全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-05-08
基金项目:国家高技术研究发展计划863计划项目(2007AA10Z182)、国家自然科学基金项目(30771383)和中央级公益性科研院所基本科研
业务费专项资金(中国农业科学院生物技术研究所)资助项目
作者简介:赫福霞(1978-),女,黑龙江人,博士研究生,研究方向为植物基因工程
通讯作者:黄大昉,研究员,从事微生物生物技术研究
在植物转基因技术中,可以利用基因枪轰击、农杆菌侵染、PEG介导和花粉管通道等多种转化方法将
外源基因转移到各种植物体内。然而这种 DNA的转移过程都是在组织水平上进行的,转化后的植物组织
中只有一小部分细胞的基因组整合进了外源 DNA,成为稳定的转化细胞,同时还存在着大量的未转化的
细胞。通常利用选择标记基因协助转化细胞的筛选,在选择压力下,非转化细胞由于不具备选择抗性而死
亡。因此,在转基因研究中,选择标记基因对于从大量非转化细胞中选择转化细胞是至关重要的。目前,使
用的选择标记基因大多数是抗生素抗性基因。据统计,2002年在几种主要报导转基因植物研究情况的期
以耐草甘膦2mG2-epsps基因为选择标记的玉米
转化体系的建立
赫福霞 1,2 郎志宏 2 陆伟 2 林敏 2 张杰 3 黄大昉 2
(1东北农业大学生命科学学院,哈尔滨 150030;2中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081;
3中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100094)
摘 要: 转化细胞的筛选和再生是植物遗传转化体系中重要的组成部分,筛选剂的选择和筛选压力的高低直接影
响着外源基因的转化率。以草甘膦异丙胺盐为筛选剂,通过比较在不同的草甘膦浓度及筛选时间的条件下,玉米愈伤组
织生长和分化情况,发现经1mM的草甘膦异丙胺盐筛选 15d后玉米愈伤组织分化受到明显抑制,故以此作为玉米遗传
转化实验中的筛选压力。通过基因枪轰击,将构建好的pMAGUHM载体(其上携带有抗草甘膦基因2mG2-epsps基因)转
化到玉米愈伤组织,利用草甘膦筛选得到耐草甘膦植株80株,其中PCR检测阳性植株为36株,转化率为45%。
关键词: 玉米转化 草甘膦筛选 2mG2-epsps基因
TheEstablishmentofMaizeTransformationSystem witha
Glyphosate-tolerant2mG2-epspsGeneasaSelectableMarker
HeFuxia1,2 LangZhihong2 LuWei2 LinMin2 ZhangJie3 HuangDafang2
(1ColegeofLifeScience,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030;2BiotechnologyResearchInstitute,Chinese
AcademyofAgriculturalScience,Beijing100081;3KeyLaboratoryofBiologyofPlantDiseaseandInsectPest,Instituteof
PlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100094)
Abstract: Eficientandreproducibleselectionoftransgeniccelsisanesentialcomponentinaplanttransformation
system,andbothselectionagentandthedegreeofscreeningpresurehavedirectinfluenceonthetransferrate.Inthis
study,glyphosatewasusedasaselectiveagent,andmaizecalusdiferentiationwasfoundtoberestrainedeficientlyby
1mM glyphosateafter15daysthroughcomparingwithotherglyphosateconcentrationsandscreeningtime.Thus1mM
glyphosate,and15daysasscreeningtime,determinedthescreeningpresureinthemaizetransformationexperiment.The
pMAGUHM vectorharboringglyphosate-tolerant2mG2-epspsgenewastransferedintothemaizecalusbyparticle
bombardmentand80glyphosate-tolerantmaizeplantswasregeneratedonglyphosate-containingmedium.PCR detection
resultsshowed36transformedmaizeplantswerepositiveandtheoveraltransferratewas45%.
Keywords: Maizetransformation Glyphosatescreening 2mG2-epspsgene
2008年第5期
刊上发表的研究论文中,采用抗卡那霉素(kanamycin)的 nptI基因作为抗性标记基因的研究占到总数的
44%~70%,其后的是抗潮霉素(hygromycin)的 hpt基因,占总数的 19%~31%[1]。然而向植物中引入抗生素抗
性基因可能会引起生物安全性问题,很大程度上影响了普通民众对转基因植物的接受。采用抗除草剂基因
作为选择标记基因的转化体系则能有效的克服这些问题,将抗除草剂基因与目的基因构建到同一个载体
上转化植物,在筛选阶段向选择培养基中加入一定量的除草剂就能除掉绝大多数非转化细胞,筛选到含有
目的基因的转化细胞。
5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase,EPSPS)是细菌、
真菌、藻类、高等植物体内芳香族氨基酸生物合成过程中一个关键性的酶,灭生性除草剂草甘膦通过抑制
EPSPS酶活性,导致分枝酸合成受阻,阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成,从而扰乱了生物
体正常的氮代谢而使其死亡。cp4-epsps基因是美国 Monsanto公司从根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)
CP4中分离克隆的 EPSP合成酶基因,因其编码产物对草甘膦的高抗性和对底物(PEP)的高亲和力而在耐
除草剂转基因育种中得到了广泛应用,一系列转入该基因的命名为 RoundupReady的转基因耐草甘膦作
物大面积推广种植,2007年种植面积达到 7220万 hm2,占全球转基因作物种植面积的 63%[2]。cp4-epsps基
因作为选择标记基因在转基因玉米、大豆和小麦研究中获得了理想的效果,但是由于 Monsanto公司拥有
cp4-epsps基因的多项专利,限制了该基因的使用。G2-epsps基因是从国内自行分离的荧光假单胞菌(pseu
domonasfluorescens)G2菌株中克隆得到的耐草甘膦基因,与 cp4-epsps基因的序列相似性仅为 24.5%[3]。刘锡
娟等[4]成功的将该基因转入棉花和烟草,得到了耐草甘膦植株。将来源于原核生物的 G2-epsps基因通过植
物密码子优化,改造获得的新基因称为 2mG2-epsps。通过研究不同的草甘膦筛选压力对玉米愈伤组织生长
和分化的影响,确立了能够抑制大多数非转基因玉米愈伤组织生长和分化的草甘膦筛选条件。在此基础上
以 2mG2-epsps基因作为选择标记基因,通过基因枪轰击,经草甘膦筛选后获得了耐草甘膦的转基因玉
米。
1 材料与方法
1.1 材料
选用玉米 Q31(齐 31)XZ31(综 31)杂交组合,玉米自交系 Q31和 Z31由中国农业大学农业生物技术
国家重点实验室提供;质粒的制备使用质粒提取试剂盒 QiagenPlasmidKit(tip-100),购自 Qiagen公司;草
甘膦异丙胺盐粉末由浙江新安化工集团股份有限公司提供,分子量为 228.19kD。
1.2 培养基
诱导培养基:N6基本培养基+2%蔗糖+2mg/L2.4-D+0.69g/L脯氨酸+0.2g/L水解酪蛋白+0.7%琼脂粉;
筛选培养基:诱导培养基添加不同浓度的草甘膦;
高渗培养基:诱导培养基添加 0.4M甘露醇;
分化培养基:N6基本培养基+5%蔗糖+2mg/L6-BA+0.69g/L脯氨酸 +0.2g/L水解酪蛋白+0.7%琼脂粉;
生根培养基:1/2MS培养基+0.05g/L肌醇+3%蔗糖+0.4mg/LNAA+0.8%琼脂粉;
培养条件:温度为 26℃~28℃,光照时间为 16h/8h(L/D),光强为 2000lx。
1.3 玉米愈伤组织的诱导及其草甘膦抗性试验
1.3.1 玉米愈伤组织的诱导 取人工授粉 10~12d玉米幼穗,剥去苞叶,75%工业酒精消毒 30s,无菌水冲
洗 1次,10%次氯酸钠(NaClO)溶液消毒 15min,灭菌水冲洗 4次,置于铺好滤纸的平皿中,进行幼胚的剥
离,将剥好的幼胚放到诱导培养基上暗培养进行愈伤组织的诱导;此后选择生长迅速、质地松脆、颜色鲜亮
的愈伤组织继代培养,每 2周继代一次,选择生长良好的愈伤组织备用。
1.3.2 玉米愈伤组织的草甘膦抗性试验 选择质地松脆、颜色鲜亮的 I型胚性愈伤组织进行草甘膦的筛
选实验。以含有草甘膦异丙胺盐的诱导培养基作为筛选剂,设立 0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM和 5mM6
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个不同的筛选浓度和 7d、14d、21d、28d共 4个不同的筛选时间,每个浓度设立 2个重复,每个重复包含 12
块愈伤,对照为培养基中不添加草甘膦。组培条件:培养温度 26~28℃,光照时间为 16h/8h(L/D),光强
2000lx;15d继代 1次,分化后 7d、14d、35d和 49d观察愈伤(共两皿 24块愈伤)的生长情况并记录愈伤组
织的绿点数,分化数。
1.4 植物表达载体构建
目的基因构建所用的载体为 pGEM-7Z,其上携带有 Actin启动子启动的 2mG2-epsps基因和 Ubiquitin
启动子驱动的 Btcry1Ah抗虫基因[5]的双基因表达盒,为提高基
因表达水平在表达盒两边引入了玉米乙醇脱氢酶核基质结合区
(Matrixatachmentregions,MAR)序列,构建完成的植物表达载
体 pMAGUHM(图 1)。
1.5 玉米的转化及再生植株的 PCR检测
选取生长状态良好的玉米愈伤组织转移到高渗培养基培养
过夜,基因枪轰击按郎志宏方法[6]进行,轰击后玉米愈伤组织用
1mM草甘膦筛选,15d后见光分化,获得的再生植株利用 PCR
方法检测。
采用 CTAB法提取玉米基因组 DNA[7]。根据 2mG2-epsps基
因序列和 Btcry1Ah基因序列设计两对引物:P1:5-TGGATACGTGGATCTGACACTCG-3,P2:5-TGAACTCCTA
GTGAAGCAAGGGC-3和 P3:5-TTCACCGCAACTGAGACTTACATC-3,P4:5-GGTTCTATACACGCCCTGACCT
AG-3,分别扩增 2mG2-epsps基因和 cry1Ah基因片段,扩增片段长度分别是 550bp和 453bp。反应体系总体
积为 25μl,扩增反应参数为 94℃预变性 6min;94℃1min,58℃1min,72℃1min,32个循环,72℃延伸 8min。
2 结果与分析
2.1 不同草甘膦浓度对玉米愈伤组织生长的影响
愈伤组织在不同草甘膦浓度(0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM和 5mM)的培养基上筛选 14d,转移到分
化培养基见光分化(图 2)。从图中可以看出,与不加草甘膦的对照相比,加入草甘膦的愈伤组织绿点数和
分生小苗数明显减少,这说明草甘膦的存在抑制了愈伤组织的生长和分化,草甘膦对愈伤组织分化的抑制
随草甘膦浓度的增加而增强。当草甘膦浓度达到 1mM时,分化的愈伤组织很难获得分化苗。
草甘膦筛选的愈伤组织分化后 7d、21d、35d和 49d,对其绿点数和分化数进行统计分析(图 3,图 4)。
从图 3可以看出,不同草甘膦浓度筛选的愈伤组织在分化 21d绿点数均达到最高峰,之后一些愈伤组织开
始出现褐化,导致部分已出现绿点的愈伤组织不能继续分化,并且随着分化时间的加长,整块愈伤褐化死
亡,绿点消失。这一现象在高浓度(1mM以上)草甘膦培养基中表现更为明显。这一结果说明,草甘膦对玉
米愈伤组织的毒害是需要一个过程的,也显示了高浓度草甘膦在愈伤组织中积累严重抑制了已产生绿点
图 1 植物表达载体 pMAGUHM构建示意图
图 3 在不同草甘膦浓度下筛选 14d产生的愈伤绿点数 图 4 在不同草甘膦浓度下筛选 14d获得的愈伤分化数
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的愈伤组织继续生长分化。未添加草甘膦的培养基愈伤组织生长状态良好,全部出现绿芽点。
从图 4可以看到,草甘膦筛选浓度在 2mM~5mM范围内,愈伤组织不能分化成苗;筛选浓度为 0.5mM
时,分化 49d成苗率达 83%;筛选浓度为 1mM时,分化 49d只有 1个分化苗,分化率为 4.2%。这一结果表
明,0.5mM草甘膦筛选 14d,只能抑制少部分愈伤组织分化成苗,1mM草甘膦筛选 14d,愈伤组织 95%以上
不能分化成苗,而筛选浓度达到或超过 2mM,愈伤组织全部褐化死亡。
2.2 不同筛选时间对玉米愈伤组织生长的影响
从以上结果可以看出,草甘膦对玉米愈伤组织的生长抑制表现了累积效应,所以筛选时间也是影响筛
选效果的重要因素。首先将草甘膦浓度设定为 0.5mM和 1mM,筛选时间分别为 14d、21d和 28d,之后转到
分化培养基见光分化。同一筛选浓度不同筛选时间对玉米愈伤组织绿点数生成差别不是很明显,但分化成
苗情况有所不同。草甘膦筛选时间越长,分化成苗数越少,得到分化苗所需时间越长(图 5)。
对上述 0.5mM、1mM草甘膦筛选浓度下愈伤组织筛选 14d、21d和 28d,转到分化培养基见光分化 7d、
21d、35d和 49d绿点数和分化数统计分析(图 6,图 7)。从图 6可以看出,草甘膦筛选浓度为 0.5mM时,不
图 2 不同浓度草甘膦筛选 14d,分化 15d和 49d愈
伤组织的生长情况
图 5 草甘膦浓度为 0.5mM和 1mM不同筛选时间对
玉米愈伤组织生长的影响
赫福霞等:以耐草甘膦2mG2-epsps基因为选择标记的玉米转化体系的建立 95
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
同筛选时间的愈伤组织在分化 21d全部出现绿点,之后愈伤组织局部褐化,但在分化 49d仍能看到全部绿
点,即 0.5mM的草甘膦对玉米愈伤组织的生长抑制不大;草甘膦筛选浓度为 1mM时,愈伤组织的绿点数
随着筛选时间的加长而明显减少。从图 7可以看出,0.5mM草甘膦筛选 21d分化 49d愈伤组织有分化苗生
成,筛选 28d大部分愈伤组织已失去分化能力,分化 49d见不到分化苗;1mM草甘膦筛选 21d、28d见不到
分化苗。这一结果表明在同一浓度下草甘膦的筛选时间非常重要,草甘膦对愈伤组织生长的影响是个量的
累积过程,筛选时间过长,将影响玉米愈伤组织分化苗的形成。
综合以上结果,考虑到玉米愈伤组织草甘膦筛选时间过长会产生推迟分化或不分化现象,筛选时间不
图 7 在不同草甘膦浓度下筛选 14d、21d和
28d获得的愈伤分化数
图 6 不同草甘膦浓度下筛选 14d、21d和
28d产生的愈伤绿点数
宜过长,以 1mM草甘膦筛选 15d作为玉米愈伤组织的合适筛选浓度。
2.3 玉米转化及再生植株的 PCR检测
用质粒提取试剂盒大量提取质粒 pMAGUHM并定量,同时将 I型胚性愈伤组织转到高渗培养基培养
过夜,基因枪轰击后以 1mM草甘膦筛选 15d进行抗性愈伤的筛选,得到有草甘膦耐受性的玉米转化植株
80棵。分别用 2mG2-epsps基因和抗虫 cry1Ah基因的
引物 P1、P2和 P3、P4进行 PCR扩增,结果显示有 36
株转基因植株为 PCR阳性,转化率为 45%。PCR结果
还发现,36株转基因玉米同时整合有两个目的基因,
说明这 2个重要农艺性状基因是连锁遗传的(图 8)。
3 讨论
草甘膦作为筛选剂用于转基因植物育种的研究已
在多个实验室展开,并获得了多种转基因耐草甘膦作
物。Howe等[8]通过基因枪轰击法将突变的玉米 epsps
基因及草甘膦氧化还原酶基因(gox)共转化玉米胚性
愈伤组织,经过 1mM及 3mM草甘膦各筛选 1个月后
获得了 15个耐草甘膦的愈伤品系。国内学者通过基因
优化技术获得抗草甘膦突变基因 aroA-M12,并将该基因分别转入双子叶植物烟草[11]、棉花[12]和油菜[13]中,
通过草甘膦筛选均获得了耐草甘膦植株。试验证明,利用草甘膦作为筛选剂在转基因植物研究中是有效
的,具有良好的应用前景。但是由于耐草甘膦性状在转基因作物市场占有重要的市场份额,已克隆的大多
数耐草甘膦基因均受专利保护,限制了这些基因的应用。另外,以草甘膦抗性基因作为筛选标记基因需要
考虑的是基因的有效性。试验结果表明,当草甘膦的浓度为 0.5mM时有 83%的非转基因愈伤可以获得分
化苗,所以,如果耐草甘膦基因的抗性能力差,将会影响筛选效果。2mG2-epsps基因具有自主知识产权,在
大肠杆菌和转基因烟草中已证明具有很高的草甘膦抗性(结果未列)。将 2mG2-epsps基因转化玉米也获得
图 8 玉米转化植株的 PCR检测结果
(A)cry1Ah基因引物扩增结果;(B)2mG2-epsps基因引物扩增
结果
M:DNAMarker;P:pMAGUHM质粒做模板的阳性对照;N:未
转化植株;W:空白对照;1~10:转化植株
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了耐草甘膦的转基因玉米,所以 2mG2-epsps基因在转基因玉米研究中是有效的筛选标记基因。
以草甘膦抗性基因 2mG2-epsps为选择标记基因,转化玉米的转化率为 45%,高于谢龙旭等[11]以 aroA-
M12基因作为选择标记基因在烟草上得到的 27%的转化率,低于 Howe等[8]获得的 100%的转化率。除了与
所选用的基因不同有关外,与筛选时间短也有关系。所以可以考虑适当加长筛选时间来提高转化率。另外,
耐草甘膦基因转化植株可以用高浓度的草甘膦喷洒,假阳性会黄化并慢慢死亡,这样可以在早期鉴定真正
的转化体,对后期的分子检测提供了阳性率较高的抗性群体。试验中所用草甘膦筛选浓度为 1mM,这一剂
量高于中山大学在烟草[11]、棉花[12]及油菜[13]的遗传转化中所用的 0.03~0.08mM的剂量,但比国外在转基因
小麦[9,10]及玉米[8,14,15]等的筛选中所用的草甘膦浓度要低,说明对不同的耐草甘膦基因及受体材料而言,以
草甘膦作为筛选剂的适宜剂量是不同的,需要通过预试验来确定。
将具有自主知识产权的耐草甘膦基因 2mG2-epsps与抗虫基因 Btcry1Ah构建到同一载体上,将 2个
基因转入玉米,成功获得了耐草甘膦抗虫的转基因玉米(另文发表),建立了一个以草甘膦为筛选剂,
2mG2-epsps基因为筛选标记基因的新型的筛选体系。所以 2mG2-epsps基因既可以用于耐草甘膦转基因玉
米的研究开发,也为抗虫、抗病及营养改良等转基因玉米研究提供安全有效的筛选标记基因,对提高玉米
及其他单子叶植物转化水平具有重要意义。
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