全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
拟南芥 CBF2基因的抗旱性研究
李新玲 徐香玲 王全伟
(哈尔滨师范大学生命科学与技术学院,哈尔滨 150025 )
摘 要: 以拟南芥为材料, 根据已报道的序列设计引物克隆了 CBF2基因及 rd29A基因启动子,并构建了植物表达载体
pB Irdcb,f用以转化烟草。转基因烟草的 Northern杂交检测显示 , 30% PEG诱导条件下 CBF2基因在诱导 30 m in之后持续较
高的表达水平, 且表达水平受胁迫诱导程度的影响。抗旱生理指标测定显示, 干旱条件下转基因烟草植株的脯氨酸含量迅速
增高, 远超于野生型;而丙二醛含量的增长幅度要比野生型植株小很多,且随着胁迫时间的延长, 转基因植株体内的丙二醛含
量逐步趋于稳定。试验证明, CBF2基因在提高农作物的抗旱性方面具有极大的利用价值。
关键词: 拟南芥 CBF2基因 转基因烟草 PEG 抗旱性
Study on Desiccation Tolerance of CBF2 Gene inArabidopsis thaliana
L iX inling Xu X iang ling W ang Quanw ei
(College of L ife Sciences and T echnology, H arbin N ormal University,H arb in 150025)
Abstrac:t According to the repo rted sequence, the pr im ers w ere designed to c lone the CBF2 gene and the promo ter o f rd29A by
using them a teria l o fA rab idop sis thaliana, at the sam e tim e, the plant expression vector pBIrdcbf was constructed to transfo rm tobac
co. 30 m inutes after the induction, theNo rthern blot ana lysis o f transgenic tobacco showed that the expression o f CBF2 gene, wh ich in
duced by 30% PEG m a inta ined at h igh lev e.l The expression leve l o f CBF2 gene was influenced by the leve l o f stressinduction.
D rought physiolog ica l tests showed that pro line content of the transgenic tobacco p lants inc reased m uch m ore rapid ly than that in w ild
type. In contrast, the grow th rate o fm alona ldehyde is much sm a ller than tha t in the w ildtype. The content o fm alona ldehyde in trans
genic plan ts had gradua lly stab ilized as the stress tim e ex tended. Consequently, the expe rim en tal results d isplayed that the CBF2 gene
has a g reat v alue in im prov ing the drought resistance of p lants.
Key words: A rabidop sis thaliana CBF2 gene T ransgen ic tobacco PEG Drought resistance
收稿日期: 20100723
基金项目:哈尔滨市青年科技创新人才基金 ( 2009RFQXN100) ,哈尔滨师范大学青年学术骨干资助计划项目 ( KGB200903 )
作者简介:李新玲,女,博士,研究方向:植物遗传育种; Em a i:l lix in ling2002@ 126. com
通讯作者:王全伟,女,博士,讲师,研究方向:植物遗传育种; Em ai:l w qw125@ 126. com
植物的抗胁迫耐性属于复杂的数量性状, 是多
种抗逆机制共同作用的结果。用单一的功能基因转
化植物,虽然能使转基因植物的抗旱、抗寒及耐盐性
得到提高,但效果不十分理想 [ 1]。 Stock inger等 [ 2]采
用酵母单杂交 ( yeast onehybrid)方法从拟南芥中分
离出了 CBF1、CBF2、CBF3基因 [ 3- 5 ] , 3个 CBF基因
的核苷酸和氨基酸序列高度同源、转录方向相同以
及在染色体上紧密连锁。 CBF基因转录因子通过
与 DRE调控元件特异结合,能够促进多个耐逆基因
的表达,这些目标基因的编码产物共同起作用,使转
基因植物的抗逆性比其它单一功能基因的转化要强
很多。事实也证明, CBF基因转录激活因子超表达
能同时增强植物对干旱、高盐、低温等胁迫的耐
性 [ 6]。G ilmour等 [ 7]研究表明, CBF3基因在转基因
拟南芥植株中过量表达, 不仅使植株耐低温的能力
提高,而且抗旱和抗盐性也提高; H sieh等 [ 8]将拟南
芥 CBF1基因转入番茄中,发现转基因番茄的抗旱
性和耐低温性都明显增强; Jag lo等 [ 9]把 CBF1基因
转化拟南芥, L iu等 [ 10]把 CBF3基因转化拟南芥, 获
得的转基因拟南芥植株的抗逆性均得到综合的改
良。所有这些结果表明, 低温和脱水反应的信号传
导途径具有许多相同之处, 相互之间形成了关系复
2010年第 10期 李新玲等:拟南芥 CBF2基因的抗旱性研究
杂的信号网络。因此, 植物在形成抗冻性和抗旱性
时是具有交叉保护作用的。目前 CBF1和 CBF3基
因的抗寒和抗旱性已被研究得比较透彻, 而 CBF2
基因的研究却相对显得比较匮乏。笔者克隆了
CBF2基因,通过转基因烟草着重研究其在干旱条
件下的表达情况,用以补充拟南芥 CBF基因家族的
研究数据,为进一步利用 CBF2基因提高农作物的
抗逆育种提供一条新思路。
1 材料与方法
1. 1 植物材料及菌种
分离基因所用的植物材料拟南芥 (A rabidop sis
Thaliana)为 Columb ia生态型, 由本实验室提供; 转
基因受体材料烟草龙江 851( long jiang No851)由牡
丹江烟草研究所惠赠; 大肠杆菌 (E scherichia coli )
DH5、质粒 pB I121及农杆菌 EHA 105均由本实验
室保存。
1. 2 酶及试剂
Trizo l试剂、RN ase A、Ex Taq DNA聚合酶、T4
DNA连接酶、各种限制性内切酶等购自 TaK aRa公
司; DNA胶回收试剂盒购自上海生物工程公司;
pGEM T E asy Vector、IPTG、Xga l等试剂购自 S igma
公司; 其它生化试剂均为国产分析纯。
1. 3 CBF2基因及 rd29A基因启动子的分离
根据 GenBank上公布的 AB013817和 D13044序
列,分别设计 2对引物 P1: P2和 P3: P4,用于扩增 CBF2
基因和 rd29A基因启动子,并根据构建植物表达载体
的需要在引物 5 端分别引入了 H ind !、BamH ∀、Sac∀
的酶切位点。各引物均由大连宝生物工程公司合成。
P1: 5 CGGATCCATGAACTCATTTTCTGCCTTTTC3 ; P2:
5 TGAGCTCTTAATAGCTCCATAAGGACAC3 ; P3: 5
AAGCTTGATGGAGGAGCCATAGATGC3 ; P4: 5
GGATCCTTTCCAAAGATTTTTTTCTTTCC3 。
CTAB法提取拟南芥总 DNA, 以此为模板进行
PCR扩增。反应程序: 94# 5 m in, 94# 30 s, 52–
56# 30 s, 72# 40 s, 30 cycle, 72# 7 m in, 4# ∃ 。扩
增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离, 回收的目的片
段克隆到 pGEM T E asy载体上并测序, 得到 pGEM
rd和 pGEM cbf。
1. 4 载体构建及转化烟草
用 H in d! /BamH∀和 BamH∀ /Sac∀分别切割
质粒 pGEM rd、pGEM cbf和 pB I121载体,构建成由
rd29A基因启动子驱动的 CBF2基因的植物表达载
体 pB Irdcb,f并转化大肠杆菌 DH5,获得转化子。
经冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌 EHA105, 并
采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草品种龙江 851,
获得转基因烟草植株 [ 11]。
1. 5 转基因烟草的 PCR检测
以 Kan抗性植株的 DNA为模板, 未转化烟草
DNA作阴性对照,用 rd29A基因启动子和 CBF2基
因的特异引物进行 PCR扩增,反应程序同 1. 3。
1. 6 Northern杂交检测 CBF2基因在转基因烟草中
的过量表达
将检测为阳性的 T2代转基因烟草及其对照均
用 30% PEG分别处理 0、30、60、120 m in后, 采用
Tr izo l法提取烟草叶片的总 RNA, 经 1%琼脂糖凝胶
电泳分离,转移至 Hybond N+尼龙膜上,探针标记采
用 Roche公司的 DIG RNA Labeling K i,t杂交、洗膜
及检测方法按 K it说明书进行。
1. 7 转基因烟草植株的抗旱生理指标测定
选取 T2代转基因烟草植株的 3个株系 2T4、
2T10和 2T12以及野生型植株的种子,种植在相同
的生长条件下。待幼苗长大后, 将部分幼苗采用同
1. 6的方法处理, 取同一叶位的叶片,测定脯氨酸含
量 ( P ro)和丙二醛 (MDA )含量, 以分析转基因植株
对干旱胁迫的响应。
2 结果与分析
2. 1 rd29A基因启动子和 CBF2基因的分离并转化
烟草
以拟南芥基因组 DNA作模板, 分别以设计的
P1: P2和 P3: P4为引物进行 PCR扩增, 分离到了
rd29A基因启动子和 CBF2基因, 插入到 pGEM T
E asy载体上。经序列测定, 得到了 951 bp的 rd29A
基因和 651 bp的 CBF2基因,与预期结果相符。通
过重组将 rd29A基因启动子和 CBF2基因克隆到植
物表达载体 pB I121上, 将构建好的 pB Irdcbf载体
导入根癌农杆菌 EHA105。利用农杆菌介导法转化
烟草叶片,获得转基因烟草。选取 T0代再生烟草,
通过 PCR方法扩增 rd29A基因启动子和 CBF2基因
来检测转基因植株, 从而获得转基因阳性株系
(图 1)。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
A. CBF2基因的扩增 ( 1. DL2000 m arker; 2.阳性质粒; 3.阴性对照; 4.空白; 5- 9. 样品 ) B. rd29A基因启动子的扩增 ( 1 - 5. 样品; 6.阴性
对照; 7.阳性质粒; 8.空白; 9. DL2000 m ark er)
图 1 部分转基因烟草的 PCR检测
2. 2 CBF2基因在转基因烟草中的过量表达
提取转化烟草的总 RNA, 1% 琼脂糖凝胶电泳
后转移至 H ybond N +尼龙膜上, 以 CBF2基因标记
作探针进行杂交 (图 2)。结果表明,在总 RNA条件
一致的情况下,转基因烟草中的外源 CBF2基因受
诱导型启动子调控,在干旱条件下超量表达。在诱
导 30 m in之后 CBF2基因持续一个较高的表达水
平。由此证明干旱胁迫条件下外源 CBF2基因在转
基因烟草中高表达, 可以使转基因植株增强对干旱
的抗性。
1.野生型; 2. 30% PEG诱导 30 m in; 3. 30% PEG诱导 60 m in;
4. 30% PEG诱导 120 m in
图 2 转基因烟草 CBF2基因的 Northern杂交分析
2. 3 转基因植株和野生型植株对干旱胁迫的响应
从图 3可看出, 在常温 25# 下, 转基因烟草植
株的脯氨酸含量与野生型植株相当;但经 30% PEG
处理后,转基因烟草植株和野生型植株的脯氨酸含
量均会迅速增高,而转基因植株的脯氨酸含量的上
升幅度高于野生型植株。这说明在 rd29A基因启动
子的调控下, 超表达的 CBF2基因蛋白调控了脯氨
酸合成途径中某些基因的表达, 从而导致转基因植
株能够积累较多的脯氨酸, 来适应环境变化所引起
的不适,有利于抵抗干旱的逆境。从图 4可看出, 在
常温下转基因植株和野生型植株的丙二醛含量基本
相同,而经 30% PEG处理后,丙二醛含量都迅速升
图 3 干旱胁迫下转基因和未转基因植株中 P ro
含量的积累
图 4 干旱胁迫下转基因和未转基因植株中MDA
含量的变化
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2010年第 10期 李新玲等:拟南芥 CBF2基因的抗旱性研究
高,但转基因植株的增长幅度要比野生型植株小很
多,且随着胁迫时间的延长,转基因植株体内的丙二
醛含量逐步趋于稳定。这说明在干旱胁迫条件下,
转基因植株的膜脂过氧化程度低于野生型烟草植
株,分析认为,外源 CBF2蛋白与烟草体内多个抗干
旱基因启动子的 DRE调控元件特异结合,促进了抗
干旱基因的表达,而这些基因超表达的产物更好地
保护了膜系统免受逆境损伤。
3 讨论
拟南芥的 CBF基因是一个小型的多基因家族,
它编码 AP2保守结构域的转录因子,结合 CCGAC为
特征的 DRE核心元件,从而激活诸如 COR( co ldreg
u lated gene)、RD( response to dehydration)等抗逆功能
基因的表达,这些目标基因的编码产物共同起作用,
使转基因植物的抗逆性比其它单一功能基因的转化
要强很多。本研究所克隆的 CBF2基因与 CBF1、
CBF3基因同属于拟南芥的 CBF基因家族,它们都聚
集在拟南芥的 4号染色体短臂上, 紧密连锁在一起。
Nov illo等 [ 12 ]的研究显示, CBF2基因是 CBF1, 3的负
调节因子,且在 CBF2基因沉默的突变体中过量表达
的 CBF1和 CBF3基因能够增加突变体的抗冻能力。
但大多数人仍认为 CBF2基因是一个正调控因子, 在
CBF基因家族中 CBF1, 2, 3具有相同且重复的功能
活性 [ 13]。人们对 CBF1和 CBF3这两个基因做了许
多研究工作,相比之下, CBF2基因的研究却显得极度
匮乏,只有 Jag lo等 [ 9]报道转拟南芥 CBF2基因的油
菜植株中, EL50值 (导致 50%组织电解质渗漏出来的
冰冻温度 )比未转化油菜低 4. 6# 。虽然 CBF2基因
首先是从低温处理的拟南芥 cDNA文库中克隆到的,
并且认为该基因的表达只受低温的诱导。但是植物
体内许多基因的表达同时受低温、高盐和干旱等逆境
胁迫的诱导,并且这些胁迫形式对植物形成的损失机
制和保护机制也具有许多共同之处 [ 14]。许多抗冻物
质 (如渗透调节物质、抗氧化酶、LEA蛋白等 )的积
累,也有利于植物抗脱水性的提高。因此, 植物细胞
的抗冻性与抗脱水性之间存在交叉保护作用。本研
究对转 CBF2基因的烟草进行了抗旱性鉴定, 试验结
果表明,在 30% PEG诱导 30m in之后转基因烟草中
的 CBF2基因达到较高的表达水平, 且脯氨酸含量的
积累远超野生型,而丙二醛含量的增长幅度要比野生
型植株小很多。说明, CBF2基因在烟草中确实发挥
了其抗干旱的作用。目前,还没有任何关于 CBF2基
因导入粮食作物和经济作物的报道,但通过本试验可
以得出一个结论,即拟南芥的 CBF2基因对植物抗盐
旱性有重要的作用,通过基因工程技术将其转入目标
作物,可以普遍提高植物抗干旱的能力,比转入单一
的功能基因来提高抗性具有更大的益处。
参 考 文 献
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(下转第 103页 )
99
2010年第 10期 赵鑫等: 豌豆白化苗蛋白质双向电泳技术的建立
为目前 2DE技术中所使用的 IPG胶条都有一定的
蛋白质承载能力,如果上样量太大,会引起过量蛋白
质在 IPG胶条内聚集, 影响 IPG胶条内的等电聚焦
和后续电泳中的蛋白质分离。本试验中就观察到,
当上样量过大时 ( > 2 000 g ), 在电泳胶酸性端有
大量蛋白未完全展开。因此,等电聚焦上样量既要
保证有最大量的蛋白质存在,又要保证各蛋白质在
双向电泳中有最大的分辨率, 能够准确染色。在试
验中我们发现,利用专门的双向电泳蛋白质定量试
剂盒, 可以较准确、快速地定量蛋白质,而采用一般
的考马斯亮蓝法定量蛋白会出现较大的试验误差,试
验重复性也较差。利用试剂盒定量的方法, 我们在豌
豆白化苗上确定的最适宜蛋白上样量为 1 000 g左
右。另外,上样量也与胶条的 pH 范围和染色方法
有关。 pH 范围越窄, 上样量越大 [ 11] ; 染色方法不
同,上样量也可在数百微克 (银染 )到最大几十毫克
(考马斯亮蓝染色 )之间 [ 12]变化, 本试验采用了窄
pH和考染的方法, 需要的蛋白质上样量较大, 若采
用银染法和宽 pH 分离蛋白, 则应降低相应的蛋白
质上样量。
参 考 文 献
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