究生，研究方向:生物纳米技术;E-mail:x. chenqian@ hotmail. com
通讯作者:蔡继业，博士生导师，E-mail:tjycai@ jnu. edu cn
羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchy-
mal stem cells ，hAMSCs )与骨髓来源的间充质干细
胞(mesenchymal stem cells，MSCs)相似［1］，具有高度
自我更新能力和多向分化潜能［2］，比骨髓来源的
MSCs具有更强的扩增能力;骨髓细胞必须通过侵入
的途径获得 ，且其随着年龄的增长 ，干细胞数量显
著减少［3］。而从羊膜分离、培养干细胞 ，因其来源
广泛 ，不受伦理限制等优越性而具有广阔的应用前
景，成为细胞移植和组织工程的一种新型种子细胞。
为此，本试验对人羊膜间充质干细胞进行体外诱导，
观察其成脂分化过程中的表征变化，以期全面了解
羊膜间充质干细胞成脂分化的过程。
AFM 通过探针与被测样品之间微弱的相互作用
力(原子力)来获得物质表面形貌的信息，且分辨率
可达原子级水平。与其它显微镜相比，AFM 观察细
胞具有无可比拟的优点:分辨率高，可达纳米级，能
2010 年第 6 期 陈茜等:原子力显微镜对人羊膜间充质干细胞成脂分化的观察
在较高分辨率基础上观察样品的三维表面结构［4，5］;
可以直接在生理溶液中成像，并能够对活细胞在生
理、病理条件下的形态结构变化进行动态、实时地观
察;与扫描电镜、透射电镜相比，样品制备时间短、操
作简单、所需样品量小、成本更低。因此 AFM是探测
生物样品表面超微结构的好工具［6 － 9］。AFM还可以
获得细胞的力学相关参数，如单分子探测［10，11］，粘附
力［12］，弹性力，单个原子的化学识别［13］，细胞硬
度［14 － 18］，抗原-抗体亲和力分析［19，20］等。
1 材料与方法
1 1 试验材料、试剂及仪器
人羊膜取自经家属同意健康的剖宫产分娩产妇
(暨南大学第一附属医院)的胎膜。
低糖型 Dulbecco 细胞培养液(LG-DMEM，Gibico
公司) ，胎牛血清(FBS，Gibico公司)胰蛋白酶(Amre-
seo 公司)青-链霉素(Gibco 公司) ，鼠抗人 CD29-
FITC、鼠抗人 CD90-PE-CY5 抗体(Ancell 公司) ，鼠
抗人 CD34-PE 抗体(Caltag Laboratories 公司) ，鼠抗
人 HLA-DR-FITC 抗体(Immunotech 公司)鼠抗人
CD45-PE-CY5 抗体(Ancell 公司) ，3-异丁基-1-甲基
黄嘌呤，胰岛素，吲哚美辛，地塞米松(Sigma 公司)。
原子力显微镜(AFM Thermomicroscopes，USA)。FAC-
SCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson 公司)。
1 2 hAMSCs 分离培养鉴定
1 2 1 hAMSCs 分离与培养 取产后弃置的新鲜
胎盘(经家属同意) ，将羊膜与绒毛层钝性分离，置
于含有双抗的 D-Hank’s 液中反复冲洗。将漂洗后
的羊膜用眼科剪剪成约 1 mm × 1 mm 小块，加入
2 5 g /L 胰蛋白酶，于 37℃水浴中消化 30 min，用
200 目细胞筛过滤，再加入 1 0 g /L Ⅱ型胶原酶消化
液，在 37℃水浴中消化 0 5 h，1 000 r /min 离心 5
min，调整细胞密度为 1 × 106 /mL，接种至 25 cm2培
养瓶，置 37℃，5% CO2的培养箱内培养，隔天换液
1 次。待细胞长满 70%瓶底时，用 2 5 g /L 的胰蛋
白酶消化细胞，按 1∶ 2 的比例传代培养。
1 2 2 hAMSCs 细胞表面抗原表达 培养的第 3
代细胞用 2 5 g /L 的胰蛋白酶消化后，以含 10 %胚
牛血清白蛋白的 PBS 调整细胞至 5 × 106 /mL。取
50 μL 细胞悬液，分别加入下列鼠抗人单克隆抗
体:CD29-FITC、CD90-PE-CY5 、CD34-PE 、HLA-DR-
FITC，CD45-PE-CY5 。置 4℃下孵育 30 min，PBS 洗
2 次，进行流式细胞仪分析。
1 3 hAMSCs向成脂诱导
细胞完全汇合后，开始加入分化诱导液，其组成
为内含 0 1 mmol /L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10 mg /L
胰岛素、0 1 mmol /L 吲哚美辛、1 μmol /L 地塞米松、
体积分数为 10 %胎牛血清、含有双抗的 DMEM。3 d
后换成维持液(内含 10 mg /L胰岛素、体积分数为 10
%胎牛血清、DMEM) ，重复以上步骤 3次。
1 4 油红 O染色检测 hAMSCs成脂肪分化
细胞诱导分化结束后，用 PBS 冲洗细胞 1 次，
体积分数为 0 4%的甲醛室温固定 30 min，5 g /L的
油红异丙醇溶液用去离子水按 3∶ 2 稀释后加入已固
定好的细胞中，37 ℃孵育 30 min，PBS清洗 1 次。
1 5 AFM成像
取出附有细胞的玻片，先用 pH7 4 的 PBS 缓冲
液冲洗，然后用 2 5%的戊二醛固定 15 min，用蒸馏
水冲洗 3 次，室温自然干燥。将制备好的样品置于
AFM的 XY扫描台上，用监视器定位所要扫描的样
品区域，在空气中室温下应用 AFM对样品进行扫描
成像。试验采用 100 μm 扫描器，接触模式成像，
UL20B 硅探针，微悬臂的弹性系数为 2 8 N /m。
AFM图像经过自带软件(IP2 1 版)的平滑处理，以
消除扫描方向上的低频背景噪音。用接触模式成像
可得到细胞膜表面的力曲线，每条力曲线都是系统
自动测量 15 次得到的平均值。
2 结果
2 1 流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达
检测结果显示，CD34，CD45 HLA-DR，呈阴性表
达，CD29，CD90 呈阳性表达。
2 2 油红 O染色检测
将染色后的细胞置于倒置荧光显微镜观察(图
1) ，经油红 O 染色后可见细胞胞质中有大小不等的
圆性红色脂肪滴，细胞形状呈现多样化:长梭形，多
边形，星形等。细胞胞质内有折光性较强的脂粒出
现，并随着诱导时间延长，小脂粒逐渐聚集成较大的
脂肪粒，脂肪细胞数逐渐增多。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
图 1 人羊膜间充质干细胞体外成脂分化细胞形态(油红 O 染色，200 ×)
2 3 AFM对 hAMSCs诱导前后形貌的观察
用 AFM对 hAMSCs 诱导前后的细胞做全貌以
及 5 μm的超微结构扫描，结果如图 2 所示。图 2-A
是诱导前细胞的全貌图，呈长梭形，细胞长度大于
100 μm，图 2-B 为诱导后细胞的全貌图，可见细胞
呈多边形，且细胞长度减小，伪足明显，图 2-C 是诱
导前细胞表面的超微结构，可见细胞表面均匀地分
布大小不一的颗粒，是细胞膜表面蛋白质、脂、糖等
聚集物。利用 IP2 1 分析软件对其进行测量，得到
超微结构参数值如下:高低差(Rp-v)为(163 46 ±
60 9)nm、均方根粗糙度(Rq)为(43 32 ± 18 61)nm、
平均粗糙度(Ra)为(35 27 ± 16 22)nm、平均高度
(Meant Ht)为(332 12 ± 34 23)nm。图 2-D为图 2-C
表面颗粒的分布图，其颗粒大小主要分布在300 － 400
nm之间，图 2-E为分化后细胞表面的超微结构，有
类似脂滴的颗粒，经分析，Rp-v 为(405 28 ± 68 05)
nm、Rq 为(119 55 ± 17 89)nm、Ra 为(102 32 ±
15 27)nm、Meant Ht为(484 45 ± 43 31)nm。图2-F
为图 2-E 表面颗粒的分布图，其颗粒大小主要分布
在 400 － 700 nm之间。图 2-G为诱导前后表面超微
结构参数的比较，诱导后超微结构的参数值都有所
增加。
2 4 AFM对 hAMSCs诱导前后力学性质分析
细胞膜表面的力学性质与人的健康，疾病的治
疗和诊断有关，因此有必要对细胞膜的机械性质进
行分析。原子力显微镜微悬臂自由端的探针接近、
压入样品表面，然后脱离样品，此过程 AFM 测量并
记录针尖所感受的力，从而得到力曲线。原子力显
微镜在细胞膜表面获得的每条力曲线都是系统自动
测量 15 次得到的平均值。本试验测量 20 个细胞，
每个细胞测量 5 个不同的区域，测量的区域为
2 μm × 2 μm，并进行统计。图 3-A hAMSCs与针尖
的相互作用的力曲线示意图，可见力曲线较规则，图
3-B诱导后细胞与针尖的相互作用的力曲线示意
图，通过细胞力曲线图，还可得到细胞膜表面的粘弹
力和硬度。力曲线是退针时的斜率，即细胞的粘弹
力 /距离的比例值。由图 3 可知，诱导后细胞的粘弹
力增大，硬度减小。
3 讨论
羊膜中的 MSCs 存在于羊膜间质中，需要用酶
消化法解离细胞间质。酶消化法分离出的羊膜细胞
是上皮细胞、间充质干细胞、成纤维细胞等多种细胞
的混合物。必须经过一定的方法使细胞得到逐步的
纯化［21］，才能对其进行更深入的研究及临床应用。
在细胞培养过程中，可通过全量换液，逐渐去除未贴
壁细胞;在传代过程中，对于贴壁细胞，可根据其黏
附能力的不同，通过调整胰蛋白酶的消化时间，保证
hAMSCs在短暂的时间内与培养皿底分离，而其他
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2010 年第 6 期 陈茜等:原子力显微镜对人羊膜间充质干细胞成脂分化的观察
A. hAMSCs的形貌图;B.成脂分化后形貌图;C.羊膜间充质干细胞的超微结构图;D.成脂分化后超微结构图;E. hAMSCs颗粒大小
分布;F.成脂分化后颗粒大小分布;G.颗粒参数比较
图 2 人羊膜间充质干细胞分化前后形貌及超微结构图
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
A. The force-curver of human amniotic mesenchymal stem
cells;B. The force-curver of liopblast-differentiating cells
图 3 AFM针尖 －细胞力测量结果
的杂细胞仍然贴附于培养皿底，从而使 hAMSCs 逐
步纯化。本试验通过流式细胞术检测细胞表面抗原
分子，结果表明，不表达造血干细胞表面抗原 CD34，
CD45，也不表达人白细胞抗原 HLA-DR，而在骨髓
间充质干细胞中高表达的的 CD29，CD90，hAMSCs
也同样呈现高表达，说明 hAMSCs 与骨髓 MSCs 有
相似的表面标志分子。
通过油红 O 染色可见细胞胞质中有大小不等
的圆性红色脂肪滴，说明 hAMSCs能够在体外定向
诱导成为脂肪细胞。用 AFM对 hAMSCs 诱导前后
细胞成像，发现无论是全貌还是超微结构都发生
了变化，并惊奇地发现细胞表面有类似于脂滴的
颗粒。
细胞膜表面的力学性质与人的健康，疾病的治
疗和诊断有关，因此有必要对细胞膜的机械性质进
行分析。本研究利用原子力显微镜高分辨的特点可
以清晰观察到人羊膜间充质干细胞分化前后形貌以
及超微结构的差异，并在细胞表面做力曲线，通过分
析力曲线而得到细胞的粘弹力与硬度大小，得知
hAMSCs在分化后粘弹力增加，硬度减小，引起该差
异的主要原因是分化后细胞表面存在大量脂滴。
4 结论
羊膜间充质干细胞同骨髓间充质干细胞有相似
的表面标志分子，也同样可以通过体外诱导定向分
化成脂肪细胞，有望成为细胞移植和组织工程的一
种新型种子细胞，但两者的分离方法存在一定的差
异［23］，故要针对不同的间充质干细胞采用不同的分
离方法。目前，关于间充质干细胞在体外诱导分化
的报道甚多，但其主要来自骨髓，而关于羊膜来源的
间充质干细胞诱导分化的报道则甚少，本试验借助
AFM对人羊膜间充质干细胞分化过程进行可视化
的研究，不仅为全面了解 hAMSCs分化提供依据，也
将有助于推动 AFM 在生物医学和临床医学领域的
应用。
AFM 的细胞形态学研究与临床研究将越来越
紧密，应用前景将越来越广阔［24］。AFM 可以清晰
观察到人羊膜间充质干细胞分化前后形貌以及超微
结构的差异，且能测量细胞表面的机械性质;试验过
程样品处理简单，对细胞的损伤小，成像直观，分辨
率高，展示了 AFM具有其他细胞表面形貌观察方法
所无法比拟的优越性。
参 考 文 献
［1］Int Anker PS，Scherjon SA，Kleijburg-van der Keur C，et al Isolation
of mesenchymal of fetal or maternal origin from human placen-
ta Stem Cells，2004，22(7) :1-338
［2］ Hipp J，Atala A Sources of stem cells for regenerative medi-
cine Stem Cell Reviews，2008，4(1) :3-11
［3］Rao MS，Mattson MP Stem cells and aging:expanding the possibili-
ties Mech Ageing Dev，2001，122(7) :713.
［4］Cai XF，Gao SJ，Cai JY，et al Artesunate induced morphological and
mechanical changes of jurkat cell studied by AFM  Scanning，2009，
(39) :83-89
［5］Hu MQ，Wang JK，Cai JY. Nanostructure and nanomechanics analy-
sis of lymphocyte using AFM:From resting，activated to apopto-
sis Journal of Biomechanics，2009，42:1513-1519
［6］Müller DJ，Dufrêne YF. Atomic force microscopy as a multifunctional
molecular toolbox in nanobiotechnology Nat Nanotechnol，2008，3:
261-269.
［7］Parot P，Dufrene YF，Hinterdorfer P，et al Past，present and future of
Atomic force microscopy in life sciences and medicine J Mol Recog-
nit，2007，20(6) :418-431
［8］Wu YZ，Cai JY，Cheng LQ，et al Atomic force microscope tracking
observation of Chinese hamster ovary cell mitosis  Micron，2006，37
(2) :139-145
［9］Hu MQ，Wang JK，Cai JY，et al Analysis of Sodium Benzoate Biotox-
icity using Atomic Force Microscope Chinese Journal of Biotechnolo-
051
2010 年第 6 期 陈茜等:原子力显微镜对人羊膜间充质干细胞成脂分化的观察
gy，2008，24(8) :1428-1432
［10］Hinterdorfer P，Dufrene YF Detection and localization of single mo-
lecular recognition events using atomic force microscopy Nat Meth-
ods，2006，3(5) :347-355
［11］Barattin R，Voyer N Chemical modifications of AFM tips for the
study of molecular recognition events  Chem Commun，2008，
(13) :1513-1532
［12］Evans EA，Calderwood DA Forces and bond dynamics in cell adhe-
sion  Science，2007，316(5828) :1148-1153
［13］Yoshiaki S，Pablo P，Masayuki A，et al Chemical identification of
individual surface atoms by atomic force microscopy  Nature，2007，
446(7131) :64-67
［14］Crick SL，Yin FCP Assessing micromechanical properties of cells
with atomic force microscopy: importance of the contact
point Biomech Model Mechanobiol，2007，6(3) :199-210
［15］Suresh S Biomechanics and biophysics of cancer cell  Acta Bioma-
terialia，2007，3(4) :413-438
［16］Balint Z，Krizbai IA ，Wilhelm I，et al Changes induced by hyper-
osmotic mannitol in cerebral endothelial cells:an atomic force mi-
croscopic study Eur Biophys J，2007，36(2) :113-120.
［17］Li QS，Lee GYH，Ong CN，et al AFM indentation study of breast
cancer cells  Biochemical and Biophysical Research Communica-
tions，2008，374(4) :609-613
［18］Hsieh CH，Lin YH，Lin S，et al Surface ultrastructure and mechani-
cal property of human chondrocyte revealed by atomic force micros-
copy Osteoarthritis Cartilage，2008，16(4) :480-488
［19］Avci R，Schweitzer M，Boyd RD，et al Comparison of antibody-anti-
gen interactions on collagen measured by conventional immunologi-
cal techniques and atomic force microscopy  Langmuir，2004，20
(25) :11053-11063
［20］Hu MQ，Wang JK，Cai JY，et al Nanostructure and force spectros-
copy analysis of human peripheral blood CD4 + T cells using atomic
force microscopy Biochemical and Biophysical Research Communi-
cations，2008，374(1) :90-94
［21］李国喜，杨波，关方霞，等  人羊膜来源间质干细胞的分离、培
养及鉴定  郑州大学学报:医学版，2006，3(2) :244-247
［22］Miki T，Strom SC Amnion-derived pluripotent /multipotentstem cells.
Stem Cell Rev，2006，2(2):133-142
［23］Anker PS，Scherjon SA，Keur C，et al Isolation of mesenchymal
stem cells of fetal or maternal origin fromhuman placenta Stem
Cells，2004，22(7) :1338-1345
［24］Brochu H，Vermette P Young’s moduli of surface － bound lipo-
somes by atomic force microscopy force measurements  Langmuir，
2008，24(5) :
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
2009-2014
(上接第 141 页)
［7］Feuring-Buske M，Frankel AE，Richard L，et al. A diphtheria toxin-
interleukin 3 fusion protein is cytotoxic to primitive acute myeloid
leukemia progenitors but spares normol progenitors. Cancer Re-
search，2002，62(6) :1730-1736.
［8］Batra JK，Fitzgerald DJ，et al. Single-chain immunotoxins directed
at the human transferrin receptor containing pseudomonas exotoxin
A or diphtheria toxin:anti-TFR(Fv)-PE40 and DT388 -Anti-TFR
(Fv). Molecular and Cellular Biology，1991，11:2200-2205 .
［9］Siegall CB，Chaudhary VK，FitzGerald DJ，et al. Functional analysis of
domains Ⅱ，Ⅰ b，and Ⅲ of Pseudomonas exotoxin. J Biol Chem，
1989，264(24) :142562-14261.
151