全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
效应分子 Map、EspF在致病性大肠杆菌
致细胞线粒体功能障碍中的作用
杨健 朱红 任碧轩
(川北医学院免疫学与分子生物学研究室 ,南充 637007)
　　摘 　要 : 　用自杀质粒、基因等位交换方法构建致病性大肠杆菌 ( EPEC)效应分子 Map或 EspF缺失删除株Δmap、ΔespF
和Δmap espF,并用 PCR和蛋白印迹技术 (W estern blot)对删除株进行鉴定 ;用线粒体膜电位 (MMP)检测试剂盒 (JC21)检测删
除株感染 HeLa细胞后细胞 MMP改变。试验结果表明 ,Δmap、ΔespF和Δmap espF等删除株成功构建 ,效应分子 Map和 EspF
可以单独或协同引起细胞线粒体功能障碍。
关键词 : 　等位交换 删除株 线粒体膜电位 线粒体功能障碍
The Effect of Map and EspF in M itochondr ia l Dysfunction of Cells
Infected by Enteropathogen ic Escherich ia coli
Yang J ian Zhu Hong Ren B ixuan
(Departm ent of Imm unology and M olecular B iology, N orth S ichun M edical College, N anchong 637007)
　　Abs trac t: 　The effectorMap or EspF deficient mutantsΔmap, andΔespF, and double effectors deficient mutantΔmap espF of en2
teropathogenic Escherich ia coli were constructed by allelic exchange and identified by PCR and W estern blot. The changes of m itochon2
dria membrane potential (MMP) was detected with the kit JC21 forMMP after infection HeLa cellswith these deficientmutants. The re2
sults showed that the mutantsΔmap,ΔespF andΔmap espF were constructed successfully, and Map and EspF induced m itochondrial
dysfunction singly and synergistically.
Key wo rds: 　A llelic exchange　Deficient mutant M itochondria membrane potential　M itochondrial dysfunction
收稿日期 : 2009204228
作者简介 :杨健 (19742) ,男 ,博士 ,副教授 ,研究方向 :致病性大肠杆菌致病机制研究 ; E2mail: yangjian 740811@163. com　　致病性大肠杆菌 ( enteropathogenic Escherich iacoli, EPEC)是发展中国家引起婴儿腹泻的一个重要病原体 ,也是导致粘附脱落损伤 ( attaching and ef2facing lesion, A /E)的革兰氏阴性肠道杆菌的重要成员之一 [ 1 ]。先前的研究发现 ,Map和 EspF分子转位以后都定位于宿主细胞线粒体 ,都具有引起线粒体功能障碍的作用 [ 2～3 ] ,为了进一步了解 Map 和EspF分子是否能完全解释 EPEC感染引起的线粒体功能障碍 ,本试验预构建 Map和 EspF单效应分子删除株和双效应分子删除株 ,并用其感染 HeLa细胞 ,用线粒体膜电位 (m itochondrial membrane po2tential, MMP)检测试剂盒 JC21检测细胞相对 MMP的改变 ,以探讨 Map和 EspF在 EPEC致宿主细胞线 粒体功能障碍中的作用。1 材料与方法111 材料HeLa细胞购自美国 ATCC (Cat. No. CCL2) ; EPEC野生型、III型分泌系统 ( T3SS)删除株Δcfm214由加拿大英属哥伦比亚大学生物化学研究室 Finlay教授惠赠 ;ΔespF、Δmap、Δmap espF由本试验构建 ;质粒pCVD4422Δmap、pCVD4422ΔespF 由本实验室构建保存 ;多功能酶标仪购自德国 BMG Labtech公司 ;核酸电泳仪、蛋白电泳仪购自美国 B io2Rad公司 ; MMP检测试剂盒 JC21购自美国Molecular p robe公司 ;抗EspF由本实验室免疫家兔制备 ;碱性磷酸酶标记羊抗兔二抗、底物 BC IP /NBT、三氯醋酸购自 NEB 公
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
司 ; 30%丙稀酰胺溶液、蛋白质 Marker购自 B io2Rad
公司 ;引物由 Invitrogen合成。
p1: 5′2CATTTCTCGGTTGTTGTTTA23′
p2: 5′2CTGTTTGTGAAGGTAGTGGC23′
p3: 5′2TGCAGCAAGAAACAGAAGAC23′
p4: 5′2AACCGTTACGACAACACCTC23′
112 方法
11211 ΔMap删除株的构建及 PCR鉴定 电转化自
杀质粒 pCVD4422Δmap到 SM10λp ir感受态细胞 ,用
含 50μg/m l氨苄青霉素平板筛选 ,得到 SM10λp ir/
pCVD4422Δmap。分别接种 SM10λp ir/pCVD4422Δmap
和 EPEC野生型菌株到含有 50μg/m l氨苄青霉素和
50μg/m l萘啶酸的 LB液体培养基中 37℃孵箱 200
r/m in过夜培养 ;次日 ,各取 100μl培养物 10 000 g离
心 30 s,弃去上清 ,用 100μl新鲜 LB液体培养基重悬
细菌并混匀 ,铺于不含抗生素的 LB固体平板 , 37℃孵
箱过夜培养 ;第 3天 ,取一环菌苔用分区划线接种细
菌到含有 50μg /m l氨苄青霉素和 50μg /m l萘啶
酸的 LB固体平板 ;第 4天 ,挑取单个菌落接种于
无抗生素的 LB液体培养基中 37℃孵箱 200 r/m in
过夜培养 ;第 5天 ,分别取 1、10、50、100μl过夜 LB
培养物铺于含有 5%蔗糖和 50μg/m l萘啶酸的 LB
固体平板上 30℃孵箱过夜培养 ;第 6天 ,挑取单个
菌落分别接种于含有 50μg/m l氨苄青霉素、50μg/
m l萘啶酸、25μg/m l卡那霉素的 LB固体平板上 ,
37℃孵箱过夜培养 ;第 7天 ,挑取对氨苄青霉素和那
霉素敏感 ,但对萘啶酸耐药的菌落用引物是 p1和 p2
做菌落 PCR鉴定。扩增条件 : 94℃总变性 5 m in,
接着 94℃ 1 m in, 58℃ 1 m in, 72℃ 1 m in, 30循环
后 , 72℃总延伸 10 m in,产物行 1%琼脂糖电泳
鉴定。
11212 ΔespF删除株的构建及 PCR鉴定 电转化
自杀质粒 pCVD4422ΔespF 到 SM10λp ir感受态细
胞 ,用 50 μg/m l 氨苄青霉素平板筛选 , 得到
SM10λp ir/pCVD4422ΔespF。以 EPEC野生型为受体
菌 ,ΔespF具体构建方法同前。用引物 p3和 p4对
删除株进行 PCR 鉴定 , 扩增条件 : 94℃总变性
5 m in,接着 94℃ 1 m in, 56℃ 1 m in, 72℃ 1 m in, 30
循环后 , 72℃总延伸 10 m in,产物行 1%琼脂糖电泳
鉴定。
11213 Δmap espF双效应分子删除株的构建及
PCR鉴定 以Δmap单效应分子删除株为受体菌 ,
用 SM10λp ir/pCVD4422ΔespF与其进行结合传递 ,
具体构建方法同前。分别用引物 p1和 p2、p3和 p4
鉴定 m ap和 espF基因的剔除情况 ,具体扩增条件
同前。
11214 W estern blot检测删除株 EspF的表达 　分
别接种 EPEC野生型、Δmap、ΔespF、Δmap espF到
含有 50μg /m l萘啶酸的 LB培养液 ,放置 37℃孵
箱静止过夜培养 ;次日 ,各取 50 μl接种到含有
50μg /m l萘啶酸的 DM EM 培养液中于 37℃、5%
CO2孵箱静止培养 6 h诱导分泌表达 , 12 000 g离
心 1 m in,弃去沉淀 ,收集细菌上清液 ,用终浓度为
10%三氯醋酸 ( TCA )于 4℃过夜沉淀上清液中蛋
白 ;次日 , 12 000 g离心 10 m in,小心并彻底移出三
氯醋酸 ,加入含 20%饱和 Tris2碱的 1 ×SDS上样缓
冲液煮沸样品 10 m in,上样做 W estern blot检测 EspF
的表达。用 12%的分离胶、5%积层胶做 SDS2PAGE,
电泳完毕后 ,湿转胶上蛋白到 NC膜 ,于 4℃用 5%脱
脂奶粉封闭 NC 膜过夜 , PBS漂洗 1 次后 ,加入
1∶2 000抗 EspF,室温孵育 1 h, PBS洗涤 5 m in ×3,加
入 1∶4 000稀释的碱性磷酸酶标记羊抗兔二抗 ,室温
孵育 1 h, PBS洗涤 5 m in ×3,加入底物 BC IP /NBT
显色。
11215 细胞培养及 JC21染色 HeLa细胞生长在
含有 10%灭活胎牛血清的 DMEM中 ,待细胞融合
到 90%左右时消化细胞 ,按 3 ×105个 /孔接种到
24孔板中 ,于 37℃, 5% CO2孵箱培养过夜。次日 ,
在 EPEC感染前 30 m in,充分溶解 JC21 到 37℃
DM EM中 , JC21的终浓度是 5μg /m l,吸干培养孔
培养液 ,加入 JC21 500μl /孔于培养箱避光染色 30
m in,用 37℃ PBS洗涤细胞 3 次 ,以去除剩余的
染料。
11216 试验分组及细菌的准备 　试验分为 EPEC
野生型感染组 ,Δcfm 214 感染组 ,Δmap 感染组 ,
ΔespF感染组和Δmap espF感染组。感染前 1 d,接
种相应细菌到含有 50μg/m l奈啶酸的 LB液体培养
液中 ,放置 37℃孵箱静止培养过夜 ,次日 ,检测过夜
培养的细菌的 OD (A600 )值 ,按 30μl /m l(A600 = 018)
接种细菌到含有相应抗生素的 DMEM中 ,于 37℃,
071
2009年第 10期 杨健等 :效应分子 Map、EspF在致病性大肠杆菌致细胞线粒体功能障碍中的作用
5% CO2的孵箱诱导培养 3 h后 ,吸去细胞培养液 ,按
细菌 /细胞 = 100 /1的比例感染经过 JC21 染色的
HeLa细胞 , 500 g离心培养板 5 m in,置于 37℃, 5%
CO2的孵箱感染 1 h。
11217 JC21检测Δmap espF对线粒体膜电位的影
响 感染 1 h以后 ,轻轻吸去培养液 ,缓慢加入 1 m l
37℃温育的 PBS,用多功能酶标仪检测红、绿通道荧
光 ,红、绿通道激发光 /吸收光分别为 540 /590 nm、
484 /520 nm。红绿荧光比值代表线粒体膜电位 ( R
表示 ) ,并以未感染组细胞线粒体膜电位为对照 (未
感染组作为 100% ) ,计算试验组细胞线粒体相对膜
电位。
线粒体相对膜电位 = (R试验 /R对照 ) ×100%
统计学处理采用 SPSS1510统计软件进行数据
分析 ,组间采用方差分析 ,组间多重比较采用 LSD2t
检验 , P < 0105为差异具有统计学意义。
2 结果与分析
211 Δmap删除株的 PCR鉴定结果
分别以 Δmap和 EPEC野生型为模板 ,用引物
p1和 p2进行扩增 ,结果显示 :从 EPEC野生型扩增
可以得到一个大约 1 500 bp左右的 DNA片段 ,而从
Δmap只能得到一个大小约 900 bp的 DNA片段 ,比
从野生型得到的扩增产物少 600 bp,与预计删除的
m ap基因片段大小相似 ,表明Δmap删除株构建成
功 (图 1)。
1.Δmap; 2. EPEC野生型 ; 3. DNA分子量标准
图 1　PCR检测 m ap基因
212 ΔespF删除株的 PCR鉴定结果
分别以ΔespF和 EPEC野生型为模板 ,用引物 p3
和 p4进行扩增 ,以 EPEC野生型为模板 ,扩增产物大
小约为 1 800 bp,而以ΔespF为模板的扩增产物为 1
300 bp左右 ,相差约 500 bp,与预计删除的 espF基因
大小相似 ,表明 espF基因被成功删除 (图 2)。
1. EPEC野生型 ; 2.ΔespF; 3. DNA分子量标准
图 2　PCR检测 espF基因
213 Δmap espF删除株的 PCR鉴定结果
用引物 p1和 p2,分别以Δmap espF和 EPEC野
生型为模板 ,可以得到大小约 900 bp、1 500 bp的
DNA片段 ,相差 600 bp,表明 m ap基因被剔除。而
用引物 p3和 p4,分别以Δmap espF和 EPEC野生型
为模板 ,可以得到大小约 1 300 bp、1 800 bp的 DNA
片段 ,两 DNA片段相差 500 bp ,表明 espF基因被剔
除 (图 3)。
1.Δmap espF ( p1、p2 ) ; 2. EPEC野生型 ( p1、p2 ) ; 3. EPEC野生型
(p3、p4) ; 4.Δmap espF (p3、p4) ; 5. DNA分子量标准
图 3　PCR检测 m ap和 espF基因
214 W estern blot检测删除株 EspF的表达
W estern blot检测结果表明 , EPEC 野生型和
Δmap可以分泌 EspF蛋白到上清液中 ,表明 espF基
因存在液染色质 ;而ΔespF删除株和Δmap espF删除
株不分泌表达 EspF,表明 espF基因被成功剔除 (图 4)。
171
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
图 4　W estern blot检测 EspF表达
215 Map和 EspF在 EPEC致 MMP下降中的作用
MMP检测发现 , EPEC野生型组、Δcfm214、Δmap、
ΔespF、Δmap espF等组细胞线粒体相对膜电位分别
为 (2812 ±510) %、(7917 ±512) %、(3610 ±611) %、
(4610 ±818) %、(5713 ±712) %;与 EPEC野生型组
比较 ,Δcfm214、Δmap、ΔespF、Δmap espF等组的删除
株功能皆有所减弱 (P < 0105) ;与Δmap、ΔespF相比 ,
Δmap espF的功能进一步减弱 ( P < 0105) ;但与Δcfm2
14比较 ,Δmap espF的功能则强于Δcfm214,差异具有
统计学意义 ( P < 0105) (图 5)。
图 5 M ap和 EspF对 MM P的影响
3 讨论与结论
致病性大肠杆菌 ( enteropathogenic Escherich ia
coli, EPEC)感染是一个重要的公共卫生问题。在婴
幼儿感染性腹泻中 , EPEC仅次于轮状病毒 ,与志贺
氏菌属感染率相接近 ,发病率大约占婴幼儿感染性
腹泻的 5% ～10% ,而且 ,越来越多的临床分离株表
现出对青霉素和头胞菌素耐药 [ 4～6 ]。
基因等位交换是一种非常有效的构建细菌删除
株的方法 [ 7 ] ,本试验采用的自杀质粒 pCVD442含有
氨苄青霉素抗性标记基因、结合传递基因、蔗糖敏感
基因 ,方便试验操作和对删除株的筛选。以 EPEC
野生型为受体菌 ,构建了 Δmap 和 ΔespF删除株 ,
PCR证实 m ap和 espF基因分别被剔除 ;以Δmap为
受体菌 ,构建 Δmap espF, PCR证实剔除了 m ap和
espF基因。W estern blot进一步证实 ,ΔespF和Δmap
espF删除株无 EspF蛋白分泌表达 ,表明Δmap espF
和ΔespF成功构建 ,由于没有抗 Map抗体 ,未能对
Δmap做 W estern blot鉴定。
线粒体作为细胞中一个重要的细胞器 ,在细胞
的能量代谢、细胞分化、信号转导、细胞死亡方面具
有重要的作用 [ 8 ]。代表线粒体功能改变的早期指
标是线粒体膜电位情况 , JC21是用于线粒体膜电位
检测的一种非常敏感的阳离子染料 ,在线粒体高能
量时 , JC21进入线粒体 ,以多聚体形式存在 ,表现为
红色 ;线粒体处于低电位时 , JC21则不能进入线粒
体 ,以单体形式存在 ,表现为绿色。整个过程具有可
逆性 ,通常用红绿比率来反应线粒体膜电位情况 ,从
而间接反应线粒体的功能情况 [ 9 ]。
EPEC感染肠道上皮细胞 ,除了引起典型的宿
主细胞黏附及擦拭性损伤 (A /E损伤 )外 ,还可以
造成线粒体功能障碍 ,从而导致感染的肠道上皮
细胞会出现相应的细胞功能障碍 ,如重吸收减少 ,
离子转运等。用线粒体膜电位试剂盒 JC21,结合
半定量的方法发现 ,与野生型相比 , M ap 和 EspF
可以单独造成一定程度的线粒体膜电位下降 ,并且
EspF的作用强于 Map,这与先前报道一致 [ 10, 11 ]。
Δmap espF双删除株感染发现 ,与单删除株相比 ,双
删除株的功能进一步下降 ,表明 Map和 EspF之间
具有协同作用 ,但与Δcfm214相比 ,Δmap espF双删
除株降低细胞 MMP功能更强 ,表明还有其他未知
的效应分子参与 EPEC 感染引起的线粒体功能
障碍。
综上所述 ,本研究构建了 EPEC效应分子 Map
和 EspF删除株 Δmap、ΔespF和 Δmap espF,发现
Map和 EspF除可以单独、也可协同作用引起线粒体
功能下降。
参 考 文 献
1　 DonnenbergMS, et al. J Clin Invest, 2001, 107 (5) : 539～548.
2　 Papatheodorou P, Domaska G, ; xle M, et al. Cellular M icrobiology,
2006, 8 (4) : 677～689.
3　 Nougayrède JP, et al. CellM icrobiol, 2004, 6 (11) : 1097～1111.
(下转第 177页 )
271
2009年第 10期 杨蕾蕾等 :玫瑰微球菌中 treZ基因在毕赤酵母中的表达研究
213 重组菌表达产物的 W estern blot分析
重组菌发酵液样品 W estern blot检测结果显示单
一条带 (图 10) ,进一步证明 MTHase蛋白在毕赤酵母
KM71菌株中成功分表达。GS115菌株样品中检测不
到条带 ,说明 MTHase在 GS115菌株中没有表达。
图 10　表达蛋白的 W estern blot验证
3 小结
本试验成功构建了 MTHase基因毕赤酵母分泌
表达载体 , SDS2PAGE显示外源蛋白在 KM71菌株
中成功表达 ,这是原核基因在真核系统中表达的又
一次比较成功尝试。但是 ,在 GS115菌株中未检测
到蛋白表达 ,分析原因可能是 GS115转化后得到
Mut+转化子 ,而 KM71菌株转化后得到的是 MutS转
化子 ,而 MTHase蛋白分子量比较大 ,含有二硫键 ,
空间结构较复杂。因此能快速利用甲醇生长的
Mut+转化子没有足够时间对该蛋白进行正确折叠 ,
导致表达失败。
参 考 文 献
1　 PaulMJ, et al. Plant B io, 2008, 59: 417～441.
2　朱明 ,张峻 ,邢来君 ,李明春. 微生物学报 , 2009, 49 (1) : 6～12.
3　 Nakada T, Maruta K, M itsuzum i H, et a1. B iosci B iotechnol B io2
chem, 1995, 59 (12) : 2215～2218.
4　许雅琴 ,袁其朋 ,李文进. 生物技术通报 , 2007, (5) : 109～112.
5　 Cregg JM, et al. B iotechnology, 1987, 5: 479.
6　 Sambrook J, et al, Mdecular Cloning: A Laboratory Manual ( 2nd
ed) . New York: Cold Sp ring Harbor Laboratory Press, 1989.
7　汪家政 ,范明 ,蛋白质技术手册.北京 :科学出版社 , 2000, 90～92.
8　刘先凯 ,高美琴 ,孙忠科 ,等. 生物技术通讯 , 2009, 20: 1～3.
(上接第 172页 )
4　谢永强 ,等. 中国当代儿科杂志 , 2009, 11 (2) : 107～109.
5　任春阳 ,等. 中国微生态学杂志 , 2007, 19 (4) : 379～380.
6　 Ochoa TJ, Barletta F, Contreras C, et al. Trans R Soc Trop Med Hyg,
2008, 102 (9) : 852～856.
7　 Donnenberg MS, Kaper JB. Infect Immun, 1991, 59 ( 12 ) : 4310 ～
4317. 　
8　 Salvioli S, et al. FEBS Letters, 1997, 411: 77～82.
9　 Ma C, W ickham ME, Guttman GA, et al. Cellular M icrobiology,
2006, 8 (10) : 1669～1686.
10　Ma C, et al. CellularM icrobiology, 2006, 8 (10) : 1669～1686.
11　Nougaède JP, et al. Cell M icrobiol, 2007, 9 (3) : 680～693.
771