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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
人乳头瘤病毒 L1 基因与丹毒丝菌 SpaA-N优势抗原
表位序列的嵌合重组质粒构建及活性鉴定
庆格乐图 杨薇薇 晏鹏飞 苏幼红 李江伟
(新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046)
摘 要: 为确定丹毒丝菌表面保护性抗原 A 的 N-末端(SpaA-N)优势抗原表位，研发新型表位 DNA 嵌合疫苗，利用生
物信息学软件对丹毒丝菌 SpaA-N的优势 B细胞抗原表位进行预测，以重叠 PCR将优势表位插入人乳头瘤病毒 16 型的主要
衣壳蛋白(HPV-16 L1)HI环结构的编码序列中，构建获得重组嵌合质粒 pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA。该重组质粒经体内、外瞬时
转染后，RT-PCR均扩增获得了 1 500 bp左右的目的片段。免疫印迹试验显示，体外转染嵌合质粒的细胞总蛋白能够与 GST-
SpaA-N重组蛋白免疫血清在 56 kD处产生特异性结合。ELISA分析显示嵌合质粒可在小鼠体内产生差异显著的特异性抗体
(P ＜ 0. 01) ，抗体滴度为 1∶ 1 000。此外，pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA制备的抗血清至少可在 1∶ 10 稀释度条件下，介导外源补体对
半数以上的菌体进行杀伤。该研究表明，获得的 SpaA-N表位 DNA嵌合疫苗具有免疫活性，为研发安全有效的丹毒丝菌新型
DNA疫苗提供了一个新思路。
关键词: 丹毒丝菌 SpaA-N 表位预测 HPV-16 L1 嵌合质粒 瞬时表达 杀菌活性
Construction and Active Identification of Recombinant Plasmid with
Chimeric Human Papillomavirus Type 16 L1 Expressing an
Epitope of Erysipelothrix rhusiopathiae SpaA-N
Qinggeletu Yang Weiwei Yan Pengfei Su Youhong Li Jiangwei
(Key Laboratory of Molecular Biology，Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic
Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046)
Abstract: To comfirm the B cell epitope of N-terminal of surface protective antigen A(SpaA-N)from Erysipelothrix rhusiopathiae
and develop an efficient DNA vaccine ，an experimental DNA plasmid was constructed based on the predicted B cell epitope derived
from SpaA-N，and then the predominant epitope was inserted into the coding sequence of human papillomavirus type 16 major capsid
protein (HPV-16 L1)HI loop by overlap PCR． pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA were transfected in vitro and in vivo，the results of RT-PCR
showed that the 1 500 bp round products were amplified，while Western blotting illustrated the total proteins of cells which transfected
pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA plasmid can bound with mouse against GST-SpaA-N antiserum at 56 kD specifically． Antiserum from mice
immunized with pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA showed could bind to SpaA-N recombinant protein in ELISA detection，and the titer of anti-
body was 1∶ 1 000 (P ＜ 0. 01)． In addition，in vitro bactericidal assay showed the antiserum from pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA immunized
mice mediated efficient killing of Erysipeolothrix rhusiopathiae by addition of complements at lest in dilution of 1∶ 10． This results indica-
ted that the DNA vaccine with chimeric human papillomavirus L1 expressing an epitope of SpaA could induce efficient immune response
to Erysipeolothrix rhusiopathiae infection in mouse，and provided a selective strategy for developing a safer and more efficient DNA vac-
cine to control Erysipeolothrix rhusiopathiae infection．
Key words: Erysipeolothrix rhusiopathiae SpaA-N Epitope prediction HPV-16 L1 chimeric plasmid Transient expression
Bactericidal assay
收稿日期:2011-03-21
基金项目:新疆自治区高校科研计划重点项目(XJEDU2005105)
作者简介:庆格乐图，男，硕士研究生，研究方向:感染与免疫;E-mail:qgle@ qq． com
通讯作者:李江伟，男，副教授，研究方向:肿瘤免疫学;E-mail:lijiangwei67@ gmail． com
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
丹毒丝菌(Erysipeolothrix rhusiopathiae)为革兰
氏阳性菌，是导致猪、牛和羊等动物丹毒病症的病原
菌。猪及其他动物感染后，常引发慢性多发性关节
炎、心内膜炎和败血症等，使世界各地的畜禽生产遭
受巨大经济损失［1］。目前国内外主要采用减毒疫
苗和灭活疫苗对丹毒爆发进行预防和控制，但这类
减毒疫苗仍存在较大的安全性问题，为此研发安全
可靠的新型丹毒丝菌疫苗具有重要意义。近年来研
究表明，丹毒丝菌表面保护性抗原 A 氨基端(N-ter-
minal of surface protective antigen A，SpaA-N) ，具有
强免疫保护性，对不同血清型丹毒丝菌具有交叉免
疫保护效应，可作为抗丹毒丝菌感染的最佳亚单位
疫苗候选抗原［2 － 4］。但是，蛋白疫苗的研制，涉及
表达系统优化和表达产物纯化，工序较繁琐，周期较
长，免疫动物时所添加的外源佐剂还可能对机体产
生副作用。而基于抗原表位的 DNA重组疫苗，不仅
能有效诱导免疫应答，减少免疫无关冗余序列产生
干扰，而且还具备安全、稳定、制备方便、成本低廉等
优势，目前已有多种 DNA疫苗获批上市［5］。由于表
位 DNA一般较短(仅编码 8 －10个氨基酸) ，易降解，
故需嵌合递送载体。有研究表明人乳头瘤病毒主要
衣壳蛋白 L1(human papillomavirus type 16 major cap-
sid protein，HPV-16 L1)可在体内外自我装配形成病
毒样颗粒，具有潜在的抗原载体效应，有可能增强表
位 DNA疫苗诱导的免疫应答［6 － 8］。
为此，本研究拟通过生物信息学软件预测
SpaA-N优势 B 细胞抗原表位，构建 SpaA-N 优势表
位嵌合 HPV-16 L1 的 DNA疫苗，免疫小鼠并分析表
位 DNA嵌合疫苗的免疫活性，为研发安全有效的新
型 DNA 疫苗用于预防和控制丹毒丝菌感染提供
借鉴。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种质粒及主要试剂 丹毒丝菌 XJ1249 购
自国家菌种保藏中心;大肠杆菌 DH5α，TOP10 菌株
及重组质粒 pcDNA3-HPV-16 L1(该质粒包含编码
人乳头瘤病毒的 16 型主要衣壳蛋白的基因片段，体
外转染细胞能够形成病毒样颗粒，VLP)均为本实验
室保存;Trizol试剂，购自 Invitrogen 公司。pMD18-T
simple vector为 TaKaRa公司产品。Ex Taq 酶、AMV
酶、T4 DNA连接酶及 Xho I，Hind III 等限制性内切
酶为 TaKaRa 公司产品;DNA 回收试剂盒购自天根
生物有限公司;羊抗鼠 HRP-IgG 为博奥森公司提
供;NC膜为 Minipore公司产品;丹毒丝菌 XJ1249 表
面抗原 A氨基端融合蛋白(GST-SpaA-N)为本实验
室自制［4］。
1. 1. 2 试验动物 4 － 6 周龄雌性昆明白小鼠购自
新疆医科大学动物实验中心。
1. 2 方法
1. 2. 1 SpaA-N优势 B细胞抗原表位预测 利用生
物信息学软件 DNASTAR，分别以 Garnier-Robson 法和
Chou-Fasman 法对长为 320 个氨基酸的丹毒丝菌
XJ1249株表面 SpaA-N二级结构进行预测［9］，分析其柔
韧性区域;以 Hopp-woods法和 Emini 法分析其亲水性
和表面可及性［10］;最后以 Jameson-Wolf 法预测其抗原
性指数［11］，综合上述分析预测丹毒丝菌 XJ1249SpaA-N
潜在的抗原优势表位，并命名为 ΔSpaA。
1. 2. 2 重叠 PCR扩增 HPV-16 L1-ΔspaA 嵌合基因
通过重叠 PCR将 SpaA-N优势抗原表位 ΔSpaA序
列插入 HPV-16 L1 第 359 位和 360 位氨基酸编码序
列之间(即第 1077 和 1078 位核苷酸间)。重叠
PCR引物设计如图 1 所示，以 ΔspaA 为引物重叠部
分设计两套引物用于扩增 HPV-16 L1-ΔspaA全长片
段，并于该片段的 5端和 3端分别引入 Hind III 和
Xho I酶切位点，引物序列见表 1，下划线表示酶切
位点。PCR 反应策略，首先以 P1 和 yspa1 扩增
HPV-16 L1(A)片段，yspa2 和 P2 扩增 HPV-16 L1
(B)片段，再以 HPV-16 L1(A)及 HPV-16 L1(B)
片段的混合物为模板扩增 HPV-16 L1-ΔspaA 全
长。反应程序:95℃预热 5 min;95℃变性 30 s，
60℃退火 30 s，72℃延伸 2 min;35 个循环后，72℃
反应 7 min。重叠 PCR 扩增产物，连接 pMD18-T
载体后送测序。
图 1 重叠 PCR引物设计策略
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庆格乐图等:人乳头瘤病毒 L1 基因与丹毒丝菌 SpaA-N优势抗原
2011 年第 10 期 表位序列的嵌合重组质粒构建及活性鉴定
表 1 重叠 PCR扩增 HPV-16 L1-ΔspaA的引物
引物名称 引物序列(5 － 3)
P1 CCAAGCTTACATGCAGGTGACTTTTATT
P2 CCCAAGCTTACATGCAGGTGACTTTTATT
yspa1 CTCTACTTTAGAATCACTTTCTTCGTTAGTATTTT-
TATATGTAG
yspa2 GAAGAAAGTGATTCTAAAGTAGAGTTTAAGGAG-
TACCTACGAC
1. 2. 3 嵌合质粒 pcDNA3-HPV-16 L1-ΔspaA 的构
建 pMD18-T-HPV-16 L1-ΔspaA 经测序鉴定后，亚
克隆至 pcDNA3 真核表达质粒，转化 E． coli(TOP10)
感受态细胞，0. 1%氨苄青霉素抗生素筛选阳性克
隆，以 Hin dⅢ及 XhoⅠ进行双酶切，1%琼脂糖凝胶
电泳鉴定。
1. 2. 4 嵌合质粒体内外瞬时表达检测 采用 Lipo-
fectamine 2000 (Invitrogen，USA)试剂盒，将重组质
粒瞬时转染 293T 细胞。分别设 pcDNA3-HPV-L1-
ΔspaA组和空载质粒 pcDNA3 组。在 6 孔细胞培养
板孔内接种 293T 细胞，接种量为 1 × 106细胞 /孔，
以含 10% FBS的 DMEM培养基 37℃培养 36 h，转染
前将细胞培养基换为无血清的 DMEM 培养基。取
4 μg 嵌合体质粒 DNA 及 10 μL Lipofectamine，均以
250 μL 无血清 DMEM 培养基进行稀释后混合。在
6 孔板中加入 DNA-Lipofectamine 混合物，轻摇混
匀，于 37℃、5%CO2培养箱中培养 4 － 5 h 后更换为
生长培养基继续培养 48 － 72 h。收集转染后的细
胞，按照文献［12］，TRIZOL 法同时提取细胞总 RNA
和细胞总蛋白。将 RNA 反转录成 cDNA 后 PCR 扩
增。提取的细胞总蛋白，经离心(10 000 r /min，
4℃，10 min)并浓缩后，按常规进行蛋白定量，并用
上样缓冲液稀释至 2 500 μg /mL 后进行 SDS-PAGE
电泳，再经湿式电转转印至 NC 膜上，依次孵育一抗
和二抗进行免疫印记分析。一抗用 SpaA-N 重组蛋
白免疫血清(1∶ 1 000) ，二抗为 HRP 标记的羊抗鼠
IgG(1∶ 5 000)。
按照文献［13］的方法在高压下通过小鼠尾静
脉转染25 μg pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA 质粒，12 h 后
处死转基因小鼠。剪碎肝细胞，用 TRIZOL 法提取
细胞总 RNA，并将 RNA 反转录成 cDNA 后，PCR 扩
增目的基因 HPV-16 L1-ΔspaA。同时设空载质粒
pcDNA3 的对照组，同法转染 25 μg质粒。
1. 2. 5 小鼠抗血清的制备 嵌合质粒 pcDNA3-HPV-
16 L1-ΔspaA免疫小鼠制备抗血清，另设 pcDNA3-HPV-
16 L1阴性对照免疫组和生理盐水空白免疫组，每组
10 只小鼠。免疫方式为大腿内侧肌肉多点注射，免
疫剂量为 100 μg 质粒 /小鼠，每 10 d 加强免疫一
次，共进行 5 次免疫。每次免疫前一天及终免 14 d
后收集各组小鼠的免疫血清，－ 20℃保存备用。同
时，制备抗 GST-spaA-N 重组蛋白小鼠抗血清，用于
检测嵌合质粒 pcDNA3-HPV-16 L1-ΔspaA 瞬时转染
293T细胞的蛋白表达情况及体外杀菌试验，共免疫
5 只小鼠，参照文献［4］进行免疫。
1. 2. 6 间接 ELISA 检测免疫血清特异抗体水平
以 GST-SpaA-N重组蛋白为抗原，间接 ELISA检测嵌
合质粒免疫小鼠抗血清中特异抗体水平。碳酸盐包
被缓冲液将 GST-SpaA-N 重组蛋白稀释至2 μg /mL，
4℃包被过夜。次日，3%BSA 37℃封闭 2 h，洗涤;再
以各组小鼠免疫血清的梯度稀释液为一抗 37℃孵
育 2 h，洗涤;最后以羊抗鼠 IgG-HRP 1∶ 5 000 稀释
液为检测二抗，TMB 显色，于 OD450处测定吸光值，
统计分析，比较各组小鼠免疫血清的特异抗体水平
差异。
1. 2. 7 免疫血清体外杀菌活性分析 参照文献方
法［14］，检测 SpaA-N 抗原特异抗体介导补体共同
参与对丹毒丝菌的体外杀伤效应。将各组免疫血清
灭活补体后(56℃，30 min) ，PBS 梯度稀释，以
100 μL /孔加入 96 孔板中，与丹毒丝菌 XJ1249 菌悬
液 25 μL /孔(约含 1 000 CFU)混匀后，再添加外源
补体，37℃共孵育 1 h。最后计算各孔存活丹毒丝菌
CFU，比较各组免疫血清的杀菌活性。各稀释度血
清样品均设 3 个平行孔，同时设外源补体对照孔。
杀伤效应在 50%以上被认为具有杀菌活性。
2 结果
2. 1 SpaA-N优势 B细胞抗原表位预测
利用 DNASTAR 生物信息学软件对丹毒丝菌
XJ1249 SpaA-N蛋白 B细胞优势抗原表位预测结果
如下:以 Hopp-woods 法分析显示 SpaA-N 的 245 －
263、268 － 278 和 290 － 310 区段具有较高亲水性，
提示这些区域暴露于表面的几率较大;Emini 法分
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
析认为 SpaA-N中 269 － 277 和 295 － 310 区段的表
面可及性较高;Jameson-Wolf 法预测其抗原性指数
较高的区域有 196 － 216、222 － 236、245 － 263、269 －
280、290 － 310，提示这些区段含有潜在抗原表位;综
上分析显示，269 － 277 及 295 － 310 区段可能为优
势表位，但由于 Garnier-Robson法和 Chou-Fasman法
预测的 SpaA-N二级结构结果中，265 － 284 为 β 片
层，290 － 295 为 α 螺旋，不利于抗原表位展示。因
此，综合上述预测及分析结果选择位于 295 － 302 区
段的 8 个氨基酸残基 EESDSKVE 作为 SpaA-N 的 B
细胞优势抗原表位。
2. 2 嵌合质粒 pcDNA3-HPV16-L1-ΔspaA的构建
通过重叠 PCR将 SpaA-N优势抗原表位 ΔSpaA
序列嵌合入 HPV-16 L1，测序结果显示成功扩增获
得全长为 1 539 bp 的 HPV-16 L1-ΔspaA 基因片段，
与理论值大小一致。随后，将其亚克隆至 pCDNA3
真核表达质粒，HindⅢ 和 XhoⅠ双酶切鉴定重组阳
性克隆，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 2 所示，双酶
切后出现与预期结果一致的条带，表明成功构建获
得重组嵌合质粒 pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA。
M． DL15000;1，2． Hind Ⅲ＆ XhoⅠ双
酶切 pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA
图 2 pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA的酶切鉴定结果
2. 3 嵌合质粒瞬时表达检测
将 pcDNA3-HPV3-L1-ΔspaA 通过脂质体转染
293T细胞，提取的细胞总 RNA进行 RT-PCR。结果
显示，扩增获得了 1 500 bp 左右的目的条带。生理
盐水、pcDNA3 转染细胞和用 β-actin 扩增 pcDNA3-
HPV-L1-ΔspaA 转染的 RT-PCR 结果均无此条带
(图 3)。
M． DL5000;1． RT-PCR扩增生理盐水总 RNA;2． RT-PCR
扩增 pcDNA3 总 RNA;3．通过 P1＆P2 引物 RT-PCR扩增
pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA 总 RNA ;4． 通过 β-actin 引物
RT-PCR扩增 pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA总 RNA
图 3 RT-PCR检测质粒 pcDNA3-HPV-
16 L1-ΔspaA的体外表达
Western blotting 结果(图 4)显示，嵌合质粒
pcDNA3-HPV-16 L1-ΔspaA 转染 293T 细胞后，其
细胞总蛋白能够与 GST-SpaA-N 特异性抗血清在
56 kD左右处发生特异结合反应，与理论预测值
相符;阳性对照 GST-SpaA-N 重组蛋白在 65 kD
处有一条特异性条带，与其蛋白大小相符;空质
粒 pcDNA3 转染 293T 细胞后，细胞总蛋白未检
测到条带。
M．蛋白质 Marker(14 － 94 kD) ;1． GST-SpaA-N 重组蛋
白;2．转染 pcDNA3-HPV- L1-ΔspaA 的 293 T 细胞总蛋
白;3．转染 pcDNA3 的 293 T 细胞总蛋白;
图 4 Western blotting检测嵌合质粒 pcDNA3-HPV-
L1-ΔspaA在 293T细胞中蛋白水平的表达情况
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庆格乐图等:人乳头瘤病毒 L1 基因与丹毒丝菌 SpaA-N优势抗原
2011 年第 10 期 表位序列的嵌合重组质粒构建及活性鉴定
为了确定水动力转染的嵌合质粒 pcDNA3-HPV-
L1-ΔspaA在小鼠体内是否转录，转染 12 h 内断髓处
死小鼠，取肝脏按 Trizol方法提 RNA，RT-PCR检测目
的基因在 mRNA水平上的转录。结果(图 5)显示特
异性引物 P1、P2扩增获得了 1 500 bp 左右的目的条
带。而 pcDNA3转染的细胞和内参照 β-actin 扩增均
无此目的条带。
M． DL5000;1． RT-PCR 阴性对照;2． RT-PCR 扩增
pcDNA3 总 RNA;3． 通过 P1＆P2 引物 RT-PCR 扩增
pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA总 RNA;4．通过 β-actin引物
RT-PCR扩增 pcDNA3-HPV- L1-ΔspaA 总 RNA;5． 通
过 P1＆P2 引物 PCR扩增 pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA总
RNA;6． PCR 阴性对照;7． PCR阳性对照
图 5 pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA在小鼠肝
细胞中瞬时表达 RT-PCR检测
2. 4 嵌合质粒免疫血清特异抗体水平检测
pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA免疫小鼠后，可激发产
生特异性抗体，抗体滴度达 1 ∶ 1 000，而 pcDNA3-
HPV-16 L1 阴性对照免疫组和生理盐水空白免疫组
的小鼠免疫血清中均检测不到特异性抗体(数据未
显示)。统计分析(图 6)显示，在 1∶ 100 血清稀释度
下，嵌合质粒免疫血清的抗原特异抗体水平与阴性
血清及空白血清相比，具有显著差异(P ＜ 0. 01)。
图 6 ELISA检测各免疫血清特异抗体水平
2. 5 抗体的体外杀菌活性分析
嵌合质粒免疫血清的体外杀菌活性检测结果
(图 7)显示 pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA 免疫抗血清可
在 1∶ 10 稀释度产生半数以上丹毒丝菌的杀伤效应，
与 pcDNA3-HPV-16 L1 免疫血清相比，具有显著杀
菌效果。而 GST-SpaA-N 蛋白免疫阳性血清可在
1∶ 1 000 稀释度杀伤半数以上的丹毒丝菌。
图 7 免疫血清的杀菌活性分析
3 讨论
目前，我国对丹毒丝菌感染的预防和控制仍依
赖于传统的灭活疫苗及减毒疫苗，存在较大的安全
问题。近几年，Shimoj 等［3］研究者制备的 SpaA-N
亚单位疫苗显示出对丹毒丝菌感染小鼠有完全的免
疫保护力，我们的前期试验也证实 SpaA-N 重组蛋
白免疫小鼠后可产生特异抗体抵御丹毒丝菌感
染［4］。为了进一步确定 SpaA-N 区段中的优势抗原
表位，构建新型表位嵌合 DNA 疫苗，用于有效诱导
抗丹毒丝菌感染免疫应答，本研究通过生物信息学
软件预测了 SpaA-N 区段二级结构，并对 SpaA-N 各
区段抗原性参数进行综合评测，结果显示位于295 －
302 区段的 8 个氨基酸残基 EESDSKVE 是 SpaA-N
的潜在 B细胞优势抗原表位，并以重叠 PCR将其嵌
合至 HPV-16 L1 的 HI环编码序列中。由于 HPV-16
L1 表面有 3 个主要环结构 DE111 － 151，FG257 － 298以及
HI349 － 359，将外源短肽段插入这三个环中，可在不破
坏 HPV-16 L1 自我装配成病毒样颗粒的同时，将外
源肽段展示于其表面，诱导机体产生强烈的表位特
异免疫反应。Slupetzky 等研究也表明将 HIV gp41-
的 B细胞表位肽段插入 HPV-16 L1 内，可显著提高
该表位的免疫原性，所产生的抗体具有较强的病毒
中和活性［9］。
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本研究利用 HPV-16 L1 具有展示外源抗原短
肽增强免疫应答效应的特性，及核酸疫苗研制方
便等优势，构建了 SpaA-N 抗原表位嵌合 HPV-16
L1 的 DNA疫苗 pcDNA3-HPV-L1-Δ spaA。表位嵌
合疫苗免疫小鼠后可激发产生抗原特异抗体，且
产生的抗体可介导外源补体对丹毒丝菌产生杀伤
效应。该结果表明构建获得的 SpaA-N 表位嵌合
DNA疫苗具有免疫活性，不仅克服了蛋白疫苗研
制效率低等缺陷，也证实可有效诱导免疫应答，可
为研发新型表位 DNA疫苗用于防控感染性疾病提
供参考。
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(责任编辑 狄艳红)
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