全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
重组人粒细胞 2巨噬细胞集落刺激因子
复性和纯化方法的比较
刘建波 1 　于占江 1 　邓玲娟 1 　张尼 2 　白泉 3
(1咸阳师范学院化学与化工学院 ,咸阳 712000; 2西北有色地质研究院 ,西安 710054;
3西北大学现代分离科学研究所 分离科学陕西省重点实验室 ,西安 710069)
　　摘 　要 : 　比较重组人粒细胞 2巨噬细胞集落刺激因子 ( rhGM 2CSF)在用疏水色谱 (H IC)、离子交换色谱 ( IEC)和体积排阻
色谱 ( SEC) 3种液相色谱进行复性和纯化 ,选择较好的复性和纯化方法。通过对比 rhGM 2CSF在液相色谱上复性和纯化的主
要指标 ,包括比活、纯度和质量回收率 ,结果发现采用 H IC和 IEC对 rhGM 2CSF进行复性和纯化时 ,其比活可以达到国家标准 ,
纯度和质量回收率也比较高 ,而采用 SEC,其比活、纯度和质量回收率远低于 H IC和 IEC。
关键词 : 　重组人粒细胞 2巨噬细胞集落刺激因子 疏水色谱 离子交换色谱 体积排阻色谱
Compar ison of M ethods of Renaturation and Pur if ication of Recombinant
Human Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor
L iu J ianbo1 　Yu Zhanjiang1 Deng L ingjuan1 Zhang N i2 Bai Quan3
(1 Chem istry and Chem ical Engineering College, X ianyang N orm al University, X ianyang 712000; 2 N orthw est Geological
R esearch Institu te for N onferrous M etals, X i’an 710054; 3 Institute of M odern Separation Science, Key Laboratory of
M odern Separation Science in Shanxi P rovince, N orthwest University, X i’an 710069)
　　Abs trac t: 　 Itwas to compare renaturation and purification for recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor
( rhGM 2CSF) with iron exchange chromatography( IEC) , hydrophobic interaction chromatography (H IC) , size exclusion chromatography
( SEC) , and select the p referable method. By comparing the main index including specific bioactivity, purity and mass recovery, we
found that the specific bioactivity can reach the country standard, the purification and mass recovery was also relatively high by using
IEC and H IC, but specific bioactivity, purity and mass recovery using SEC was obvibusly lower than H IC and IEC.
Key wo rds: 　rhGM 2CSF　 IEC　H IC　SEC
收稿日期 : 2009208224
基金项目 :国家自然科学基金 (20175016) ,咸阳师范学院硕士专项基金 (06XSYK270)
作者简介 :刘建波 (19782) ,男 ,讲师 ,陕西扶风人 ,硕士 ,研究方向 :生物大分子的液相色谱 ; E2mail: jianbo6142@ sina1com人粒细胞 2巨噬细胞集落刺激因子 ( hGM 2CSF)是调节造血前体细胞生长和分化的主要细胞因子 ,可促进中性粒细胞和巨噬细胞的增加 ,增强造血功能 [ 1 ]。在临床上 , rhGM 2CSF主要用于治疗各种原因引起的周期性白细胞减少症 ,先天性白细胞减少症 ,再生障碍性贫血等 [ 2 ]。大肠杆菌 ( E1coli)表达的 rhGM 2CSF疏水性很强 ,形成了难溶于水的包涵体 ,只有加入高浓度的变性剂 ,如 710 mol/L盐酸胍 ( GuaHCl)或 810 mol/L脲才能将其溶解。变性的 rhGM 2CSF没有生物活 性 ,首先必须对其进行复性 ,然后再进行分离纯化。采用稀释法或透析法对 rhGM 2CSF进行复性 ,其活性和质量回收率较低。目前报道的复性和纯化方法绝大多数是几种色谱方法和稀释法的组和 [ 3～6 ] ,如Zqveckas等 [ 6 ]用 710 mol/L 盐酸胍溶解 rhGM 2CSF包涵体 ,然后用凝胶色谱复性 ,用固定化金属离子亲和色谱纯化后再用离子交换色谱进一步纯化 ,纯化后的 rhGM 2CSF再用醋酸钠缓冲液透析 ,所得rhGM2CSF纯度为 97% ,但质量回收率仅为 3312%。这些方法都可以得到较高纯度的 rhGM 2CSF,但缺
2009年第 12期 刘建波等 :重组人粒细胞 2巨噬细胞集落刺激因子复性和纯化方法的比较
点是步骤多 ,复性效率低 ,通常质量回收率仅为
30% ～40%。
在生命科学和基因工程领域内 ,液相色谱已成
为蛋白质复性和纯化的有效方法和重要手段。早在
1991年耿信笃教授 [ 7 ] 将高效疏水作用液相色谱
(HPH IC)用于重组人干扰素 2γ( rh IFN2γ)的复性并
同时纯化 ,使 rh IFN2γ复性在 40 m in内完成 ,其活性
回收率是稀释法的 2～3倍 ,纯度大于 85% ,大大简
化了 rh IFN2γ的下游生产工艺。王超展 [ 8 ]将固定化
金属离子亲和色谱法用于重组人粒细胞集落刺激因
子的复性并同时纯化 ,取得了很好的效果。液相色
谱用于蛋白折叠时 ,蛋白活性得以提高 ,变性蛋白可
以较容易地从错误结构折叠为正确结构 ,复性后蛋
白的纯度比较高。因此认为是一种有效、理想的蛋
白折叠方法 ,耿信笃教授等 [ 9 ]将其命名为蛋白折叠
液相色谱。
本科研小组分别采用了 IEC、SEC和 H IC对 rh2
GM 2CSF进行复性和纯化研究 [ 10～12 ] ,并对影响复性
的主要因素进行选择。
1 材料和方法
111 仪器和材料
11111 仪器和设备 高效液相色谱仪 (LC210A ,
日本导津公司 ) ,包括 2 台 LC210ATVP泵 , 1 台
SPD 210AVP紫外可见检测器 , 1台 SCL 210AVP主
机控制仪 , 1 台 CTO 210ASVP 柱温箱 , Rheodyne
7725手动进样阀和 Class2VP色谱工作站 ; KQ—
250型超声仪 (上海昆山检测仪器厂 ) ; CYG2100
高压气动泵 (北京西助技术报务中心 ) ; 721分光
光度计 ;微型进样器 ; pH225型酸度计 (上海第二
分析仪器厂 )。
11112 菌株 DH5α/pDH / rhGM 2CSF由现代分离
科学研究所分子生物学实验室构建。
11113 化学试剂 硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化铵、
氯化钠、醋酸铵、硫酸钠、脲、EDTA、盐酸、氢氧化钠、
过硫酸铵、甲醇、乙醇、氯化钠 (均为分析纯 ,西安化
学试剂厂 ) ,还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽
( GSH, GSSG, Sigma进口分装 ) ,盐酸胍 (分析纯 ,
中国医药集团上海化学试剂公司 ) , 曲通 100
( Triton x2100,北京益利精细化学品有限公司 ) ,二
硫苏糖醇 (DTT,华美生物工程公司 ,美国 Am reco
公司进口分装 ) ,丙烯酰胺和 N , N′2亚甲基双丙烯
酰胺 (电泳纯 , A ldrich Chem ical Company) ,十二烷
基硫酸钠 ( SDS, Sigma公司 , USA ) ,考马氏亮蓝 R 2
250 ( Fluka进口分装 ) ,四甲基乙二胺 ( TEM ED )和
β2巯基乙醇 (均为上海试剂厂 ) ,丙三醇和溴酚蓝
(均为分析纯 ,天津试剂厂 ) ,三羟甲基氨基甲烷
( Tris,北京益利精细化学品有限公司 ) ,甘氨酸 (电
泳纯 ,华美生物工程公司 ) ,考马斯亮蓝 G2250
( Fluka进口分装 )。
112 方法
11211 菌体裂解和包涵体抽提 　菌体裂解 :用
5 L发酵罐对大肠杆菌表达的 rhGM 2SCF进行高密
度发酵 ,收集的菌体用 TE缓冲液 ( 20 mmol/L Tris2
HCl + 1 mmol/L EDTA pH813)洗涤 3次 ,再悬浮于
TE中 ,超声破碎 115 h,混浊液离心 ( 9 000 r /m in,
15 m in)。
包涵体的洗涤 :在盛有包涵体的离心管中按包
含体重量与洗涤液体积比为 1∶20的比例 ,加入包
涵体洗涤液 TE (含 3 mol/L 脲 + 015% Triton x2
100) ,使沉淀悬浮 ,在 4℃搅拌 30 m in,然后在 4℃条
件下离心 (9 000 r/m in, 20 m in) ,弃去上清夜 ,再按
照上述条件洗涤一次。
包涵体的抽提 :按包涵体重量与包涵体溶解 TE
体积比为 1 ∶10的比例 ,加入包涵体溶解 TE (含
7 mol/L盐酸胍 + 20 mmol/L DTT) ,在 4℃搅拌过
夜 ,离心 ( 12 000 r/m in, 30 m in) ,上清即为 rhGM 2
CSF提取液。
11212 粗提物的复性和纯化 　色谱条件 :主要对
固定相相种类、流动相中不同的盐种类、流动相 pH、
流动相中的添加物进行了选择和优化。梯度条件 :
用 100% A 液平衡后进样 , 0～30 m in线性梯度洗
脱 , 100% A液～ 100% B液 , 30～40 m in继续用 B
液延迟洗脱。流速 : 110 m l/m in;检测波长 : 280 nm。
11213 活性测定 　用 TF21依赖细胞株 ,根据 MTT
法测定活性 [ 13 ]。
2　结果和讨论
211　三种液相色谱法复性的理论
变性蛋白质在 H IC上的复性机理 :当蛋白质、
变性剂和杂蛋白质进入 H IC系统后 ,由于 H IC固定
相对变性剂的作用力较弱 ,而对变性蛋白质的作用
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力较强 ,变性剂首先同变性的蛋白质分离 ,并随流动
相关一同流出色谱柱。又因 H IC固定相能提供较
通常方法高出数十乃至数百倍的能量 ,在变性蛋白
质被 H IC固定相吸附的同时 ,瞬时除去以水合状态
附着在蛋白质表面和与固定相表面接触区域的水分
子 ,而蛋白质的特定的疏水性氨基酸残基与 H IC固
定相表面作用以形成区域立体结构 ,接着形成折叠
中间体。随着流动相组成的不断变化 ,变性蛋白
分子不断地在固定相表面上进行吸附 ϖ解吸附 ϖ
再吸附 ,并在此过程中逐渐被复性 ,形成了与天然
蛋白质构象相同的蛋白随流动相一起并流出色
谱柱。
变性蛋白质在 SEC上的复性机理 :在变性蛋白
进入柱顶端时 ,因有高浓度的变性剂存在 ,变性蛋白
质分子有一个随机的构象状态和大的分子动力学半
径 ,不能进入柱的空隙 ,蛋白质在 SEC柱上不保留。
当使用复性的缓冲溶液时 ,因其逐步取代变性并使
蛋白质浓度降低 ,变性蛋白质分子处于热力学不稳
定的高能状态 ,这些蛋白质分子就会自发地向热力
学稳定的低能态 ———蛋白质的天然状态转化 ,从而
使蛋白质开始复性。此时 ,局部复性的蛋白质可以
进入球的内部 ,开始在液、固两相间进行分配 ,随着
时间的推移 ,当蛋白质分子的结构变得更加紧密时 ,
蛋白质在两相中的分配系数就会逐步增加。当蛋白
质柱填料的孔隙后 ,其蛋白分子扩散减缓 ,从而限制
了变性蛋白质分子的聚集 ,这样就减少了蛋白沉淀
的产生。
IEC复性机理不同于 SEC之处在于变性蛋白质
与固定相表面间在分子间的电荷作用 ,这种作用力
可导致变性的蛋白吸附在固定相表面 ,在洗脱过程
中进行吸附剂 →解吸附 →再吸附的复性。
212　三种方法对 rhGM2CSF复性和纯化时条件优化
液相色谱法在对变性蛋白进行复性和纯化时的
影响因素主要有填料的种类、流动相组成、流动相
pH、洗脱方式和添加剂等 ,对于不同的液相色谱为
模式 ,主要影响因素有所不同。对主要的影响因素
进行了选择和优化 ,结果如表 1。
213　流动相脲浓度对 rhGM2CSF复性和纯化的影响
脲是一种最常用的蛋白变性剂 ,在 8 mol/L脲
表 1 复性和纯化的主要影响因素及选择
H IC IEC SEC
固定相 PEG600
流动相 pH 710 810 810
流动相中添加
GSH /GSSG比例 6∶1 6∶1 3∶1
流动相中脲浓度 (mol/L) 210 310 310
的作用下 ,大多数蛋白质分子都由折叠构象变成完
全伸展的构象 ,蛋白质寡聚体则解离成亚基。当高
浓度的脲作为一种失活剂时 ,折叠产率会降低 ,这是
因为在折叠态与失活态之间存在一个平衡 ,高浓度
的脲与蛋白的结合占了主导地位 ,从而推动平衡向
失活态的反应方向进行。脲不仅是一种强的蛋白失
活剂 ,也是一种有效的抑制蛋白聚集剂。低浓度的
脲中可以很好地抑制蛋白折叠中的聚集反应 [ 14, 15 ] ,
蛋白质即可在一定程度上自发复性 ,从而增加正确
折叠的蛋白产率。
因此 ,在采用 3种液相色谱对 rhGM 2CSF进行
复性时 ,在流动相中都添加了脲。但脲浓度要适宜 ,
合适的脲浓度要通过试验摸索。通过对比色谱峰、
比活和质量回收率 ,在 H IC中添加 210 mol/L脲 ,在
IEC中添加 310 mol/L脲 ,在 SEC中添加 310 mol/L
脲时 ,复性和纯化效果较好。
214　流动相 pH 对 rhGM 2CSF在复性和纯化时的
影响
IEC主要靠静电作用对蛋白进行分离 ,所以流
动相的 pH会对 rhGM 2CSF的复性和纯化有很大的
影响。pH的变化可以改变蛋白质的净电荷 ,还可以
影响配体的电离程度 ,造成蛋白质在 IEC上的保留
产生不同的改变 ,从而得到分离。因此 ,在 IEC上可
以改变 pH来获得选择性的分离。通过对比复性和
纯化的指标 ,发现当流动相 pH为 810时 , rhGM 2CSF
在 IEC上的复性和纯化效果最好。
虽然 H IC是基于溶质与固定相之间不同的疏
水力来分离蛋白质的 ,但流动相 pH值对蛋白质和
分离和纯化有一定的影响 ,通常没有在 IEC中那么
明显。试验中分别在 pH 为 610、615、710、715和
810和条件下研究了 pH 对 rhGM 2CSF复性的影
响 ,结果发现 rhGM 2CSF的比活和质量回收率随
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2009年第 12期 刘建波等 :重组人粒细胞 2巨噬细胞集落刺激因子复性和纯化方法的比较
pH变化不太大 ,在 pH 710时达到最大 ,所以选择
pH 710。　
在 SEC中 , pH对复性产率和速率 ,特别是对二
硫键的形成很重要。碱性的巯基交换反应涉及电离
形式的巯基 ,因此在很大程度上取决于溶液的 pH
值。一般地 ,碱性环境有利于二硫键的形成 ,而较低
的 pH则会阻止二硫键的重新氧化。分别考查了
pH为 710、715、810、815、910和 1010条件下对 rh2
GM 2CSF复性的影响 ,结果发现 ,在所研究的范围
内 ,流动相 pH对 rhGM 2CSF的质量回收率不大。但
在 pH710～810之间 , rhGM 2CSF的比活随流动相
pH的增大而增大 ,在 pH810时达到最高 ,这可能是
因为弱碱性环境促进了 rhGM 2CSF和 GSH分子中的
巯基的电离。当 pH大于 810时 , rhGM 2CSF的比活
迅速降低。这可能是因为低的 pH 不能使 rhGM 2
CSF分子中的半胱氨酸上的巯基有效电离 ,因此不
能形成二硫键。然而在过高的流动相 pH条件下 ,
错误配对的二硫键形成的几率增加 ,而且没有机会
被 GSH /GSSG氧化还原对重新排布。而且过高的
pH会引起肽链的降解 ,因此降低了 rhGM 2CSF的活
性。因选择流动相的 pH为 810。
215　流动相中 GSH /GSSG对 rhGM 2CSF复性和纯
化的影响
rhGM 2CSF分子内含有两对二硫键。在包含体
抽提液中由于含有还原剂 DTT,所以 rhGM 2CSF的
二硫键被还原打开 ,因此 ,要获得有活性的 rhGM 2
CSF,必须在其分子中形成正确的二硫键。如果加
入一定浓度的氧化剂和还原剂 ,如 GSH /GSSG,为蛋
白质提供适合的氧化还原环境 ,可以加快二硫键的
交换 ,促进二硫键的正确形成 ,提高复性效率。
因此 ,在采用 3种液相色谱对 rhGM 2CSF进行
复性时 ,在流动相中都添加了氧化还原体系 ,但合适
的 GSH /GSSG比例要进行摸索。通过对比色谱峰、
比活和质量回收率 ,发现在在 H IC流动相中添加
118 mmol/L GSH和 013 mmol/L GSSG,在 IEC流动
相中添加 118 mmol/L GSH和 013 mmol/L GSSG,在
SEC中添加 019 mmol/L GSH和 013 mmol/L GSSG
时 ,效果比较好。
216　优化条件下三种液相色谱对 rhGM 2CSF复性
和纯化结果的对比
在 3种液相色谱各自的优化条件下 ,对 rhGM 2
CSF进行复性和纯化 ,结果如表 2。
表 2 复性和纯化效果对比
H IC IEC SEC
比活 ( ×107 U /mg) 1158 1166 1131
纯度 ( % ) 9517 9612 8614
质量回收率 ( % ) 5618 5818 4213
3　总结
rhGM 2CSF是一种药用蛋白 ,因此 ,其活性非常
重要 ,国家药典规定 rhGM 2CSF的比活不小于 110 ×
107 U /mg,如果小于这个数值 ,就不能够用于临床。
用 H IC、IEC、SEC对 rhGM 2CSF进行复性时 ,在最优
化条件下 ,比活都大于 110 ×107 U /mg,说明这 3种
液相色谱都能使变性的 rhGM 2CSF恢复天然结构。
蛋白的纯度也是一个很重要的指标 ,纯度不高 ,
也不能用于临床。在用 H IC和 IEC以 rhGM 2CSF进
行纯化时 , 纯度都高于 95% , 分别为 9517%和
9612% ,而 SEC纯度只有 8614%。
质量回收率是用来衡量纯化后的 rhGM 2CSF占
总进样量的多少 ,由于在复性和纯给过程中色谱柱
的吸附、在做电泳前使用离心机对蛋白进行多次分
离等原因 , rhGM 2CSF不断损失 ,所以质量回收率一
般都不高。SEC由于固定相对 rhGM 2CSF的吸附较
强 ,所以其质量回收率不高 ,只有 4213% ,其它两种
色谱模式相对较高 , H IC为 5618% , IEC为 5818%。
综上所述 ,通过对比活、纯度和质量回收率进行
对比 ,发现在使用液相色谱对 rhGM 2CSF进行复性
和纯化时 , H IC和 IEC是比较好的方法 ,其比活、纯
度和质量回收率均比较理想。
SEC虽然比活能达到要求 ,但纯度较低 ,回收率
也不高 ,其纯化的效果不好。
参 考 文 献
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(下转第 118页 )
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
后所得 LAK细胞的活力 ,比不加 IL22培育的强 [ 9, 10 ] ;
IL22可促进 B细胞表达 IL22R,促使 B胞增殖和产生
免疫球蛋白 ,并刺激巨噬细胞 ,提高其吞噬能力 ; IL22
诱导 NO合成 ,也是其抗肿瘤作用机制之一。
在本试验中 , SEA对 H22肿瘤有一定的抑制作
用 ,随浓度增加 ,抑瘤率增高 ,低、中剂量组差异不显
著 ,高剂量组差异显著。结果显示各组抑瘤作用与
其 IL22含量成正比 ,主要原因可能是由于高剂量的
超抗原可以激活更多的 T细胞 ,可促使 Th0向 Th1
型分化 ,促使 T细胞分泌更多的细胞因子 ,如 IL22、
IL212、IFN2γ、TNF2α等 ,从而介导细胞免疫。并使
T、B和 NK细胞的 IL22受体表达上调 ,以加强 IL22
作用。超抗原可通过细胞因子间接激活 CD8 + T细
胞杀伤作用 ,也可直接激活 CD8 + T细胞的杀伤作
用。其分泌的高浓度的 IL22反向可以激活更多的 T
细胞 ,增强其杀伤活性。
本研究证明了金黄色葡萄球菌肠毒素 A可以
抑制 H22肿瘤的生长 ,为其在肿瘤免疫治疗中提供
了重要的理论依据。
参 考 文 献
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