全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
临床等级质粒 DNA的实验室制备
皮文辉 宋志强 刘守仁
(新疆生产建设兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,石河子 832000)
摘 要: 在实验室有效获得 100 m g临床试验等级的质粒 DNA。摇床发酵 3个批次, 每批次 4 L培养液,产生大约 160 g
的细菌沉淀物。碱裂解菌体, 气浮法结合离心分离浮杂沉淀。裂解液经 045/022 m囊式过滤器过滤。然后采用阴离子色
谱介质富集质粒, 异丙醇沉淀。重新溶解沉淀后采用 100 kD切向流超滤处理,获得 100 m g临床试验等级质粒 DNA。体外、体
内转染试验对质粒表达效果进行了鉴定。结果表明,纯化的质粒 DNA几乎检测不到内毒素、RNA和蛋白质, A260 /A280比值在
1 82~ 186范围内。纯化的质粒 DNA能够满足动物临床试验。
关键词: 临床等级质粒 DNA 色谱制备 质量控制
Developm ent of P ilotscale Production Process for
Clinicalgrade Plasm id DNA
P iW enhui Song Zhiq iang L iu Shouren
(The Breed & Biotechno logyK ey Laboratory of Sheep in Group X injiang, Shihezi 832000)
Abstrac:t In order to fac ilita te the production of ~ 100 mg c lin ica lgrade plasm id DNA in an academ ic laboratory env ironm ent,
about 160 g bacter ia l pastewas y ielded through ferm entationThe b iom ass w as alka linelysed, and the floccu lent prec ip itatew as separa
ted by a ir floa tation, fo llowed by cen trifug ationAfter rey pro cedures, including depthfiltra tion, downstream processing, ex traction tan
gentia l flow filtration ( TFF ), fina l product o f 100 m g plasm id DNA w as ob tainedThe product w as b io log ica lly active upon in vitro and
in vivo transfection Besides, the p lasm id DNA was proved as undetectable o r extrem e ly low residua l endotox in, RNA, prote in, and the
A260 /A 280 ra tio between 1 82 to 1 86 There fore, th is process for plasm id purifica tion can be adapted for anim a l clin ica l tr ia ls
Key words: C lin ica lgrade plasm id DNA Chrom atography preparation Qua lity contro l
收稿日期: 20081028
作者简介:皮文辉 ( 1972) ,男,副研究员,研究方向:动物遗传资源开发利用
通讯作者:刘守仁, Em ai:l lusu rsh@ xj cn info cet
在实验室,由于经费和空间限制,如何有效获得
100mg临床试验等级的质粒 DNA,已经成为实验室
核酸生物制剂研究进入临床试验阶段需要解决的一
个问题。为了进行绵羊肌注生长激素释放因子基因
质粒试验, 建立了一套实验室纯化质粒 DNA ( 100
mg)的工艺。采用气浮法处理菌体裂解液,非连续梯
度阴离子色谱富集质粒和切向流超滤膜包终端纯化
质粒的过程, 有效地实现了临床试验等级的质粒
DNA制备。
1 材料与方法
11 材料
111 菌种与质粒 Top10大肠杆菌作为宿主菌。
pM GHRH质粒 [ 1]和 pEGFPN1质粒由中国农业大学
农业生物技术国家重点实验室提供。
112 主要试剂 阴离子交换色谱介质 Fractogel
EMD TMAE (M )购自 Merck公司 (德国 ); T riton X100
是 AMERCO公司分析纯产品,其它试剂均为国产分
析纯试剂;所用纯水由 Qp lus超纯水机制备 (M illi
pore, USA )。
113 主要仪器 TGL20M杯式离心机 (湘智离心
机厂 ) ; GQLBS105生物制品型管式分离机 (辽阳阳
光制药机械有限公司 ) ; 色谱柱 ( 20 cm 26 cm
ID)购自上海锦华色谱设备厂; BT00600M蠕动泵
(保定兰格恒流泵有限公司 ) ; 752分光光度计 (上海
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
光谱仪器有限公司 ); HZ931K恒温震荡培养摇床
(太仓市科教器材厂 ) ; V ivoflow 200 (截流分子量
100 kD, 德国 ); B io log ic色谱系统 (美国 ) ; Sartobran
P 022 /045 m 囊式过滤器 (德国 )。
12 方法
121 细菌培养 摇床发酵。根据 PDMR培养基 [ 2] ,
设计了 1个培养基,其中有 ( g /L ):蛋白胨 8、酵母粉
45、D葡萄糖 46、N a2HPO4 7H 2O 128、KH 2PO4 30、
NH4C l 05、MgSO4 7H2O 05组成。培养基 pH值全
部调至 70,并加入对应质粒的抗生素。培养液分装于
2 L的三角烧瓶中,每个装 500m l培养液。一批发酵培
养 4 L( 500m l8), 37 培养 16~ 18 h,管式离心机离
心收集菌体,冻存于 - 72 。为获得 100mg质粒,需要
摇菌 3个批次。
122 菌体碱裂解 25 g菌体重悬于 250m l溶液 I中
( 50 mmo l Tris, 10 mmol EDTA, RNaseA 40 g /m ,l
pH80)。然后添加 500 m l溶液 II( 02 N NaOH, 1%
SDS),室温 5~ 10m in对菌体进行裂解。中和裂解液
使用 250m l 3mol /L的醋酸钾溶液, 4 30m in。裂解
液经气浮法处理,获取 2 /3左右的澄清液。剩余的浮
杂层用 8 000 g离心 10m in,收集上清。将气浮法和离
心收集的液体经过 045/022m Sartobran P囊式过滤
器过滤。加入 1 /20体积的 Triton溶液 ( 750 mmol
NaC,l 50mmol Tris, 20% Triton X100, pH70),稍微搅
拌混合,于 4 静止 1 h,然后进行色谱纯化。
123 阴离子交换色谱纯化 将 50 m l离子交换
色谱柱 ( 20 cm 26 cm ID )接入 B io log ic色谱系
统。用 03 mol /L NaOH清洗色谱柱。用 5倍柱体
积含 500 mmo lN aC l、50 mmo l Tris、15%异丙醇 (体
积分数 ) 和 015% Triton (体积分数 ) 缓冲液
( pH70)平衡色谱柱, 将处理好的样品置于冰水浴
中 ( 0 ~ 4 )用蠕动泵上样。然后用含 625 mmol
N aC l、50 mmo l Tris、15%异丙醇 ( pH70)的缓冲液
淋洗色谱柱至基线走平。接着用 700mmolN aC l、50
mmo lT ris、15%异丙醇缓冲液 ( pH85)洗脱色谱柱,
线性流速 120 cm /h,按照 254 nm紫外吸收曲线分
峰收集 [ 3]。阴离子色谱收集的质粒冻存于 - 72 ,
集中统一进行超滤处理。
124 质粒超滤 色谱富集的质粒 DNA溶液添加
50%异丙醇 (体积百分比 ), 室温静止 20 m in。
10 000 r /m in 20 离心 20 m in,去除上清, 收集质粒
DNA沉淀。加 50m l生理盐水溶解质粒 DNA。接着
用 1 000m l生理盐水经 V ivo flow 200对质粒进行超滤
浓缩处理,回收 15~ 20m l含质粒 DNA的生理盐水。
调整质粒 DNA浓度至 1mg /m ,l经过 045 m醋酸纤
维膜过滤, - 72 保存待用。
125 质粒检测 质粒纯化过程中,用 08%琼脂糖
凝胶电泳 (AGE )和 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS
PAGE)检测各个阶段的成份。由于样品中盐离子含量
较高,在 SDSPAGE电泳时,首先用丙酮沉淀样品。4
体积的丙酮加入 10m l样品中,在 - 20 静置 24 h, 4
以10 000 r/m in离心 20m in。弃去上清,将沉淀空气干
燥。用 200 l水溶解成为 SDSPAGE电泳样品。
根据 A260和 A280的吸收值, 确定质粒产品的浓
度和纯度。若 A 260 /A 280的比值在 18左右则可计算
质粒 DNA的浓度: A 260 50 g /m l稀释度。
采用体外培养的绵羊原代成纤维细胞对纯化的
pEGFPN1质粒 DNA进行体外瞬时表达实验, 转染
在 4孔扳中进行 ( 1 cm 1 cm ),每孔加质粒 2 g和
lipofectam ine 6 ,l操作按照 lipo fectam ine说明书进
行。采用兔子骨骼肌电穿孔转 pEGFPN1质粒进行
动物体内质粒生物学效应定性鉴定。 pEGFPN1质
粒注射液中添加聚谷氨酰胺 06 mg /m l[ 4]。取 02
m l质粒 ( 200 g )注射到兔子的后腿骨骼肌内。质
粒注射后 2 m in, 在注射部位插入 3针电极 (直径
02 mm,长度 15 cm, 两针间的距离 1 cm )并将其
与电脉冲仪连接,给予方波电脉冲刺激,电脉冲参数
为电压 200 V /cm,脉冲周期 50 m s, 脉冲 6次, 脉冲
间隔 1 s和频率 1H z[ 5]。兔子骨骼肌转染 pEGFP
N1质粒后第 15 d取样。用肉眼寻找呈绿色的肌肉
组织。并将发荧光的组织块制作成 10 m厚冷冻
切片,用荧光显微镜进行 GFP荧光检测。另外做 4
m厚切片, HE染色观察组织病理变化。
质粒 DNA的内毒素安全性检测采用厦门鲎试剂
实验厂生产的显色基质定量内毒素检测试剂盒 (试管
法 )测定纯化质粒 DNA的内毒素含量。内毒素检测
范围在 0~ 10 EU /m l。操作按照试剂盒说明进行。
2 结果
21 质粒纯化过程中各阶段样品 AGE和 SDS
PAGE电泳分析结果
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2009年第 5期 皮文辉等:临床等级质粒 DNA的实验室制备
根据质粒 pM GHRH的 AGE电泳图 1B显示, 2
泳道是阴离子色谱过程中质粒上样时穿流样品,检
测显示没有质粒 DNA。说明 Fractogel EMD TMAE
(M )介质有效地结合了质粒 DNA。电泳图 1B、1C
和 1D的 3泳道是 625 mo lNaC l、50 mmol Tris、15%
异丙醇 ( pH70)的缓冲液淋洗色谱柱时的穿流样
品, 1B显示没有质粒 DNA, 而出现 RNA; 1C和 1D
显示有大量蛋白质。说明 625 mmo lN aC l缓冲液淋
洗色谱柱,既保留了质粒 DNA同阴离子介质吸附,
又洗脱了 RNA和大部分蛋白质。阴离子色谱富集
的质粒 DNA样品, 银染检测结果显示, 含有微量蛋
白质条带, 大小约 70 kD (图 1C和图 1D的 4泳
道 )。经异丙醇沉淀后, 70 kD的蛋白含量进一步降
低 (图 1C和图 1D的 5泳道 )。超滤处理后, SDS
PAGE电泳银染检测不到蛋白质, 说明质粒 DNA中
蛋白含量非常低。
A: 样品穿流液体, 洗涤液体, 洗脱液体;
B: MLam bda DNA Eco47I ( AvaII) M ark er; 1裂解上清液; 2样品穿流液体; 3洗涤液体; 4洗脱液体; 5异丙醇沉淀样品; 6超滤样
品 (质粒样品 ) ; 7超流透过液样品, (上样前,所有的样品都经过异丙醇沉淀处理,除去样品中的盐分 )
C: MDLambda DNA Eco47I ( AvaII) M arker; M P蛋白 M arker(生工 ) ; 110 ng BSA; 2裂解上清液; 3样品穿流液体; 4洗涤液体; 5洗
脱液体; 6异丙醇沉淀样品; 7超滤样品 (质粒样品 )
D: MDLam bd a DNA E co47 I (A vaII) M arker; MP蛋白 M arker(生工 ) ; 110 ng BSA; 2裂解上清液 (丙酮沉淀 ) ; 3样品穿流液体 (丙酮
沉淀 ) ; 4洗涤液体 (丙酮沉淀 ) ; 5洗脱液体 (丙酮沉淀 ) ; 6异丙醇沉淀样品; 7超滤样品 (质粒样品 )
图 1 质粒纯化过程色谱图 (A )、琼脂糖凝胶电泳图 (B )和聚丙烯酰胺凝胶电泳图 (C、D)
22 pEGFPN 1质粒体外和体内表达定性检测
pEGFPN1质粒体外转染试验结果见图 2A和
图 2B。图 2中显示, 纯化的质粒 DNA能够用于体
外转染试验,质粒 DNA转染后绵羊原代成纤维细胞
生长正常。 pEGFPN1质粒体内电穿孔转染试验结
果见图 2C和 2D。从图 2C断定,纯化的 pEGFP
N1质粒在骨骼肌内能够正常表达; 根据图 2D组织
切片 HE染色观察, 电穿孔转质粒引起局部组织产
生炎症反应,但对肌肉组织功能影响较小。
23 不同超滤批次 pM GHRH质粒测试结果
不同超滤批次 pM GHRH 质粒的色泽、浓度、
A260 /A280和内毒素测定结果 (表 1)。
根据表 1中 A 260 /A 280和内毒素检测结果, 判定
质粒纯度达到药用等级, 能够用于动物活体试验。
两次超滤得到的质粒总量达到 100 mg, 能够满足动
物临床试验阶段质粒用量。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
A绵羊原代成纤维细胞体外瞬时转染 pEGFPN1质粒荧光图片; B
绵羊原代成纤维细胞体外瞬时转染 pEGFPN1质粒对照图片; C兔
子骨骼肌电穿孔转 pEGFPN1质粒组织横切荧光图; D兔子骨骼肌
电穿孔转 pEGFPN1质粒组织纵切 HE染色图
图 2 pEGFPN1质粒体外和体内表达定性检测
3 讨论
实验室制备质粒过程中, 细菌增殖通常采用摇
床发酵。我们实验室一批发酵培养 4 L, 分装于 8个
摇瓶中,培养 16~ 18 h。3~ 4个批次的发酵能够产
生大约 160 g的细菌沉淀物, 足够纯化 100 mg质
粒 DNA。
质粒大规模生产制备常采用碱裂解法,通常采
用离心或过滤进行固液分离。当大量制备质粒时,
菌体裂解量较大,完全使用离心机处理溶液,需要大
型离心机,增加了设备投入费用。采用实验室常规
设备,结合简易气浮装置, 改进了菌体裂解除渣步
骤。将菌体裂解液倒入 500m l量筒,将需要离心处
理的浮杂层体积减少一倍, 降低了菌体裂解固液分
离工作的劳动量, 便于实现质粒大规模制备工艺
设计。
表 1 不同超滤批次 pM GHRH质粒测试结果
测试项目 方法 不同批次结果
1 2
色泽 目测 清亮无色 清亮无色
浓度 A260 32 m g /m l 325m g /m l
A 260 /A 280 紫外分光法 183 185
总量 浓度 体积 576 m g 52 mg
内毒素 内毒素终点显色法 75 EU /m g质粒 90 EU /mg质粒
阴离子色谱步骤去除了绝大部分细菌内源性杂
质。阴离子色谱纯化质粒时,通常还会残留内毒素。
但通过在裂解液中加入非离子表面活性剂, 将内毒
素隔离在非离子变性剂胶束系统中, 防止内毒素同
色谱介质结合, 有效地去除了内毒素 [ 3]。在色谱过
程中, 表面活性剂被清除。 2个 50 m l Fractogel
EMD TMAE (M )色谱柱运行 1 d,能够富集 50mg左
右的质粒。运行 2 d能够富集 100 mg左右的质粒
DNA。由于阴离子色谱采用不连续阶段梯度淋洗步
骤。因此,色谱过程能够将专用色谱系统改换成蠕
动泵输送样品和淋洗液。
K ahn等 [ 6]和 Eon Duav l等 [ 7]报道,应用切向流
超滤处理菌体裂解液,能够将部分 RNA和蛋白质从
溶液中分离,浓缩质粒 DNA。本研究将切向流超滤
处理质粒 DNA步骤放在阴离子色谱富集质粒步骤
之后,提高了阴离子色谱富集的质粒 DNA的纯度。
本纯化过程使用动物源性的 RNaseA酶,需要优
化工艺设计流程,实现无动物源性制备纯化过程。总
之,生产工艺的优化是一个复杂和艰巨的课题, 也是
永无止境的,应不断地追求更加完美的生产工艺 [ 8]。
参 考 文 献
1 M eng QY, Ch en ZQ, Yu ZQ, et al An im al B iotechnology, 2004,
15( 2) : 175~ 192
2 DanquahMK, Ford e GM Jou rnal of B ioscience and B ioengin eer ing,
2007, 104( 6) : 490~ 497
3 皮文辉,孙从建,宋志强,等.色谱, 2007, 25( 6) : 809~ 813
4 D ragh iaAkl i R, Khan AS, Cumm ings KK, et al Techno l C ancer
ResT reat, 2002, 1( 5) : 365~ 372
(下转第 126页 )
138
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
株 ( AB074918, Japan)、wbJYG1株 ( AB222184, Ja
pan )、swMN06A1288 株 ( AB290312, M ongo lia )、
JMNGOki02c株 ( AB236320, Japan)与分离的 swCH
GL189株序列比较, 氨基酸同源性为 927% ~
935%, 略低于已公布的 946%。
由以上数据可以看出 ORF2基因保守性比较高,
swCHGL189株与不同国家和地区毒株的核苷酸序列同
源性为 791% ~ 918%。氨基酸序列同源性为 895% ~
988%。其中与中国 swCH25株 (AY594199, China)同源
性最高,核苷酸同源性高达 918%,氨基酸同源性达
988%。与墨西哥株 (M74506, M exico)同源性最低,核苷
酸同源性为 791%, 氨基酸同源性为 895%。由于
swCHGL189ORF2 基因序列与已公布的 JakSai株、
JKKSap株、JY ICh isai01c株、HEJF4株、JKOChisa i98c
株、T1株、swCH25株 (AY594199, Ch ina)的 ORF2核苷酸
序列同源性很高,在 880% ~ 918%之间,系统进化树分
析显示,它们处于同一亚群,因此它们可能是来源于同一
祖先的病毒。
另外, swCHGL189株与人源性 HEV (如 X in jiang
标准株等 )的 ORF2核苷酸同源性最高为 879%, 氨
基酸同源性最高为 978%; 与猪源性 HEV (如 HeBei
株等 )的 ORF2核苷酸同源性最高为 918%,氨基酸
同源性最高为 988%。发现它与猪源性 HEV的同源
性更高一些。
根据各克隆株核苷酸、氨基酸的同源性大小及遗
传距离 (每一个核苷酸位置上发生的碱基置换率 )将
世界上已经发现的 HEV病毒株分了 7个主要基因
型 [ 13] ,各型之间总的核苷酸序列同源性为 74% ~
76%, ORF1、ORF2和 ORF3编码的氨基酸序列的同
源性分别为 82% ~ 84%、90% ~ 93%、79% ~ 87%。
不同基因型之间, ORF2的核苷酸同源性小于 85%,
遗传距离大于 0235。同一个基因型中, ORF2距离
在 0045~ 0150之间时, 又可分为不同的亚型。以
往研究表明我国 HE发病以型毒株为主要病原体,近
期的研究报告显示型 HEV是目前引起我国散发性
HE的主要病毒株 [ 14]。本实验室从甘肃地区 12个养
猪场采集猪粪样品 211份,对其中 RTPCR检测为阳
性的 29份样品进行序列分析显示, 均属基因型,提
示该地区猪群中流行的毒株主要为基因型。
研制新型戊型肝炎病毒疫苗是预防戊型肝炎的
根本措施,但是由于缺乏合适的培养体系, HEV的
体外大量培养仍没有取得重大突破, 制约了戊型肝
炎病毒疫苗的研制。国内学者已利用基因工程方
法, 对 HEV ORF2基因的部分片段进行了表达, 并
取得一定进展。动物实验证实, 表达产物具有较好
免疫原性。本研究从猪群中分离出了一株猪 HEV,
即 swCHGS189, 并克隆了其全长 ORF2 基因, 为
HEV诊断和防制制剂的研究奠定了分子基础。
参 考 文 献
1 Pu rdyMA, C arson D, M cCau stlandKA, et al JM edV iro,l 1994, 44:
2122~ 2214
2 Zhuang H, Cao XY, L iu CB, et alGastroenterologia Japan ica, 1991,
26: 135~ 138
3 Sun ZF, Larsen CT, Dun lopA, et al JGertViro,l 2004, 8( t3) : 693~ 700
4 H iranoM, D ing X, LiTC, et al H epato lRes, 2003, 27( 1) : 1 ~ 5
5 Okam otoH, T akahash iM, N ish izaw a T, et al Infect ion, 2004, 32
( 1 ) : 57~ 58
6 Choi C, H a SK, Ch ae C JV irolM ethods, 2004, 115( 1) : 67~ 71
7 T eiS, K itajiam a N, Takahash iK, et alLan cet, 2003, 362( 9381 ):
371~ 373
8 J iang X, G raham DY, W ang KN, et al Science, 1990, 250
( 4987) : 1580~ 1583
9 Pu rdy MA, M cC aust land KA, K raw czynsk i K, et al JM ed V irology,
1993, 41: 90~ 94
10 Pu rdyMA, M cCau stland KA, Kraw czynsk iK, et al JM ed V iro,l
1993, 41: 90~ 94
11 Reyes, et alAtitisE V irus (H EV ): Ep itopeM apping andDetection
of Stra in Variation, E lsevier S cience Publ isher, 1991, 237~ 245
12 梁久红, 赵宇, 丁福,等 单克隆抗体用于戊型肝炎病毒重组蛋
白抗原表位的研究 江苏青年微生物学术报告论文集, 2002
13 S ch lauder GG, M ushahw ar IK JM ed V iro,l 2001, 65: 282~ 292
14 董庆明, 庄辉 中国公共卫生, 2001, 17 ( 5) : 470~ 6472
(上接第 138页 )
5 M ir LM, BureauM F, G ehl J, et al Proc NatlA cad SciU SA, 1999,
96 ( 8) : 4262~ 4269
6 K ahn DW, Bu tlerMD, CohenDL, et al B iotechnology and B ioengi
n eering, 2000, 69( 1 ) : 101~ 106
7 EonDuvalA, M acDuff RH, F isher CA, et al AnalyticalB iochem is
try, 2003, 316: 66~ 73
8 程从升,李作生,余兴龙,等. 中国生物工程杂志, 2004, 24( 10 ):
63~ 69
126