全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
甘菊 DFL EGFP高效融合蛋白表达载体的构建
王翊 付建新 戴思兰
(北京林业大学园林学院,北京 100083 )
摘 要: 增强型绿色荧光蛋白 ( enhanced green fluo rescent prote in, EGFP )是一种优化的突变型 GFP, DFL 是从甘菊中分
离出的 LFY基因的同源序列。为了研究 DFL基因的功能和表达模式,研究利用小片段克隆法将 linker序列插入到 EGFP基因
5!端启始密码子前面,在 pB I121载体的 C aMV35S启动子的 3!端后面插入一段多克隆位点,成功地构建了 pBIDFLEGFP表达
载体。通过设计特异引物, 利用 PCR技术扩增得了到拟南芥 LFY基因的启动子序列, 用粘性末端 PCR技术将 pBIDFLEGFP
表达载体中 CaMV35S启动子替换成 LFY基因启动子,构建成了 pLFYDFLEGFP表达载体。用含有 pBIDFLEGFP和 pLFY
DFLEGFP质粒的农杆菌侵染洋葱表皮细胞,在荧光显微镜下分别用蓝光激发, 均观测到了荧光。这一结果表明, 融合蛋白
DFL EGFP表达载体构建成功,同时还证明了通过 PCR技术克隆到的 LFY启动子序列具有启动子功能。
关键词: 小片段克隆 粘性末端 PCR 表达载体构建 LFY启动子 DFL EGFP融合蛋白
Construction ofH igh Expression of Fusion Protein VectorsHarboring
Enhance Green Fluorescence Protein Gene and DFL
Gene inDendranthema lavandulifolium
W ang Y i Fu J ianx in Da i Silan
(College of Landscap eA rchitecture, Beijing Forestry University, B eijing 100083)
Abstrac:t Enhanced green fluorescent protein( EGFP ) is an optim ized m utant o f GFP, andDFL is the hom o logous gene of LFY i
solated fromD endranthem a lavandu lifo lium. In o rder to study the function and expression patterns o f DFL, the linkerw ere inserted into
the front o f the 5! end in itia tion codon by them ethod o f sm a ll fragm en ts cloning in orde r to construct the fus ion pro tein, and them ultip le
clon ing site w ere inserted in to the 3! end of CaMV35S prom ote r in pBI121 vecto r, thus the expression vector o f pBIDFLEGFP w ere
successfully constructed. Design the spec ific pr im ers to ge t the LFY gene prom o ter sequence in A rab idop sis by PCR amp lifica tion. The
CaMV35S promo ter in the pB IDFLEGFP express ion vector was replaced by LFY promo ter through the sticky end o f the PCR techno lo
gy then the pLFYDFLEGFP expression vectorw as constructed. TheAgrobacter ium con taining the p lasm ids of pBIDFLEGFP and pL
FYDFLEGFP w ere used to infect the on ion epiderma l ce lls. TheAgrobacterium we re transferred by pB IDFLEGFP and pBILFYDFL
EGFP. Fuorescence w ere observed under the fluo rescencem icroscope stim ulated by b lue ligh t. The fluorescence o f them ind ica ted that
the constructs of expression vector had been successfu lly comp le ted. It also proved that theLFY prom oter cloned by PCR can dr ive other
genes expression.
Key words: Sm a ll fragments cloning Sticky end PCR Construction vec tor LFY prom oter EGFP
收稿日期: 20091029
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30871726)
作者简介:王翊,男,在读硕士,研究方向:遗传育种; Ema i:l xiaoy i399@ 126. com
通讯作者:戴思兰,教授,博士生导师; Em ai:l silanda@i gma i.l com
增强型绿色荧光蛋白 ( enhance g reen fluorescent
pro tein, EGFP)是一种优化的突变型 GFP, 它产生的
荧光较普通 GFP强 35倍, 大大增强了其报告基因
的敏感度。EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多
成功的例子 [ 1- 3] , 而且其 N端和 C端均可融合, 并
不影响其发光。相对于传统的蛋白酶报告基因,
EGFP基因编码的蛋白含有特殊的六肽生色团结
构,光激发 EGFP产生荧光是一个特异性的独立过
2010年第 2期 王翊等:甘菊 DFL EGFP高效融合蛋白表达载体的构建
程,不需要任何底物和辅助因子的参与 [ 4]。
目前, 比较常用的植物载体有 pBI121和 pCAM
B IA系列等 [ 5- 7] , 传统融合蛋白载体构建策略是选
择合适的酶切位点,或者用 PCR的方法在目的基因
的两端加上酶切位点,然后酶切、连接将目的基因和
绿色荧光蛋白基因整合到表达载体上, 转化然后筛
选获得重组子 [ 8 ]。但是这种方法应用起来比较麻
烦,特别是构建融合蛋白或者需要将目的片段连入
特定的表达载体时会受到诸多限制。
小片段克隆法改造载体首先合成两段 200 bp
以内的寡聚核苷酸单链, 然后在单链的两端加上载
体上两个切点的粘性末端序列,人工退火;最后按照
连接体系将合成好的小片段连入载体 [ 9]。用小片
段克隆法可以将一小段设计好的核苷酸链 (可以是
linker或者 MCS)连入相应的载体中。
粘性末端 PCR法 ( st icky end PCR )是设计两对
引物分别扩增目的基因, 然后将两管 PCR产物混
匀,通过变性退火形成粘性末端而将目的基因连入
表达载体 [ 10]。粘性末端 PCR法的优点是简单、高
效地将目的基因连入表达载体而不会受酶切位点的
限制。
人们已经从生理学和遗传学角度证实了成花过
程是多重调控模式 [ 11]。 LEAFY ( LFY )基因被认为
是花序分生组织转变为花分生组织的决定基因 [ 12 ]。
马月萍博士 [ 13]根据已发表 LEAFY基因同源基因的
结构特点设计特异引物, 利用 3!RACE和 5!RACE
从甘菊中获得了同源基因 DFL基因。组织原位杂
交结果表明, DFL基因在甘菊成花过程中的顶端分
生组织区域始终有不同程度的表达, 暗示它在甘菊
成花发育中起着重要作用 [ 14]。本研究通过构建
DFL和绿色荧光蛋白 ( EGFP)的融合蛋白表达载体
转化洋葱表皮细胞进行亚细胞核定位研究, 验证人
工构建的植物表达载体具有启动绿色荧光蛋白
( EGFP)的融合蛋白表达的功能。这一研究为将
pB IDFL表达载体转入植物中进行功能研究和转基
因育种奠定基础。
1 材料和方法
1. 1 试验材料、试剂和仪器
洋葱 (Allium cepa L. )球茎由中国农业科学院
蔬菜研究所提供, pEGFP质粒由中科院遗传所马泽
阳博士馈赠, pB I121 质粒, TDFL 质粒, 农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens)菌株 EHA105、大肠杆菌
( E scherichia coli )菌株 DH 5均为本实验室保存。
限制性内切酶购自 Promega公司, T4 DNA连接酶购
自 NEB公司, peasy T simple载体、DNA快速回收
试剂盒购自全式金公司。测序工作由北京奥科公
司完成。其它试剂或分析纯购自国内公司或为进
口。高渗培养基为: M S + 蔗糖 30 g /L + 甘露醇
04 mo l/L + 琼脂 55 g /L, pH 58, 荧光显微镜
( Le ica TCS2SP2)。
12 质粒构建的基本操作方法
质粒小量提取、酶切、片段回收均参照产品说明
书进行;质粒连接, 转化及筛选鉴定均按照 ∀分子克
隆实验指南#进行 [ 8 ]。
13 植物表达载体的构建策略
植物表达载体的构建分为如下几步进行: ( 1)
利用小片段克隆法在 pEGFP的 BamH ∃和 N co∃之
间插入由 7个甘氨酸和 1个色氨酸组成的 linker,用
含有多克隆位点的小片段取代 pB I质粒中 GUA基
因, 完成对 pEGFP和 pB I质粒的初步改造, 为下一
步试验打下基础; ( 2)设计引物对 DFL基因的终止
密码子突变, 将删除终止密码子的 DFL基因连入
pEGFP质粒, 构建完成 DFL EGFP融合蛋白基因。
( 3)将 DFL EGFP融合蛋白基因连入用 Sal∃和
Sp e∃双酶切 pB IMCS质粒, 构建完成 pBIDFLEG
FP表达载体; ( 4)利用粘性末端 PCR将克隆的拟南
芥 LFY启动子连入经过 H ind %和 Sal∃双酶切的
pBIDFLEGFP表达载体, 构建完成 pLFYDFLEG
FP表达载体。
131 pEGFP载体上添加 linker序列 linker链是
一段特殊的小多肽链,主要由甘氨酸组成,在目的基
因和绿色荧光蛋白之间插入一段 linker链可以保证
目的基因蛋白和绿色荧光蛋白氨基酸序列的正确折
叠 [ 15] , 国内对这方面的报道较少。 linker的合成如
下: 先设计两条 25 bp的寡聚核苷酸链交由北京奥
科公司合成,寡聚核苷酸链的设计;正义链 linker S:
5!GATCCGGTGG AGGTGGAGGA GGCAC3!(含有
BamH I酶切位点粘性末端 )反义链 linker A: 5!
CATGGTGCCT CCTCCACCTC CACCG3!(含有 N co I
酶切位点粘性末端 )人工退火, 95& 10 m in, 然后每
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
分钟降 5& 直至降至 linker链的 Tm值下 5& , 维持
10 m in即可。将合成的 linker链连入经过 BamH I
和 N co I双酶切的 pEGFP载体, 构建完成 pEGFP
linker载体。
132 在 pB I121载体上添加 MCS序列 pB I121
双元表达载体是目前广泛使用植物表达载体, 但是
载体上酶切位点较少,增加了载体构建的难度,通过
小片段克隆法用人工合成的一段多克隆位点 ( mult i
ple c loning site, MCS)取代 pB I121载体上的 GUS基
因,构建完成 pB IMCS载体,方便目的基因的插入。
合成含有 Sal I、Spe I、BamH I、Kpn I、Sac I酶切位点
的寡聚核苷酸链, 设计如下: 正义链 MCSS: 5!
GATCGACCGTCGACGGGACTAGTCCGGGTACCCG
GCGGATCCGCCGAGCT3!(含有 BamH I酶切位点
粘性末端 划横线部分 ) ;反义链 MCS A: 5!CGGCG
GATCCGCCGGGTACCCGGACTAGTCCCGTCGACGG
TC3!(含有 Sac I酶切位点粘性末端 )。人工退火,
95& 10m in, 然后每分钟降 5& 直至降至 MCS链的
Tm值以下 5& 为止, 维持 10 m in即可。将合成的
MCS链连入 BamH I和 Sac I双酶切 pBI121载体。
133 pEGFP linkerDFL中间载体构建 真核生
物起始转录和翻译过程中, 核糖体结合位点由起始
密码子所决定, 在某些起始密码子上游邻接序列也
可能十分重要,被称为 KOZAK序列 ( ACCAUGG ) [ 16]。
DFL引物设计如下:
Forw ard: 5!GCGTCGACCATGGACCCTGATG
CACTTTC3!(下划线部分为 Sal I酶切位点, 斜体
部分为 KOZAK序列 );
Reverse: 5!CGGGATCCGAAGAGCATATAAC
CAACACCAC3!(画横线部分为 BamH I酶切位点,
DFL终止密码子已经被删除 )。
将删除终止密码子的 DFL序列连入 pEGFP lin
ker,构建完成 pEGFP linkerDFL中间载体。
134 pB IDFLEGFP及 pLFYDFLEGFP表达载
体构建 利用 Sal I和 Sp e I双酶切 pEGFP linker
DFL载体,然后将 DFL EGFP融合蛋白连入 PB I
MCS载体中构建完成 pB IDFLEGFP表达载体。
为了对拟南芥 lfy5突变体进行互补试验,通过
PCR方法从野生 Ler型拟南芥基因组 DNA中扩增
获得 LFY启动子 [ 12, 17]。LFY启动子引物序列: For
ward: 5!CCATCGATGTAATGGG
CTGACCGAGAAGATATAAA3!; Reverse: 5!
CGTGAAACCTTCAGGATCCATAATCTA3!;
扩增获得的 LFY启动子序列全长 2 236 bp, 利
用网站 ( http: / /www. fruitf ly. org /seq_tools /promoter.
htm l)对启动子序列初步分析, 认为这段序列有启动
子功能。
构建 pLFYDFLEGFP表达载体分两步进行,第
一步对 pB IDFLEGFP和 LFY启动子序列酶切位点
进行分析,由于 LFY启动子序列中含有H ind%酶切
位点,不能以常规策略构建 pLFYDFLEGFP表达载
体, 所以参照粘性末端 PCR法 ( Sticky end PCR )构
建 pLFYDFLEGFP表达载体 [ 10 ] (图 1)。LFY启动
子序列粘性末端 PCR引物设计如下: LFY ( p) ∃ For
ward: 5! AGCTTg taatgggctgaccgagaagatataaa3!; R e
verse: 5! Ccg tgaaaccttcaggatccataa tcta3!; LFY ( p ) ∋
Forw ard: 5! Tg taatgggctgaccgagaagatataaa3!, R evers:
5!TCGACcgtgaaaccttcaggatccataatcta3!(前端大写字
母部分表示H ind%和 Sal∃的粘性接头, 小写字母
是 LFY启动子序列的扩增引物 )。第二步 PCR扩增
程序为 94& 3m in; 94& 40 s; 55& 30 s; 72& 105 s;
72& 5m in; 30个循环, 20& ho ld。 PCR产物经过琼
脂糖电泳检测,按等摩尔比混匀后用试剂盒纯化,将
纯化后的 PCR产物 95& 5 m in, 65& 10 m in, 然后
4& 保温。然后将退火后的 PCR产物连入经过H ind
%和 Sal∃双酶切的 PBIDFLEGFP载体中,构建完
成 pLFYDFLEGFP表达载体 (图 2)。
图 1 LFY启动子粘性末端的获得
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2010年第 2期 王翊等:甘菊 DFL EGFP高效融合蛋白表达载体的构建
图 2 pEGFP linkerDFL结构示意图
14 植物表达载体的荧光检测
将含有 pBIDFLEGFP和 pLFYDFLEGFP的
质粒分别导入农杆菌 EHA105菌株; 挑菌、摇菌、并
经过菌液 PCR鉴定后, 用含有 pB IDFLEGFP和
pLFYDFLEGFP质粒的农杆菌侵染洋葱表皮细
胞 [ 18, 19 ] , 用压片法制片, 于荧光显微镜下观察并
拍照。
2 结果和分析
21 载体构建
211 pEGFP linker和 pB IMCS载体构建结果
MCS链 (图 3,泳道 1)和 linker链 (图 2, 泳道 3)经过
凝胶电泳检测合格后分别与经过 BamH I和 N co I
双酶切的 pEGFP载体和经过 BamH I和 Sac I双酶
切的 pB I121载体连接得到新质粒 pEGFP linker、
pB IMCS。
以 CaMV35S启动子的序列设计引物, 35S For
ward: 5!AAAGAATGCTAACCCACAGATG3!; 35S
Reverse: 5!CAAATGAAATGAACTTCCTTAT3!; 以
EGFP基因的序列设计一段下游引物, EGFP Re
verse: 5!CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG3!。以
MCS链反义单链 MCS A的序列设计一段下游引物
用于质粒 pB IMCS的检测, MCS R everse: 5!GTAC
CCGGACTAGTCCCGTCGA3!。
以 35S Forw ard、MCS R everse, pB I121质粒为
模板,作为 CK 1 (阴性对照 ) ; 以 35S Forw ard、35S
Reverse为上下游引物, pB IMCS质粒为模板, 作为
CK2(阳性对照, 检测 PCR体系的可靠性 ) ; 用 lin
ker链的正义单链 linker S作为上游引物, EGFP
R everse为下游引物, 以质粒 pEGFP linker为模板,
PCR扩增的长度约 800 bp。同理, 以 35S Fo rw ard
为上游引物, MCS Reverse为下游引物,以质粒 pE
B IMCS为模板, PCR扩增的长度约 800 bp; 用
PCR方法挑选 pB IMCS的重组质粒, 通过 PCR方
法得到两条约 800 bp的条带 (图 3,泳道 2和泳道
4) ,经过测序, 载体构建成功。
M. 2 KB DNA分子量标记; CK1.阴性对照; CK2.阳性对
照; 1. MCS合成; 2. pB IMCS质粒 PCR检测; 3. linker合
成; 4. pEGFP l inker质粒 PCR
图 3 重组质粒 pEGFP linker和 pBIMCS检测
及 linker链和 MCS链合成
21 2 pEGFP linkerDFL中间载体构建结果
使用 PCR技术可以快速鉴定出重组质粒, 但是也
存在假阳性的问题, 而设计严密酶切试验鉴定重
组质粒行之有效。连接产物电泳可以比较直观
的看到质粒重组的情况; pEGFP linker质粒 H in d
%和 E coR∃双酶切作为阴性对照 ( CK2 ) ; pEGFP
linkerDFL质粒分别用 H in d%和 E coR∃、BamH
∃和 Sa l∃双酶切可以提高筛选重组质粒的准
确性。
取 5 L经过 BamH∃和 Sal∃双酶切 DFL片
段和 pEGFP linker连接产物电泳 ( CK 1) ; pEGFP
linker质粒 H in d %和 E coR∃双酶切 ( CK 2)后得
到 26 kb和 08 kb左右条带。 pEGFP linker
DFL质粒用 H ind %和 EcoR∃双酶切后得到 4 6
kb、26 kb、2 kb 3条带 (图 4, 泳道 1 ) , pEGFP
linkerDFL质粒 BamH ∃和 Sal∃双酶切后得到
34 kb和 12 kb左右的条带 (图 4, 泳道 2 )。经
过测序和结合酶切图说明 pEGFP linkerDFL质
粒构建成功。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
M. 15 kb DNA ladder. CK1.连接产物; CK2. pEGFP l inker
H ind %和 EcoR ∃酶切; 1. pEGFP linkerDFL H ind%和
EcoR∃酶切; 2. pEGFP l ink erDFL B amH∃和 Sal∃酶切
图 4 pEGFP linkerDFL载体酶切鉴定
213 pB IDFLEGFP及 pLFYDFLEGFP表达载
体构建结果 质粒. pEGFP linkerDFL经过 Sal∃和
Sp e∃双酶切后回收 DFL EGFP融合蛋白基因片段
后与 pB IMCS质粒经 Sal∃和 Sp e∃双酶切后回收
的大片段连接得到重组质粒 pB IDFLEGFP(图 5)。
质粒 pB IDFLEGFP经 H ind%和 Sp e∃双酶切后得
到 12 kb和 3 kb左右的片段 (图 6, 泳道 3和泳道
4) ,结合测序结果, 质粒 pB IDFLEGFP构建成功。
质粒 pBIDFLEGFP经过H ind %和 Sal∃双酶切后
回收大片段与通过粘性末端 PCR技术得到的拟南
芥 LFY基因启动子序列连接得到重组质粒 pLFY
DFLEGFP(图 7), 质粒 pLFYDFLEGFP经 Sal∃和
Sp e∃双酶切得到 14 kb和 2 kb左右的条带 (图 6,
泳道 1和泳道 2) , 结合测序结果, 质粒 pLFYDFL
EGFP构建成功。
图 5 pBIDFLEGFP结构示意图
M. 15 kb DNA ladder; CK. pB I121质粒; 1- 2. pLFYDFL
EGFP Sa l∃ 和 Spe∃ 双酶切; 3 - 4. pB IDFLEGFPH ind
%和 Spe∃双酶切
图 6 pLFYDFLEGFP及 pBIDFLEGFP
表达载体酶切
图 7 pLFYDFLEGFP结构示意图
22 携带 pB IDFLEGFP及 pLFYDFLEGFP质粒
的农杆菌荧光检测
用含有 PB IDFLEGFP及 PLFYDFLEGFP质
粒的农杆菌侵染洋葱表皮细胞 (农杆菌浓度 OD =
06;侵染时间 20 m in), 暗培养 2 d后,从平板上取
下洋葱表皮小块,用压片法制片; 同时用镊子夹着滤
纸醮一下平板上洋葱表皮附近长出来的农杆菌, 涂
在载玻片上制成片子。用荧光显微镜 (型号: Lecia)
在蓝色激发光进行荧光检测, 用显微镜配套的数码
成像系统拍照记录。通过观察我们发现, 将 35S强
启动子和克隆到的拟南芥 LFY启动子驱动的 DFL
EGFP均定位在洋葱表皮的细胞核, 但是在细胞
质膜和内膜上也有分布 (图 7A和 C ) ; 但是 35S启
动子的效率优于拟南芥 LFY启动子 (图 7A、C、B和
D ),拟南芥 LFY启动子是一个植物基因的启动子,
在农杆菌就能表达说明其启动效率是比较好。
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2010年第 2期 王翊等:甘菊 DFL EGFP高效融合蛋白表达载体的构建
A.洋葱表皮细胞在转化载体 pB IDFLEGFP 16 h后在荧光显微镜下的观测结果 ( 40X ); B.农杆菌在转化载体 pB IDFLEGFP 16 h
后在荧光显微镜下的观测结果 ( 20X) ; C.洋葱表皮细胞在转化载体 pLFYDFLEGFP 16 h后在荧光显微镜下的观测结果 ( 20X );
D.农杆菌在转化载体 pLFYDFLEGFP 16 h后在荧光显微镜下的观测结果 ( 20X)
图 7 洋葱表皮细胞和农杆菌的荧光观测 (蓝光激发 20 mo l/m2 s1 )
3 讨论
本研究使用小片段克隆法成功地构建了 pB I
MCS 和 pEGFP linker 载 体, pB IMCS 载 体 在
CaMV35S启动子的 3!端增加了 5个常用的多克隆
位点, 将 DFL EGFP基因连入 pB IMCS构建完成
的 pBIDFLEGFP表达载体, 通过荧光检测证实
pB IDFLEGFP表达载体的构建和 pB IMCS的改造
很成功 (图 7A、B) ,而新增加的多克隆位点很方便
以后目的基因的替换。
通过 PCR技术克隆到的拟南芥 LFY基因启动
子序列中包含有H in d %酶切位点, 将 pB IDFLEG
FP表达载体上 CaMV35S启动子替换成 LFY基因启
动子时常规的载体构建策略难以实现, 使用粘性末
端 PCR技术可以快速高效地完成 pLFYDFLEGFP
表达载体的构建。值得一提的是,将 pLFYDFLEG
FP表达载体导入农杆菌在荧光显微镜下可以观测
到荧光 (图 7D), 说明克隆得到的拟南芥 LFY启动
子的启动效率很好。目前, 植物的转基因育种中主
要用的烟草花叶病毒的 CaMV35S组成型启动子, 这
种启动子的功能很强,但是其组成型表达对植物体
来说是一种浪费,而且也会对植物体造成伤害,下一
步研究可以克隆甘菊 DFL基因的启动子序列并对
其功能进行研究, 有望用于菊花转基因改良花期的
育种中。
利用农杆菌侵染洋葱表皮细胞,对 DFL EGFP
融合蛋白进行了亚细胞核定位的初步研究。研究显
示 DFL蛋白主要分布于细胞核,但是在细胞质膜和
内膜上也有分布,因此推测 DFL蛋白的定位信号肽
可能有质膜、内膜和细胞核定位的功能,也有可能是
DFL蛋白在细胞质中内质网上的核糖体上合成以
后, 在核定位信号肽的引导下, 经过转运进入细胞
核, 因此有必要对 DFL基因的功能做进一步研究。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
而添加的 KOZAK序列对 DFL基因转录效率的影响
还需要进一步试验验证。
致谢: 本文作者衷心感谢导师戴思兰教授给予的无微不
至的关怀和指导, 衷心感谢马泽阳博士和孙翊博士提供试验
材料和在试验过程中提供的建议。
参 考 文 献
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