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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2009年第 4期
蛋白酶体抑制剂MG132的浓度对人白血病
细胞 K562凋亡的影响
贾红玲 1
朱用阳 1
赖新强 2
杨晓新3
周辉华 1
( 1暨南大学生命与健康工程研究院,广州 510632; 2 暨南大学分析测试中心,广州 510632; 3 暨南大学化学系,广州 510632 )


摘
要:
探讨蛋白酶体抑制剂 MG132在诱导人白血病 K562细胞凋亡过程中作用。分别以不同浓度的蛋白酶体抑制剂
MG132处理人白血病细胞 K562,通过 MTT法检测 K562细胞活力, 应用 Annex in
和 P I双染的细胞流式法检测 K562细胞凋
亡率和细胞内活性氧 ( ROS) 水平, 应用酶标仪法检测 K562细胞内 C aspase
3活性变化的情况。结果表明, 随着 MG132浓度
的增加, 各个指标与对照组比较差异均有显著性 (P < 0
05): K562细胞增殖明显受到抑制;细胞凋亡率明显增加, 且当 MG132
浓度为 900 nm o l/L时,细胞凋亡率达 36
5% ;同时, ROS水平和 caspase
3活性明显升高。因次,蛋白酶体抑制剂 MG132可显
著抑制人白血病细胞 K562增殖并促进其凋亡。
关键词:
蛋白酶体抑制剂 MG132
人白血病细胞 K562
细胞凋亡
Apoptosis
inducing Effect of Proteasome InhibitorMG132 w ith Various
Concentrations on Human Leukem ia K562 Cells
J iaH ongling
1
Zhu Yongyang1
La iX inqiang2
Yang X iaox in3
ZhouH uihua1
(
1
Institutes of L ife and H ealth Engineering, J inan University, Guangzhou 510632; 2Analy sis and T est Center, J inan
University, Guangzhou 510632;
3
D epartm ent of Chemistry, J inan University, Guangzhou 510632)


Abstrac:t
It was to investiga te the apoptosis
induc ing effect o f pro teasom e inhibitor ( MG132) on hum an leukem ia K562 ce lls

K562 cellw as cu ltured w ith various concentrations o f pro teasom e inh ib itor(MG132)
C ell v iab ility w as determ ined byMTT assay
C ell
apoptos is rate was assessed by Annex in V and P I sta in ing
ROS w as labeled by DCFH
DA and exam ined by flow cytom etry
C aspase

3 activ ity change was tested by EL ISA Reader
Results showed that K562 ce ll g row th was significantly inh ibited w ith the ra ised concen

tration ofMG132
The apoptosis ra te o f K562 ce ll was increased up to 36
5% at 900 nm o l/L MG132
At the sam e tim e, ROS levels
and caspase
3 ac tiv ityw ere sign ificantly increased
P roteasome inhibitor (MG132) can sign ificantly inhib it pro lification of K562 ce lls
and induce them in jury and apoptosis

Key words:
P roteasom e inh ib itorMG132
H um an leukem ia cellK562
Ce ll apoptosis
收稿日期: 2008
12
30
基金项目:国家自然科学基金 ( 30400071 )
作者简介:贾红玲 ( 1975
) ,女,新疆阜康人,硕士,主要从事分子生物学的研究; E
m ai:l jiahongling@ yahoo. com. cn


白血病是造血系统的恶性肿瘤, 是我国最常
见的恶性肿瘤之一。其特征为白血病细胞在骨髓
及其他造血组织中呈恶性、无限制地增生, 浸润全
身各组织和脏器,产生不同症状;严重危害患者的
生命健康, 白血病的病因和发病机制至今不够
明确。
同其它恶性肿瘤一样,白血病的发生也是由多
因素参与,并经历了多阶段的演变过程,涉及多种蛋
白的表达和功能异常。研究表明, 细胞周期的变化
和功能异常蛋白的蓄积在发病过程中起着重要的作
用 [ 1]。泛素
蛋白酶体通路 ( Ub iqu itin proteasome
Pathw ay,简称 UPP通路 )是生物体内进行蛋白质选
择性降解的重要途径之一, 它参与了细胞内许多重
要的生理生化过程 (如 DNA修复、细胞周期的运
转、信号传递等 ) [ 3]。本试验采用蛋白酶体抑制剂
MG132处理人白血病 K562细胞, 观察 K562细胞的
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 4期
凋亡率,以及 MG132对凋亡相关蛋白表达的影响,
探讨以 UPP为靶点 MG132调控白血病细胞凋亡的
机制。
1
材料与方法
1
1
材料
1
1
1
细胞与培养
人白血病 K562细胞由本实
验室保存,用 RPM I 1640培养液加入 10%小牛血清
培养, 以 0
25% 胰蛋白酶为消化液。将细胞置于
37
、5% CO 2的培养箱中培养。
1
1
2
试剂
蛋白酶体抑制剂 (MG132 )购自为
S igma公司产品,用二甲基亚砜 ( DM SO )溶解配成 2
mmo l /L贮存液, - 20
冻存备用; MTT为 Merk公
司产品;
Annex in V
FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云
天生物技术研究所; ( ROS)检测试剂盒购自上海杰
美基因医药科技有限公司; C aspase
3分光光度法试
剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。
1
2
方法
1
2
1
MTT法测细胞生长抑制效应
取对数生长
期细胞接种于 96孔板,每孔 5
103个细胞, 孵育过
夜后, 实验组分别给予终浓度为 300、600和 900
nmo l/L MG132,对照组给予不含 MG132的培养液,
每组设 4个复孔,用 MTT法测每孔吸光度 ( A)值。
1
2
2
A nnex inV和 PI双染色流式细胞术检测细胞
凋亡
实验组分别用终浓度为 300、600和 900
nmo l/L MG132处理 K562细胞, 对照组予不含
MG132的培养液, 均继续培养 24 h后收集细胞,用
PBS洗 2次, 采用 Annex in
和 PI荧光染色、FACS
定量分析细胞凋亡状况。
1
2
3
细胞内活性氧 ( ROS)水平测定
K562细胞
中加入 MG132至终浓度为 300、600、900 nmol /L,对
照组给予不含 MG132的培养液, 37
, 5% CO2中
孵育 24 h。由于 DCFH
DA可被细胞内的 ROS氧化
为荧光物质 DCF,故试验溶液中加入 DCFH
DA,细
胞流式法检测荧光强度即代表细胞内活性氧 ROS
水平。
1
2
4
Caspase
3活性变化测定
实验组分别用终浓
度为 300、600和 900 nmo l/L MG132处理 K562细胞,对
照组不含 MG132, 均继续培养 24 h。并收集细胞, 用
PBS洗涤细胞 2次,加入 50
l冰冷 Lysis Buffer, 吹打
均匀,置冰上裂解 60m in,其间涡旋振荡 3~ 4次,取少
量上清测定其中的蛋白浓度。吸取 50
l含 100~ 200

g蛋白的细胞裂解上清,加入 50
l2
React ion Buffer
和 5
l Caspase
3 Substrate,并于 37
避光孵育 4 h,测
定其在 405 nm下的吸光值。
1
2
5
统计学处理数据用 (均数
标准差 )表示

用 SPSS 10
0进行统计处理,统计学采用 t检验。
2
结果
2
1
MG132对 K562细胞增殖的影响
用浓度分别为 300、600和 900 nmol /L的 MG132
作用于 K562细胞 24 h后, MTT法检测显示, 细胞增
殖与 MG132浓度呈剂量依赖关系。使用 MG132后
能显著减少 K562细胞的量, 900 nmol /L 的 MG132
作用 24 h后细胞存活率降至 38% ,与无药物对照组
比差异显著 (P < 0
05)。MG132对 K562细胞的半
数生长抑制量为 778 nmo l/L, 其中浓度效应方程式
为 Y= 0
0677x - 2
7(图 1)。
图 1
MG132对 K562细胞的抑制
2
2
MG132对 K562细胞凋亡率的影响
MG132作用 K562细胞 24h后收集细胞, 用流
式细胞术检测细胞的凋亡率。正常培养的 K562细
胞经流式细胞仪检测,细胞凋亡率为 2
0%。而经
300 nmo l /L 的 MG132作用后, 凋亡率达 6
2%;
LMG132时浓度为 600 nmo l/L时, 凋亡率 24
3%;
LMG132时浓度为 L时 900 nmo ,l凋亡率达 36
5%。
结果显示, MG132诱导的 K562细胞凋亡具有剂量
效应关系 (图 2)。
116
2009年第 4期

贾红玲等:蛋白酶体抑制剂 MG132的浓度对人白血病细胞 K562凋亡的影响
图 2
MG132对 K562细胞凋亡率的影响
2
3
MG132对 K 562细胞内 ROS水平的影响
300、600 nmo l/L的 MG132作用于 K562细胞 24 h
后, ROS水平较同期对照组升高 (P < 0
05), 900 nmol/
L的MG13作用于 K562细胞 24 h后, ROS水平显著升
高 (P < 0
01)。结果表明, MG132处理后的 K562细胞
内 ROS水平与其浓度成剂量效应关系 (图 3)。
图 3
MG132作用 24 h后对 K562细胞
内活性氧 (ROS)水平的影响
2
4
MG132作用 K562细胞后对 Caspase
3活性的
影响
蛋白酶体抑制剂 MG132作用 K562细胞 24 h
后, 通过酶标仪测定, 随着时间的推移, 活化的
caspase
3蛋白表达量随着时间的推移逐渐增加, 且
K562细胞的 Caspase
3活性与 MG
132的浓度成正
相关 (图 4)。
图 4
MG132作用 K562细胞后对 Caspase
3活性的影响
3
讨论
泛素所涉及的作用路径称为泛素
蛋白酶体途
径 (UPP) ,是生物体内进行蛋白质选择性降解的重
要途径之一 [ 4, 5]。该蛋白水解途径的发现被认为是
细胞周期、细胞恶性转化和免疫学研究的转折点。
蛋白酶体抑制剂的发现为研究泛素
蛋白酶体途径
在细胞凋亡中的作用提供了直接有力的手段。研究
表明 [ 6, 7] ,蛋白酶体抑制剂通过对泛素化通路的阻
断可诱导多种人肿瘤细胞凋亡, 被认为是可成为很
有发展前途的抗肿瘤药物, 但其作用机制至今仍未
完全弄清。
陈为志等 [ 8]研究发现 MG132以呈剂量依赖性的
方式诱导白血病 K562细胞凋亡,当 MG132作用 24 h
后,细胞出现明显凋亡,且 NF

B活性明显降低,其
诱导细胞凋亡的机制就是抑制 NF

B的活性。
本试验应用不同浓度蛋白酶体抑制剂 MG132
处理白血病 K562细胞,采用细胞毒性实验 (MTT )、
流式细胞术、活性氧和 Caspase
3活性的检测, 发现
K562细胞的凋亡率与 MG132呈量效关系。
MTT实验结果显示, MG132在 300~ 900 nmo l/L
浓度范围内, MG132对 K562细胞呈浓度依赖性的增
生抑制作用,作用时间为 24 h时,达到半效抑制浓度
IC50 = 778 nmo l /L。双因素方差分析结果表明, K562
细胞的增生抑制程度与 MG132的浓度呈正相关,差
异有统计学意义;当 MG132在 300~ 900 nmo l/L浓度
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 4期
范围内,细胞凋亡率逐渐增加,在 Q4区域内, K562细
胞的凋亡率与浓度成量效反应关系, Q2区域内,随着
MG132浓度的增加, K562细胞的晚期凋亡率与浓度
成梯度关系。因次,蛋白酶体抑制剂 MG132在 K562
细胞的凋亡过程中起重要作用,细胞内活性氧 ROS
水平和 Caspase
3活性的试验结果也显示了 K562细
胞的凋亡率与 MG132呈量效关系。
蛋白酶体抑制剂可以通过改变促凋亡与抗凋亡
蛋白质的平衡,诱导凋亡或增加细胞对调亡的敏感
性。本试验将 MG132作用于 K562细胞后, 细胞增
殖明显受抑制,且呈剂量与效应成正相关关系,其中
剂量关系较显著。此外, 肿瘤是多基因变化引起细
胞周期紊乱,细胞失控性生长所导致的一类疾病,用
药物来激活细胞周期调控机制,已成为防治肿瘤的
一个可行方法 [ 9]。目前, 已发现许多抗肿瘤药物可
将肿瘤细胞阻滞在 G1 /G0, G2 /M期, 从而抑制肿瘤
的增殖。同时, 研究显示 [ 10] , MG132诱导肿瘤细胞
早期凋亡,细胞被大量阻滞在 G1 /G0期, S期和 G2/
M期细胞明显减少, 这些可能是 MG132抑制 K562
细胞增殖的机制之一, 因此蛋白酶体抑制剂涉及凋
亡调控的机制之一是其对细胞周期的影响。
MG132可以通过上调促凋亡蛋白或下调抗凋
亡蛋白的表达, 从而诱导细胞凋亡。MG132可能是
通过激活 JNK进而经死亡受体和线粒体途径激活
caspase家族而实现其诱导细胞凋亡的功能的。研
究表明, MG132作用于细胞后,引起细胞核受损、线
粒体跨膜电位减少、细胞质内大量细胞色素 C积
聚, 进而激活 caspase
3[ 11]。本试验中, MG132能够
抑制白血病细胞株 K562细胞的生长, 并可诱导其
凋亡,表现在凋亡蛋白 caspase
3高表达和细胞内活
性氧 ROS水平升高,这为白血病患者的治疗提供了
新的途径及一定的理论依据。
当然,在诱导肿瘤细胞的凋亡过程中,各种机制
都是相互影响和互为因果, 决不能单一的认为是某
一种机制的作用,当人们对 MG132诱导肿瘤细胞凋
亡的机制认识更加清楚和全面时, 可以为其在肿瘤
治疗中的提供新途径。
参 考 文 献
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