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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
三角帆蚌 Nacrein基因克隆、蛋白提纯及其
对珍珠晶体成型的影响
韩健  李文娟  施志仪  郝莹莹  靳雨丽
(上海海洋大学 农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室,上海 201306 )
  摘  要:  为研究三角帆蚌 Nacre in蛋白对珍珠晶体成型的影响, 通过巢式及 3
RACE PCR对三角帆蚌基质蛋白 Nacrein
基因 3 端序列进行克隆, 得到 850 bp碱基片段, 分析表明其与合浦珠母贝同源基因序列相似度为 56% , 与马氏珠母贝相似度
为 50%。试验通过水提法初步分离出珍珠质水溶性基质蛋白, 并采用快速蛋白液相色谱 ( fast pro tein liqu id chroma tog raphy,
FPLC )分离出分子量约为 60 kD的 Nacre in蛋白。此外, 采用配对试验设计, 对试验组外套膜组织培养样品加入 Nacrein蛋白,
研究 N acre in蛋白对晶体成型的影响, 结果显示,加入 Nacre in蛋白的试验组结晶成棱形状; 而未加 Nacre in蛋白的对照组结晶
成雪花状, 而且在晶体形成的时间上, 试验组也较之对照组要早。研究表明, N acre in蛋白能加速外套膜组织分泌的钙质形成
棱状结晶, 从而对晶体成型产生影响。本研究为进一步研究基质蛋白对生物矿化的作用提供试验依据, 对珍珠培育生产有一
定指导意义。
关键词:  Nacrein基因克隆  Nacre in基质蛋白  珍珠  晶体成型
Nacrein Gene Clone, Protein Extraction and Its Effect on
CrystalGrowth inHyriopsis cum ingii Lea
H an J ian L iW enjuan Shi Zhiyi H ao Y ingy ing  Jin Yuli
(K ey Laboratory of A quatic Genetic Researches and Aquacultural Eco logy Certif icated by theM inistry of Agriculture,
ShanghaiO cean University, Shanghai 201306)
  Abstrac:t  In order to probe the effect o f crysta l g row th on nac re in pro tein, the nest PCR and 3
RACE PCR w ere used to c lone
Nacre in gene ofHyriop sis cum ing ii Lea. The target sequence ( about 850 bp) w as obta ined. The Sequence were ana ly zed using DNA

MAN so ftw are, and results show ed that it had 56% and 50% sim ilarity compared to hom o logous gene in P inctada fuca ta andP inctada
m artensii. The Nacrein pro te in was iso lated and pur ified by the FPLC ( fast pro te in liqu id chrom a tog raphy). The m o lecular w eigh t of
Nacre in prote in w as about 60 kD. Furtherm ore, the com para tive test w as designed ( treatm ent group and contro l g roup) to study re la

tionship between Nac re in pro tein and crystal grow th. The to tal o f 12 m antle tissues we re cu ltured ( 6 dish /group), and the tissues of
treatment group w ere added the N acre in pro te in in cu lture m edia, wh ile there of contro l group had not added them. The resea rch
show ed that Nacrein pro tein accelerated the g row th of prisma tic
shaped crystal by the acting on secretion o fm antle tissue, for fur ther re

search on b io log ical m inera lization m atr ix prote in function to provide the founda tions and certa in sign ificance on pearl deve lopm ent and
production.
Key words:  Nacre in gene c lone Nac re in pro tein ex tract Pearl C rysta l g row th
收稿日期: 2010
05
26
基金项目:上海市科委基础重大项目 ( 06aj14003) , 上海市博士后科研资助计划面上项目 ( 09R21413200 ) , 上海市重点学科水生生物学建设项
目 ( S3070)
作者简介:韩健,男,硕士研究生,研究方向:水生动物分子遗传育种; E
m ai:l freew estlife@ sina. com
通讯作者:施志仪,男,教授,博士生导师,研究方向:水生动物生物技术及遗传学; E
m ai:l zysh@i shou. edu. cn
三角帆蚌 (Hyriop sis cum ingii Lea)是我国最主
要淡水育珠蚌种 [ 1] ,其形成的珍珠层厚, 光泽鲜艳,
产珠质量高,占淡水养殖珍珠蚌的 95%以上 [ 2]。有
关贝壳珍珠层形成机制学说很多,经典理论认为,外
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
套膜细胞分泌有机质、离子等前驱物,这些前驱物经
一系列相互作用结晶沉淀形成贝壳珍珠层 [ 3]。生
物矿化的研究表明,有机质中含有的基质蛋白 ( M a

trix prote in)对壳和珍珠的生长形成起重要作用。目
前的研究普遍认为珍珠层是受软体动物外套膜分泌
的有机质调控而形成的, 即珍珠层中文石的成核结
晶、晶体形貌、多型及晶体结晶学定向等是受有机质
基质蛋白控制 [ 4]。
基质蛋白分为水溶性基质蛋白和水不溶性基质
蛋白。本研究采用分子生物学等技术对珍珠生长相
关基质蛋白 Nacrein基因进行克隆, 并通过水提法
初步分离水溶性基质蛋白, 利用快速蛋白液相色谱
( fast protein liquid chromatography, FPLC )分离出
N acre in蛋白,在此基础上将分离出的 Nacrein蛋白
加入于三角帆蚌外套膜组织体外培养中, 动态观测
N acre in蛋白对钙结晶成型的影响,从而为进一步研
究基质蛋白对生物矿化的作用提供试验依据, 为珍
珠养殖培育提供指导。
1 材料和方法
11 材料
三角帆蚌由浙江诸暨市实验养殖基地提供,并
以生豆浆投喂饲养于曝气的养殖缸内。
M
MLV反转录酶购于 Promega公司, 大肠杆菌
菌株 DH5
、克隆载体 pMD19
T、连接酶 T4DNA、3

RACE试剂盒均购自 TaKaRa公司; 反转录试剂盒、
PCR产物回收纯化试剂盒、N aN3、考马斯亮兰染液、
透析袋购自上海天根生物科技公司; 胎牛血清、D

Hanks培养基、双抗、胰酶等试剂购自 SIGMA公司。
其余常规药品均为进口或国产分析纯级。快速液相
层析系统为 FPLC, Amersham公司产品。
12 外套膜基质蛋白 Nacrein蛋白 3 端克隆及分析
试验采集健康 2龄的三角帆蚌外套膜混合组织
样,采用 Trizo l法提取总 RNA,总 RNA的完整性利
用 12%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定, 用紫外分光
光度计 OD260 /280比值进行纯度分析。总 RNA在 M

MLV反转录酶的作用下进行 RT
PCR反应, 产物经

actin基因验证后贮存于 - 20! 冰箱中。
根据已有的合浦珠母贝、马氏珠母贝、夜光蝾
螺、鲍鱼、江珧等物种的 Nacrein基因序列, 在相对
保守的区域设计两对巢式 PCR引物 (引物由上海英
俊生物科技公司合成 ): F
Outer primer: 5
GCAATA

ACGGTGAAAACGG
3 ; F
Inner primer: 5
GAGAGT

TCAAGAAAGTTGGAGA
3 。按照 RACE扩增试剂盒
使用说明合成 RACE cDNA第一链,并按照给定的反
应条件进行巢式 PCR扩增。 PCR产物利用 12%琼
脂糖凝胶分析,并将所得片段回收,连接于 pMD
T载
体,蓝白斑筛选,序列测定提取阳性重组质粒并进行
测序 (上海桑尼生物技术公司 )。
应用 DNAMAN软件, 对得到的三角帆蚌基质
Nacrein蛋白基因片段与已知物种的 Nacrein基因序
列进行序列比对。
13 珍珠层水溶性基质蛋白提取、SDS鉴定及 N a

cre in蛋白分离
131 水提法 [ 5]初步分离水溶性基质蛋白  以
125 mL超纯水 (含 05 mo l/L EDTA, pH80)溶解
50 g珍珠层粉, 4! 搅拌 72 h, 12 000 r/ m in离心 30
m in, 上清液冻干。冻干后的样品溶解在 5mL超纯
水中, 4! 透析除去 EDTA后,样品冻干。
132 FPLC [ 6]分离纯化 N acre in蛋白  高效液相
色谱仪由 Amersham 公司生产, 其原理是经典液体
柱层析引入气相色谱理论,配用高压输液泵,采用高
灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等
发展起来的现代液相色谱。技术参数为流速 075
mL /m in,耐受压 13M pa, 梯度精确度为 2个泵, UV
监视为 1个波长滤波器确认。平衡柱为 M illi
Q水,
20m in柱平衡后,上样 2 mL蛋白样品, 10 - 15 m in
后出现 280 nm处蛋白吸收峰。
133 SDS
PAGE凝胶电泳鉴定纯化后蛋白 [ 7] 
分离胶浓度为 12% ,浓缩胶浓度为 5%。进行垂直
板恒压电泳, 初始电压为 80 V, 进入分离胶时调至
180 V, 当溴酚蓝迁移胶底处, 停止电泳。采用 R

250考马斯亮蓝进行染色检测。
14 外套膜组织培养与钙结晶观察
141 三角帆蚌外套膜组织培养 [ 8]  将 3只三角
帆蚌用清水冲净,切断闭壳肌,将撕好的外套膜外膜
在酒精下迅速浸过, 用单蒸水冲洗, 再放入盛有
D
Hanks的培养皿里, D
Hanks冲洗组织 2 - 3次。
然后分别用 PBS + 200 IU双抗、PBS + 1 000 IU双
抗、PBS+ 200 IU双抗各冲洗组织 1次,最后再用 D

H anks冲洗。将处理过的组织剪成 1 mm3大小的组
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2010年第 12期 韩健等 :三角帆蚌 Nacrein基因克隆、蛋白提纯及其对珍珠晶体成型的影响
织块, D
H anks冲洗 2次。取小片放入培养皿里贴
壁, 27! 培养箱倒置 4 h后,正置后加入少量培养液
(含 20%胎牛血清、1%双抗的 RPM I
1640 )于培养
箱内培养,共培养组织 12组 ( 12个培养皿 ) ,置于相
同条件下培养。
142 钙结晶结果观测  组织培养 6 d后, 将培养
的组织随机分成 2组 (试验组及对照组 ), 各 6个培
养皿。试验组在第 6天后的培养过程中培养液换为
含终浓度为 01 g /mL的 Nacrein蛋白培养液, 对照
组培养液仍保持原有培养液,并使两组培养皿置于
相同条件下培养,每 2天换 1次培养液,每天在倒置
显微镜下观察组织生长与结晶形成情况, 并拍照加
以分析。
2 结果与分析
21 N acre in基因的序列的克隆与分析
总 RNA 通过凝胶和紫外检测, OD260 /280为
18- 20, OD260为 80 g / L,表明总 RNA完整度
好, 浓度较高。外套膜混合组织 mRNA经 RT
PCR
反应、cDNA合成后,进行 3
RACE PCR扩增,扩增产
物经 12%琼脂糖凝胶电泳检测, 在约 850 bp处出现
特异性电泳条带 (图 1) ,产物经胶回收后连入 pMD
T
载体,得到重组质粒,然后送公司测序。
1N acrein蛋白基因目的片段条带; 2DNA m arker条带
图 1 回收片段电泳检测
经序列比对, 试验得到序列与合浦珠母贝同源
基因相似度为 56%,与马氏珠母贝该基因序列相似
度为 50%,比对图如图 2所示。
图 2 Nacrein基因序列生物学比对
22 FPLC分离纯化 Nacrein蛋白
FPLC是专门用来分离蛋白质、多肽及多核苷酸
的系统,是高效液相色谱 (HPLC)近年来的一项重要
革新,它不但保持了 HPLC的快速、高分辨率等特性,
而且还具有柱容量大、回收效率高及不易使生物大分
子失活等特性。三角帆蚌水溶性基质蛋白在 280 nm
处有吸收峰,在单一峰值处收集, 回收冻干浓缩后,再
次进柱, N acrein蛋白检测为单一峰值,如图 3。
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
图 3 Nacrein蛋白在 280nm处的紫外吸收峰
221 基质蛋白的回收率及 N acre in蛋白的纯度 
测定纯化前基质蛋白共约 1 g, 纯化后基质蛋白共约
049 g,经计算纯化回收率为 4852%。
222 N acrein蛋白的纯度  纯化前基质蛋白粗品
有多条杂带, 经纯化后只有一条带, SDS
PAGE结果
(图 4)表明纯化后只有一条带,且此带的分子量约
为 60 kD。由近缘生物 Nacrein蛋白研究资料表明,
N acre in蛋白分子量约 60 kD,并且 N acre in蛋白分子
量变化较小 [ 9] , 因此本试验收集的单峰蛋白为 N a

crein蛋白。
1.蛋白 M ark er条带; 2Nacrein蛋白条带
图 4 Nacre in蛋白的 SDS
PAGE电泳检测图
23 N acre in蛋白对三角帆蚌外套膜组织培养钙结
晶观测与分析 [ 10]
三角帆蚌外套膜组织培养 6 d后,在组织培养试
验组样品中加入了 N acrein蛋白,对照组未加入 Na

cre in蛋白。在第 9天,两组组织块边缘形成明显层
片的膜状结构,并有少量结晶体出现。第 11天,试验
组的组织周围出现类似雪花状的明显结晶 (图 5
A ),
结晶触角较大, 呈四周发散状。而对照组第 13天组
织块周围才出现类似的雪花状结晶 (图 5
B ),而且结
晶体模糊,结晶触角较小。第 18天时,试验组培养皿
中出现棱形状结晶,形状比较规整 (图 5
C )。对照组
培养皿内雪花状结晶触角变小,中间发散状形状变稀
(图 5
D)。试验观测结果显示,两组都出现了雪花状
结晶体,而添加 Nacrein蛋白的处理组出现雪花状结
晶的时间要早于对照组, 此外添加 Nacre in蛋白的处
理组出现棱形状结晶体, 表明添加 Nacre in蛋白对三
角帆蚌外套膜组织培养中的晶体生长及成型有影响
作用。
 靶为 1 mm; A, C为添加 Nacrein蛋白的外套膜组织
 形成晶体图; B, D为对照组外套膜组织形成晶体图
图 5 Nacrein蛋白对外套膜形成结晶的影响
3 讨论
Nacrein为水溶性基质蛋白, 具有 Ca活性,可催
化以下反应: H2O + CO2 = HCO 3
+ H + , 因此, N acre in
可以为贝壳的形成提供碳酸根离子, 其酸性域可键
接 Ca2+ , 对珍珠层的形成起重要作用 [ 11]。本试验
克隆出三角帆蚌基质蛋白 Nacrein基因包括 3 端
850 bp序列, 测序序列与合浦珠母贝 N acre in基因
序列比对相似度为 56% ,与马氏珠母贝序列比对相
似度为 50%。由于淡水蚌与海水蚌基因差异大, 同
源基因相似度总体有一定差异, 相似度一般约在
50% - 60%之间。
贝壳和珍珠有机基质由外套膜表皮细胞分泌的
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2010年第 12期 韩健等 :三角帆蚌 Nacrein基因克隆、蛋白提纯及其对珍珠晶体成型的影响
蛋白质和糖类物质组成。研究表明, 所有的基质蛋
白中都有 (A sp
Y ) n的重复序列结构, Y主要是 Ser
或 G ly[ 4]。透射电镜显示水溶性基质蛋白多分布在
水不溶性基质蛋白表面 [ 12] , 与晶体表面直接接触,
水不溶性基质蛋白硬化后构成晶体生长的网架状三
维空间结构,各种贝类的水溶性基质蛋白在贝体内、
外都对碳酸钙晶体的形成有重要的调节作用。贝壳
有机基质结合钙的能力及其与钙化的关系, 发现在
正常生理离子强度下,水溶性基质蛋白在体内、外对
碳酸钙晶体的亲和力都远远高于对 Ca2+ 的亲和
力 [ 13]。体外试验还证明,水溶性基质蛋白能引起核
化作用的发生。本试验外套膜组织培养分为试验组
和对照组:试验组为加入提取的 N acre in蛋白, 对照
组为未加入提取的 Nacrein蛋白。结果显示, 两组
在早期都有晶体的形成, 这是因为无论是试验组还
是对照组, 外套膜组织自身都有内源性 Nacrein蛋
白,这种内源性 N acre in蛋白启动了晶体生长, 但结
果又表明,加入外源性 Nacre in蛋白能促进钙晶体成
型,加入 N acrein蛋白的试验组的晶体成型为棱形状,
未加入 N acrein蛋白的对照组的晶体成型为模糊的雪
花状,而且加入 Nacre in粗蛋白的试验组出现钙晶体
时间也较之未加入 N acrein蛋白的对照组要早。由此
可见, Nacre in蛋白基质对三角帆蚌外套膜组织钙晶
体成型有影响作用,它不仅启动晶体生长, 而且在已
形成的珍珠质晶体的基础上加速钙晶体成型。在生
理条件下,这些离子簇或珍珠质晶体反复地溶解与形
成,最后稳定下来,形成晶核。近年来,随着研究的深
入进行,越来越多的试验表明,壳有机基质是不同碳
酸钙结晶系形成的决定性因素 [ 14 ]。
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