全 文 ：生物技术通报
· 综述与专论 · 了’ 年增刊
微生物发酵唬拍酸的研究进展
郑璞 孙志浩 倪哗 刘漩
江南大学生物工程学院 教育部工业生物技术重点实验室 , 无锡
摘 要 琉角酸是一种重要的 平台化合物 , 生物基琉殉酸可作为合成大宗化学品的起始原料 , 在食品 、 医
药 、表面活性剂 、洗涤剂 、绿色溶剂 、生物可降解塑料和动植物生长刺激物剂领域有广泛的应用前景。 从可再生原
料出发 , 发酵过程固定 , 使得微生物发酵生产玻角 酸具有良好的环境优势, 成为近年研究的热点 。 围绕微生物
发酵法生产琉角酸迫切需要解决的主要问题 , 综述了国内外对玻角酸生产菌的选育、其代谢机理与产酸条件 、发酵
过程工艺 、产品提取等方面的研究现状 。
关键词 生物基化学品 琉角酸产生菌 代谢工程 发酵 提取工 艺 生物质原料
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琉拍酸 (sueeinie aeid , C 4 H 6 O 4 ) , 又称丁二酸 ,
是工业上一种重要的 C4平台化合物 , 作为基本有机
化工原材料广泛应用于食品 、 医药 、表面活性剂 、清
洁剂 、绿色溶剂 、生物可降解塑料等领域 。 随着石油
贮存量的下降与价格的不断攀升 , 以及石油基化学
工业对环境的影响促进了生物基化学品的开发川 。
生物基唬拍酸作为一种化工原材料的替代品 , 在石
油基大宗化学品市场中 日益受到关注[z] 。 在这种
背景下 , 推动了国内外对环境友好及具有经济前景
的微生物发酵生产瑰泊酸的研究与开发 。 唬拍酸被
公认为将是继柠檬酸和乳酸后的下一个大规模发酵
生产的有机酸产品[3] 。 围绕微生物发酵法生产唬
泊酸迫切需要解决的主要问题 , 综述了近年来 国内
外在微生物发酵生产唬拍酸方面的研究进展 。
基金项目:国家863 项 目(N o. 20 6 A A 02 2 35 ) , 江苏省 自然科学基金前期预研项目( N O. BKZ o 520 1)
作者简介 :郑璞(196 一 ) 浙江金华人 , 硕士 , 副研究员 ,研究方向为发酵工程和生物催化 , E 一m al : zh en gP u @ j i an gn an . ed u . cn
通讯作者:孙志浩(1941 一 ) 江苏无锡人 , 教授 , 研究方向为发酵工程和生物催化 , E 一 m ail : su n w @ p ub li o l . wx . js . 。n
生物技术通报 B 勿te ch n o to 舒 2008 年增刊
1 ’ 产唬拍酸的微生物
墟拍酸是许多严格厌氧菌和兼性厌氧菌的代谢
中间体 。 微生物代谢唬拍酸的有多个途径 , 如图 1
所示 :在厌氧条件下微生物可以通过 PEP 梭化激酶
和 PEP 竣化酶途径固定 CO :产生唬泊酸;而在好氧
条件下也可通过异柠檬酸酶产生少量的唬拍酸 。 根
据微生物的代谢活动 , 唬拍酸产生菌的筛选主要基
于 PE P 竣化激酶 , 苹果酸脱氢酶 , 富马酸酶和富马
酸还原酶活性高;或乳酸脱氢酶 , 丙酮酸 一 甲酸酶 ,
乙酸脱氢酶 , 乙酸激酶等活性低或缺失的模式 。 很
多细菌和真菌都可以产生墟拍酸 , 如瘤胃微生物Ac -
tino6aeillus suc einogene s, A na e ro b i o sP i r i l l u m s uc e i n i e iP -
ro d uc
e 砒 , B ac t e ro i de s s uc c i n 咭ene s , B re b i b a e t e r i u m d i -
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tr in 钻。加ens [5] , 肠linella sueein吧enes , 尺um inoeoe-
cus 介:efac icns 以及乳酸菌【‘)和 E . 。oli 工程菌细菌;A胡erg illo n妙r, A 胡e誉llus 户m ig atus ,
Bys
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n i, a , 反ntin。 鞠ener, Pa e e i l o m y c e s : a ri o t i , Pe n i e i l -
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n 诉rum 和 Saeeharo mxc es ce二站ia 。[’
,
8 〕和 凡ni-eillium 51呷lieissimum 〔’] 等真菌 。 但是 , 只有少数菌
产墟泊酸浓度较高。
莆萄糖
{
甘油醛 一3 一 磷酸
{
磷酸烯醇式丙酮
谷氨酸盐 草酞乙酸 丙酮酸
{
º
苹果酸 天冬氨酸…‘岁丫.。淤饭 、丫 乙
乙酞辅酶
l|1,1IL
酸l)磷(l;酸酞
l
乙
{
¼ 异柠檬酸州 乙醇异柠檬酸一 唬拍酸图1 各微生物产琉拍酸代谢途径图
表 1例举了一些具有工业化前景的唬拍酸产生
菌的发酵特性 。 A . s u e e i n 泌iP ro d uc ens A T e e 2 9 3 0 5
是从猎犬 口腔中分离得到的一株严格厌氧 、发酵主
产物为珑拍酸的菌株〔’“〕。 在 1.4 L 发酵罐中墟泊
酸产量最高达到 50 g/ L , 转化率 59% (侧w )[川 。
其抗氟乙酸突变株 FA 一 10 ( AT C C 5 5 6 17 ) 产唬拍酸
在 25 岁L 一 5 岁L[’‘〕。 但其培养及发酵过程中需
要特殊方法保证绝对无氧环境〔‘, 〕, 使得工业化生产
难度加大。 并且 , A . s uc ci n ic 动ro du ce ns 可能引起人类
的败血症【‘, ] 。 虽然感染几率较低 , 但潜在的毒性仍
不容忽视 。
大肠杆菌通过 TCA 循环中的还原支路生成唬
泊酸 , 但只能进行混合酸发酵 , 唬拍酸产量较低 。 构
建产唬泊酸的 E .。oli 基因工程菌是生物基琉拍酸发
酵制备的研究热点 。 早期的研究主要集中在通过磷
酸烯醇式丙酮酸梭化酶 (PE PC )和丙酮酸梭化酶
年增刊 郑璞等:微生物发酵墟拍酸的研究进展
( PY C )的过量表达 ,使 E.co li 的碳代谢流从 PEP 和
丙酮酸转移至 TCA 循环还原分支方向。 通过过量
表达 PEP 梭化酶(PEPC ) , 君.eo li的珑拍酸的产量增
加了 3.75 倍 , 可达 10.7岁L [“] 。 在 百.。。21 中 , 过量
表达来自so rg ha m 。烤are 的 PEPC 也可 以提高珑泊
酸的产量[”〕;过量表达来 自玩etoeoeeus la etis [” ]或
肋如bium 。tli〔”〕中编码丙酮酸梭化酶 (PY C )的基
因 , 增加碳流向丙酮酸梭化方向的转移 , 也可增加珑
拍酸的产量 。
产墟拍酸大肠杆菌研究中一个突破性进展是获
得了突变株 N ZM l 和 AFPI 11 。 用基因工程技术 ,
由 ldh (编码乳酸脱氢酶)和娇(编码丙酮酸 一 甲酸
酶)的双突变株 君. 。。11 N z N l l l [ ’‘, ”]出发 , 分离到其
葡萄糖磷酸转移酶基因(Pt sG ) 发生变异的 E.co li
A FPI 11 , 发酵唬拍酸浓度最终可达 45 梦L 。 进一步
由 A FPI11 构 建 的 产唬 拍 酸 E. eoli AFPI11
(pTr c99A一yc ) , 发酵唬拍酸浓度最终达到了 9 扩
L[ ’“〕, 此为文献报道中的最高产量之一 。 另一种对
野生型 E .。oli 进行基因改造的方法是从 E .。oli 墟拍
酸生产补充途径(乙醛酸循环)考虑 , 消除发酵副产
物的生成和保证乙醛酸循环的进行 。 得到 E. co li
sBs55oM o Phl413〔” ] , 其 ld人A 、 。趴百 、。硫夕t。 3 种基
因的敲除阻碍了乳酸 、乙醇和乙酸的生成 , icl R 基因
的敲除保证了乙醛酸循环中有关酶的表达 。 该突变
株在补料分批培养时 , 其唬泊酸产量为 41 岁L , 转化
率为 l· 6 m o l 唬泊酸/lm ol葡萄糖[” ] 。
另外 , 针对于琉拍酸好氧发酵的 E .co li 基因改
造也在进行 〔”〕。 通过敲除琉泊酸脱氢酶基因 记六月
可使珑拍酸成为 TCA 循环中氧化支路的最终产物 ;
敲除基因 iclR 使乙醛酸循环成为生成唬拍酸的第 2
条途径 ;敲除基因 Po xB 和 ac kA 一ta 阻碍乙酸的生
成 ;最终插人失活 pts ‘的基因 , 并过量表达来 自s.
。u
lga
re 的 pEpC , 构建的 E .eoli H I2 7659k/ pK K3 13 ,
通过补料分批好氧发酵产唬泊酸量达到了 58 .3扩
L , 生产强度为 1.1岁U h , 表明了好氧生产唬拍酸的
可能 。 在 E.co li 工程菌的好氧发酵中 , 唬泊酸的理
论产量为 lm ol 唬拍酸/m ol 葡萄糖 , 低于厌氧过程 。
并且 , 在最大墟拍酸产量时的最佳碳流引起 C O: 的
净生成[2, ] 。
co rxn
e 6 a e t e 瓦u m g lu ra m ie u m 是作为工业上产氨
基酸的菌种 , 不是传统意义上产唬拍酸的菌种 , 但已
有运用 C.娜ut am icu m 到工业规模的墟泊酸生产的
报道 ( http ://~
. tifa e. o吧 · i 可 ofe r/ tsw/ iapenV·
ht m
) [25]
。 在碳酸氢盐存在的缺氧环境中 , C . g l u -
ta m ic
u
m 不生长 , 但可将葡萄糖转化为 23 扩L 唬拍
酸和 95 岁L 乳酸 。 在高细胞密度条件下 , 唬拍酸的
生产强度为 H .7 梦口h , 其单位菌体生产能力为
20 0 m岁gD cw/ h[ ’6 〕。 基因插人使乳酸脱氢酶基因
的失活 , 珑拍酸和乙酸成为 C.glu ta m icu m 发酵的终
产物 , 但二者的浓度都不高。 进一步在 ldh A 突变株
中过量表达 PY C , 唬泊酸和乙酸的浓度则增加了两
倍[’7 〕。
A
.
, u e e
i
n哪ne、、M. : uc e i n i e iP ro d uc e ns 是从瘤胃中
分离得到的瘤胃巴氏杆菌科 、产唬拍酸的天然菌株 ,
目前在墟拍酸工业化生产研究中最受关注 。 最近报
道这两类菌株基因组序列极为相似〔’8 , 2 , 了, 它们的很
多代谢途径也相似 。 两者都以唬泊酸 、 乙酸和甲酸
作为主发酵产物 。 两者都能够利用多种碳源 , 包括 :
葡萄糖 、果糖 、木糖和阿拉伯糖 。 不同的是 A .suc ci -
朋g 已nes 还可利用山梨醇 , M . s uc in c 勿ro dILc e。 则不
能[’。一”] 。 当发酵葡萄糖时 , M . s uc e i n i e iP ro d uC e 邢 还
生成乳酸 , 而 A.:uc ci noge nes 则还生成乙醇 。 A
. s
uc
-
ci n 习g e nes 除了不生成乳酸 , 在其细胞提取物中 , 乳酸
脱氢酶的活性也很低〔”〕。 在这两种巴氏杆菌中 , 流
向唬拍酸的代谢流都随着 C O :和 H :浓度的增加而
增加 〔” ,川 , 证明了两种微生物都是在 PEP 处形成简
单的分支途径 , 分别为唬拍酸的 C4 支路和甲酸 、 乙
酸以及乳酸/乙醇的 C:支路 。 用中性红代替 H Z, 还
可改进 A.、uc ci n 刀g e nes 的唬拍酸产量和生产速率。
中性红是一种氧化还原染料 , 可作为富马酸还原酶
的电子供体[3, 一〕。
虽然关于 A.、uc e i n卿ne s和 M. suc einieiP ro duc e。
基因工程改良菌的报道还不多 , 但目前已有这方面
的报道 。 韩国 Le 。 等【’6 〕通过敲除 ldhA
、 解召、 Pt 。 和
ac几A 基因获得不形成副产物的代谢工程菌 M. suc -
ci nic争ro duce 二 LP K7 , 产墟拍酸水平达到 52 .4 酬L ,
比野生菌有了大幅度的提高(表 1) 。
健物杖术通很 B io te ch n ole盯 B “le 血
表 1 不同微生物以葡萄糖 a为底物产唬泊酸的对比川
2 0 0 8 年增刊
菌株
基因型
唬拍酸产量 生产强度 单位生产强度 珑拍酸产率
(g/ L) (岁口h) (m留gD C W / h ) (『g)
细胞浓度
(g /L)
发酵时间
(h )
参考
文献
‘
1
20
‘
l‘U,J八乙
‘且.-n曰,4一、内1、A . 、
uc
in ic iP ro d uc
e ns 野生型
野生型 巧(X) 0 .99
产物
摩尔比 b
1.9
1.9 一 2 . 7
一
24
O ~ 0
.
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J.直内,伪、2,
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一 1 0 ; U n k
.
注. ;uc ein og enes l3 0 z ;野生型
一3 0 2 ;野生型
FZ5 3 ;U nk.
c. glut am ieum R ;野生型
E . co liSBS550M G/ pH拼13 ;△adhE ,
△ldh A , △ic lR , △ac k 一 Pt a: : C n 诬R P , t +
H匕打砧9妙pK K3 13 ;△ 、硬仇4B , △硬配无吸邻a ,
△尸。义B , △icl R , △pts C , 尸印C 十
A F P l l l / p T re 9 9 A 一 Py c ; △对M B ::C nzR ,
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‘4 : :尺示尺 ,
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胜 suc einic明ro d uce 邢 M B E巧SE ;
野生型
LP K7 ; Z盛」: :而构沪刀: :乙刀己左
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.
8 ~ 8
.
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.
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9 0 ~ 1 1 0 0 5 6 一 0
.
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.
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1 0 一 1
.
1 7 3
.
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.
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.
0 7 6 2 0 , 2 4
1 3
.
5 1
.
8 5 2 0 0
.
6 8 1
.
0 5 0
一 3
.
4 7
.
5 3 1
5 2
.
4 1
.
8 一 3
.
0 6 9 0 一 1 1 5 4 0
.
7 6 1
.
8 0 一 2
.
6 2 9 3 6
在某些较复杂的培养基中 , 除了葡萄糖 , 还需要其他的碳源和还原力
琉拍酸对其他发酵产物产量的摩尔比
A . 、uc e i n娜nesl30z(ATCC55618)可在含有 96
扩L 唬拍酸二钠或 130 扩L 琉泊酸镁的环境中生
长 , 其氟乙酸抗性变异株 FZ53 可生成高达 110 岁L
的唬拍酸〔”] , 这是目前文献所报道的发酵法生产唬
拍酸的最高产酸浓度 。 最近 , M c Ki 记ay 等[’8 , 39] 通过
N M R 和 G c 一 M s 分析 13c 同位素标记的代谢中间产
物 , 修正了墟拍酸放线杆菌A . suc ci no ge ne 、 1 30 2 的
代谢途径和代谢流模型 。 A . s uc i no ge nes 的基因组
不能编码异柠檬酸脱氢酶 , 说明了 A .suc cino ge nes 是a 一酮戊二酸营养缺陷型 。 草酞乙酸和苹果酸到丙酮
酸脱梭反应的存在 , 推测出转氢酶或者苹果酸脱氢
酶和苹果酸酶的共同作用将过量的 NA D H 转化为
N A D , 氧化戊糖磷酸途径最多只提供了 20 % 细胞生
长所需的 N A D PH 。 由于草酞乙酸 、苹果酸 、丙酮酸
间代谢通量的交换 , 在高 NaH C 03 的浓度时 , 这种由
合成唬泊酸的 C4 途径流向合成副产物 C3途径的
通量减少 , 导致 了高 C0 2 和 H Z 浓度下 A. , uc ci no -
ge
nes 墟拍酸产量的增加和甲酸 、乙酸和乙醇副产物
的减少 。 这也意味着除磷酸烯醇式丙酮酸 、草酞乙
酸 、苹果酸外 , 丙酮酸是貌泊酸和发酵副产物间的第
四个节点 。 为用研究 A.s二ci no ge ne 生理和增加唬
泊酸代谢流提供了参考 。
国内天津大学 、江南大学 、南京工业大学 、烟台
大学 、合肥工业大学都相继开展了生物基唬拍酸的
研究 。 筛选到 A . suc ein卿nes 、 肠uC onos toc Ines en te-ro ides [40] 和霉菌 s 一1 突变株[‘, 〕等产唬拍酸菌株 。 其
中江南大学孙志浩等[4, 〕从我国肉牛瘤胃中筛选的
产墟拍酸菌株经鉴定为 A.suc ci noge nes , 它与 Ac ti-
no baeillus suc eino genes 1302 和 M .suc einieiP ro d uc ens
M B E 巧5E 有明显不同 , 其发酵主要副产物仅为乙酸
和甲酸 , 不产乳酸 , 发酵产物中也未发现乙醇 、丙酮
酸 , 经诱变选育的抗氟乙酸突变株发酵产唬拍酸与
杂酸的比例达到 7 :l[wt 州 。
2 唬拍酸发酵工艺
年增刊 郑璞等:微生物发酵墟拍酸的研究进展
生物基珑拍酸的生产是以富含糖的生物质为原
料 , 葡萄糖是研究工业发酵貌拍酸的常规底物 。 理
论上川 , 消耗每摩尔葡萄糖和一定量 co Z(以可利
用电子计)可产生 1.71 摩尔唬拍酸 :
glueose + 0. 86H CO至* 1. 71sueeinate几 + 1.
74H 20 △e H o’ 二 一 1 7 3
kJ/
m o l
而当存在 C OZ 和外加还原力(如 H :)时 , 墟拍
酸的理论产量可增加到2 摩尔:glueose + 2H C0 3’+
2H 2砚sueeinate, 一 + Z H Z o + Z H + △G o’ 二 一 3 1 7 kJ /
m o l
这一理论产率是微生物发酵生产唬拍酸的目
标。 为此 , 除了产墟拍酸微生物的代谢与选育研究
外 , 发酵工艺如发酵条件与操作方式 , 以及利用廉价
生物质原料等方面的研究都在积极开展 。
c o Z 在唬拍酸产生菌代谢过程中起着至关重要
的作用 , 唬拍酸产生菌对 CO : 的固定和利用是唬拍
酸发酵的特点 。 环境条件和培养基成分关系到微生
物的产酸 。 对厌氧菌 A. s‘ci ni c勿ro du ce ns A TC C
29305[46 , ‘, ) 、对. 、uc in ie iP ro 己uc ens M B E 巧SE [” 〕和 A
.
、u e e i
noer
nes 1 3 0 2 [
” ]的研究表明:培养基中 C oZ 的
水平低时 , 墟拍酸产量减少 ;唬拍酸发酵的 pH 为6.
0 一 7 . 5; 环境中提供适量 H Z可提高墟拍酸产量 ;葡
萄糖 、果糖 、麦芽糖 、蔗糖 、乳糖 、木糖等是这类微生
物可 以利用的碳源 。 通过优化培养基成分 , A . s uc ci -
几。g 己nes C G M C C 1 5 9 3 和 A .sueeinogenes NJlll 产唬
拍酸的水平明显提高 , A . 、uc ci n oge nes N Jl l3 发酵珑拍酸浓度达 85 岁L哪洲 。
采用廉价的工业原料是生物基琉泊酸发酵研究
的热点之一 。 A . s uc i n 习g e n es 13 0 2 在含有玉米浆、
酵母提取物和葡萄糖的培养基中生长 , Z L 规模的
发酵罐上分批发酵能够产生 60 一 70 岁L 的唬拍酸 ,
唬泊酸产率约在 0.78 9 · g 一 ’ , 主要副产物为丙酮
酸 、乙酸和甲酸〔’2 〕。 其氟乙酸突变株在 Z L 厌氧发
酵罐中分批发酵 , 唬拍酸产率达 0 .8 一 0 . 9 9 · g 一 ’ ,
生产强度 1.5 一 1 . 8 岁 (L · h) [3v 〕。 在以塑料复合
材料 为支持物 的反应 器 中培养 A. suc ci no ge nes
130 2 , 通过生物膜的形成和高细胞密度 , 使墟拍酸
的生产强度得以提高【’“〕。 以工业级的酵母提取物
和玉米浆为原料 , 在该反应器中连续发酵 , 唬拍酸的
生产强度达 8.8 岁口h , 但发酵液中墟泊酸浓度过
低 , 还达不到分批发酵的 l乃 [5l ]。
有一些报道采用乳清作为发酵原料[” 一’‘〕。 用
A . suc iniciP ro duc ens A Tee293os 在以玉米浆[”] 或
者酵母提取物和蛋白膝 [”〕为氮源的培养基中 , 补
料分批和分批培养条件下 , 唬拍酸对乳清中总糖的
产率可达 91% 。 M. s uc i n ic iP ro d uc e ns M B E L5 5 E 以
乳清和玉米浆为原料 , 分批或连续发酵条件下 ,其唬
拍酸产率 、生产强度分别为 0.7 1 9 · g 一 ’ 、 1 . 2 岁U h
和 0· 6 9 9 · g 一 ’、3 . 9 g/ u h [ ’‘ ] 。
A
. ￡uc ci n ic 动ro du ce ns 可以利用木糖 , 因此木材
水解液也可作为发酵产唬拍酸的原料 , 以酵母提取
物 、蛋白脉或玉米浆为氮源 , 墟拍酸产率接近 0.9 9
·
g
一 ’[” l 。 A . ,
uc
in cir
ro d uc
ens 也可以利用甘油作
为碳源 , 其以甘油为原料的墟拍酸产率达到 13 % ,
瑰拍酸/乙酸的比值为26 :1 , 而对比以葡萄糖为原
料时为4 :l[, 6 〕。
E
. 。oli 工程菌的产酸与天然珑拍酸产生菌的
接近 ,但是采用先好氧生长 、后厌氧产酸的两段式发
酵 , 操作麻烦 , 总发酵时间长 , 生产强度相对较低 。
除E . 。ol iA F Pl l 可用工业原料发酵外 〔” ] , 其它的
E . 。oli 工程菌几乎都需在含有蛋白陈和酵母提取
物的培养基中培养 , 还需要异丙基 一 p 一D 一硫代半乳糖
昔来诱导表达 , 这导致大规模生产的成本偏高。 印
度 A ga , al 等[’8 1报道用基因工程菌 E. co li 发酵甘
蔗糖蜜与玉米浆生产墟拍酸的研究 , 发酵 50 岁L 糖
蜜(总糖浓度)产琉拍酸 17 岁L , 对糖利用率和生产
强度分别为 34 % 和 0.5 群(L · h ) , 反映了该菌种不
适宜于糖蜜原料发酵 。
国内也开展了多种原料发酵产墟拍酸的研究 。
刘宇鹏等[’9 ]用玉米水解糖采用控制适宜的补料策
略 , 通. ,
uc
i n卿nes CGMCC 1593发酵液中唬泊酸的
浓度达到60 .2 岁L , 生产强度 1.3 岁Lh , 墟拍酸产率
0 .75 9 · g 一 ’。 以甘蔗废糖蜜为原料 , 补料分批发酵
48 h , 产唬拍酸 5 酬L , 生产强度 1.巧 岁(L · h ) , 唬
拍酸产率0 .8 9 · g 一‘[60 〕。 董晋军等【6 , ] 采用两级双
流半连续发酵工艺 , 以甘蔗糖蜜为原料生产墟拍酸 ,
半连续 39 批 , 两级罐总发酵时间 21 一 24 h , 平均产
酸 43 .5 9 · L 一 ’ , 生产强度平均达到 2.07 9 · L 一 ’ ·
h
一’ , 唬拍酸产率平均0.79 9 · g 一 ’。 孙志浩等仁6, 」以
玉米水解秸秆工业级水解糖浆为原料 , S L 搅拌罐
生物技术通报 刀泣。te c h n o to gy 2 0 0 8 年增刊
上进行分批发酵48 h , A . s u e e i 刀o g e nes e G M e e 1 5 9 3
产生 45 .5 扩L 唬拍酸 , 5 . 75 扩L 乙酸 , 玻拍酸产率
0.81 9 · g 一 ’ , 生产强度0.95 岁(L · h ) 。 采用补料
分批发酵 48 h 时唬拍酸产量 (52 .1 岁L) 较分批发
酵时提高了巧% , 唬拍酸产率 0.81 9 · g 一 ’ , 生产强
度达到 1.09 留(L · h) 。 姜崛等以玉米皮水解
液 〔6, 〕及啤酒废酵母酶解液〔叫为培养基原料进行了
研究 , 在厌氧瓶中A . suc inogene : NJ ll 分别产唬泊
酸35 酬L 和 34 岁L , 琉拍酸产率分别为 0.71 9 · g 一 ’
和 0.69 9 · g 一 ’。 过鑫富等〔叫 以菊芋为原料 , 采用
同步水解于发酵的方法 , S L 发酵罐产珑拍酸浓度
68.48 岁L , 唬拍酸对消耗糖产率94 .2% (糖利用率
87.8% ) , 生产强度 0.95 岁(L · h ) 。
国内近年在利用较廉价的原料研究方面作了大
量工作 , 取得了一定进展 , 使墟泊酸发酵的工业化展
现了良好前景 。
3 发酵唬拍酸的提取研究
与化学合成墟泊酸相比 , 从发酵液中提取唬拍
酸的经济性是影响生物基珑拍酸能否大规模生产的
重要因素。 提取过程的收率 、副产物(乙酸 、 甲酸 、
乳酸和丙酮酸等)的分离以及废弃物的综合利用等
是微生物发酵生产墟拍酸下游过程的关键技术 。 目
前已经报道了从发酵液中提取琉拍酸的几种方法 。
主要有电渗析法【“, 〕、钙盐法〔68 , 69j 与钱盐法〔川 、溶剂
萃取法 [’0 , , , l 、膜分离法【”〕等。
Be rg lu nd 等【6, 〕报道用电渗析法从发酵液中提
取唬拍酸 , 发酵液经过微滤后 , 进人两极电渗析单
元 , 将盐和其它不带电荷的糖 、蛋白质等分离开 , 唬
拍酸钠被转变成唬泊酸 , 钠离子通过阳离子膜和氢
氧根结合形成氢氧化钠 , 可重新用于发酵罐中的中
和反应 。 收率可达 92 % 〔川 。 电渗析方法电耗较
高 , 装置与膜件价格也比较贵〔68 ] 。 钙盐法是一种较
为传统的有 机酸提取方法 , 向发酵液 中加人 Ca
(OH ):用来调节 pH 和生成唬拍酸盐沉淀 。 之后加
硫酸酸化 , 沉淀酸解得唬泊酸 。 有报道墟泊酸的回
收率可达 94 % 〔6, 〕, 但实际上一般仅为 60 % 一 70 % 。
传统钙盐法的一个主要缺点是同时生成了商业上无
法使用的废渣 cas o4[6‘〕。 为降低使用试剂的成本 ,
减少了副产物的生成 , 开发了用氨水来保持发酵液
的 pH , 发酵产生唬拍二胺的提取方法 , 唬拍二胺与
硫酸氢按反应生成硫酸按和琉拍酸 , 加人硫酸将 pH
降到2 以下墟拍酸结晶析出 , 过滤收集 , 并将其溶于
甲醇 , 同时沉淀出硫酸盐 。 甲醇可循环使用 , 硫酸铰
在300℃裂解转化成硫酸氢钱也可重复使用 。 E . co -
1 A F P
一
n l 发酵液采用这种提取方法 , 其唬拍酸的
回收率可达 90 % 以上〔川 。 另外 , 还有一种采用正
三辛胺萃取方法提取纯化墟拍酸的方法 。 正三辛胺
可用来选择性地萃取杂酸 , 通过控制 pH , 析出不需
要的有机酸 , 余下唬拍酸和残糖 。 残糖可通过在
4℃ 、低 pH 的条件下结晶的方法除去 。 在 M . su c i-
ni c中ro duc ens 发酵液提取唬拍酸的研究中采用这一
技术 , 其最终唬拍酸的产率为 73 .1% , 纯度为 9 .
8% 〔7。, 7 ’〕。 国内姚忠等〔7, 〕采用膜分离法 , 将墟拍酸
发酵液经微滤 、超滤后 , 活性炭脱色除杂 , 得到澄清
的珑拍酸溶液 , 调 pH 2.0 一 3 . 5 , 浓缩结晶得到唬泊
酸晶体 , 其纯度达到9 .5% 以上 。
发酵菌种产琉拍酸浓度的高低与副产物的多
少 , 也直接关系到提取操作的难易和收率的好坏 , 采
用接近唬泊酸理论产率且副产物最少的菌种进行发
酵对降低生产成本有利 , 会产生更好的经济效益 。
但采用经济 、简便 、且符合节能减排 目的的下游提取
过程和装备 , 也是发酵法生产唬泊酸能否工业化生
产的一个重要方面。
4 展望
微生物发酵方法将可再生的生物质 (如淀粉 、
纤维素 、半纤维素)原料的葡萄糖和木糖等碳水化
合物转化为墟拍酸 , 避免使用化石资源 , 生产过程环
境友好 。 同时 , 在唬拍酸发酵过程中利用消耗 C 02
(据报道每生产 1 kg 琉拍酸 , 将会有 0.137 kg 的二
氧化碳被固定[73 〕) , 有利于缓解温室效应 。 但目前
发酵法生产唬拍酸的产业化研究还刚起步 , 面临着
与石化法生产墟拍酸在生产成本上的竞争问题 。 采
用更廉价的生物质原料 , 以及采用高产率 、低副产
物 、低成本的提取工艺 , 乃是微生物发酵法生产唬拍
酸过程中迫切需要解决的问题 。
参 考 文 献
W illke T , V o rl o p K 一 D . A p p l M ie ro b io l B iot e e h n o l , 2 0( ) 4 , 6 6 : 1 3 1
2
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727 ~740.
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玩e PC , et al · B i o p roc e s s B i o s y st E n g , 2 0() 3 , 2 6 : 6 3 一 6 7 ,
肠e PC , 玩e SY , e t al . B i o t e e h n o l 反t , 2 (X) 3 , 2 5 : 1 1 1 一 1 1 4 .
此e PC h , 玩e W G , e t al . B i ot e e h n o l B i o e n g , 2 (X) l , 7 2 : 4 1 一 4 8 .
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