全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
甜菜 NADH-NR基因的克隆和序列分析
丁广洲1，2 侯静2 陈丽1 马凤鸣2 陈连江1，2
(1中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨 150080;2东北农业大学农学院，哈尔滨 150030)
摘 要: 利用同源序列克隆方法从标准偏高糖型甜菜品种甜研 7 号(Ty7)中获得氮素诱导 NADH-NR 基因片段，通过
RACE技术克隆 NADH-NR基因全长序列。该基因 ORF长度 2 718 bp，编码 905 个氨基酸，包括 147 bp 的 5 UTR和 382 bp 的
3 UTR，GenBank上的注册号为 EU163265，基因编码蛋白的等电点为 6. 12，推测分子量大小为 102 kD，C端(778 － 891 aa)有一
个跨膜区域。基因编码多肽含有 3 个氧化还原功能区:钼辅因子功能区(eukary NR Moco，93 － 478aa) ，Fe-血红素结合区(Cyt-
b5，535 － 608 aa) ，FAD结合区(FAD binding 6，653 － 760 aa)。在甜研 7 号 NR 下游的氨基酸残基中含有 NADH-NR 特有的
CGPPP-M基序，说明该蛋白以 NADH 为电子供体。通过比对，甜研 7 号的 NADH-NR基因与菠菜 NADH-NR基因同源性最高，
为 86. 18%。经 Southern杂交检验，甜研 7 号中 NADH-NR基因以低拷贝数存在。经基因组克隆分析，甜研 7 号 NADH-NR含
有 3 个内含子，4 个外显子。
关键词: 甜研 7 号 NADH-NR基因 克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of the NADH-NRGene in
Sugar Beet (Beta vulgaris L．)
Ding Guangzhou1，2 Hou Jing2 Chen Li1 Ma Fengming2 Chen Lianjiang1
(1Sugar Beet Institute of Chinese Academy of Agricultural Science，Harbin 150080;
2Agronomy College of Northeast Agriculture University，Harbin 150030)
Abstract: A cDNA clone related to nitrate reduction was isolated by Homology-based cloning． According to its sequences infor-
mation，a novel full-length cDNA termed NADH-NR(GenBank number:EU163265)was obtained using rapid amplification of cDNA
ends(RACE)． NADH-NR was 3 247 bp long containing a 2 718 bp ORF，flanked by a 147 bp 5-UTR and a 328 bp 3-UTR． It enco-
ded 905 amino acids with a theoretical molecular weight of 102 kD and an isoelectric point of 6. 12． Hydropathy and transmembrane
motif analysis of deduced amino acid sequences indicated that NADH-NR possessed a transmembrane spanning domain(778 － 891 aa)．
The result of the conserved domains analysis indicated that NADH-NR has a Mo-MPT(Nitrate reducing active site;93 － 478 aa) ，and
contained a Cytochrome b(Cb) (Binds Heme-Fe;535 － 608 aa) ，a active site Binds FAD(653 － 760 aa) ，all of which are all highly
conserved region of nitrate reductase． There is a CGPPP-M motif which specifically belongs to NADH-NR in the downstream of amino
acids encoded by sugar beet NADH-NR． The homology of deduced amino acid of sugar beet NADH-NR and deduced amino acid of
spinach NADH-NR is the highest(86. 18%)． Southern blot proves that NADH-NR gene of sugar beet exists in the form of low copy，
and the NADH-NR gene of sugar beet contains four exons and three introns
Key words: Ty7 NADH-NR gene Cloning Sequence analysis
收稿日期:2011-04-12
基金项目:黑龙江大学博士科研基金项目(B80211) ，国家自然科学基金项目(30571096)
作者简介:丁广洲，男，博士，助理研究员，研究方向:甜菜品质资源学和分子生物学;E-mail:dgz3227@ 163． com
通讯作者:马凤鸣，教授，E-mail:fengming_ma@ sohu． com;陈连江，研究员，E-mail:chen4004@ 163． com
NR基因是植物氮代谢中的重要调节基因，也
是限速基因［1］。前人的研究认为，NR 基因编码的
硝酸还原酶是存在于胞质中可溶的电子转运蛋白，
一般单体包含一个 100 kD 左右的多肽。还原硝酸
盐到亚硝酸盐的过程经还原吡啶核苷酸，辅酶
(NADH)或辅酶磷酸盐(NADPH)催化，电子的转移
2011 年第 10 期 丁广洲等:甜菜 NADH-NR基因的克隆和序列分析
一般是通过亚铁血红素结合酶，黄素腺嘌呤二核苷酸
(flavin adenine dinucleotide，FAD)和钼因子(Mo cofac-
tor)的调节［2］。目前，NADH-NR基因至少已在以下高
等植物中被克隆，包括菠菜、笋瓜、烟草、拟南芥、水稻、
大豆、玉米、番茄、桃、菜豆、大麦、马铃薯、甘蓝型油菜、
蓖麻及矮牵牛等［3 －18］。目前，还没有其他的关于甜菜
NADH-NR基因全序列被克隆注册的报道。本研究采
用同源序列克隆和 RACE技术克隆甜菜氮同化的限速
酶 NADH-NR基因，明确 NADH-NR基因的序列特征，
为研究其表达与调控途径奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试品种为黑龙江省甜菜(Beta vulgaris L．)主
栽二倍体(diploid plant species)纯系品种甜研 7 号，
原种由中国农科院甜菜研究所提供。种子在室温下
浸种 7 h，置于培养皿中 25℃恒温培养 24 － 48 h 萌
发，定植至营养钵中，置于光照培养箱中培养，待植
株长到 2 － 4 对真叶时进行硝酸钾(30 mmol /L
KNO3)诱导处理，然后用于试验操作。
1. 2 方法
1. 2. 1 RACE技术克隆 NR 基因 取硝酸钾诱导
后的甜菜叶片 0. 1 g，使用 Trizol 试剂盒(Invitrogen，
USA)提取总 RNA，电泳检测其质量，－ 70℃保存。
前期利用同源序列克隆技术筛选拼接得到一个
1 438 bp NR 基因片段。采用 SMARTTM RACE cD-
NA Amplification Kit(Clontech，USA)进行 5端和
3端的 RACE 反应。根据中间片段设计基因特异性
引物(GSP) (表 1)。以 5GSP 与 UPM 引物扩增基
因的 5端，反应程序:5 个循环(94℃ 30 s，72℃ 3
min) ;5 个循环(94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min) ;
20 个循环(94℃ 30 s，58. 7℃ 30 s，72℃ 3 min) ，4℃
保存。以 3GSP与 UPM 引物扩增基因的 3端，反应
程序:5 个循环(94℃ 30 s，72℃ 3 min) ;5 个循环
(94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min) ;25 个循环(94℃
30 s，62℃ 30 s，72℃ 3 min) ，4℃保存。将 PCR 产
物电泳条带切下，按照 TIAN gel Midi Purification Kit
使用说明书回收 PCR 产物。将回收产物连接到
pEASY-T1 载体上，转化连接产物到 Trans1-T1 感受
态细胞中。挑取白色单克隆培养，使用通用引物
M13 正反向引物(表 1)鉴定阳性克隆。
表 1 试验中采用的引物及序列
引物 序列 (5 － 3)
5RACE CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG
3RACE TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT
CGCGGTTCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG
S152 CAGCATCTGTCGATCGCCAGT
A2830 CCATCTTATCCAAATTAGGCTGC
通用引物 GTAAAACGACGGCCAG-3
CAGGAAACAGCTATGAC
1. 2. 2 序列比对 将选取的阳性克隆测序，根据测
序结果拼接出基因的全长序列。应用 NCBI 的 ORF
finder 软件对全长 cDNA 序列进行可读框架分析;利
用 BLAST P 程序在 NCBI 网站通过同源性比对验证
基因的完整性，并进行保守结构域分析;蛋白质等电
点和分子量计算 http:/ /www． expasy． ch /cgi-bin /pi;
利用 DNASTAR 中的 EditSeq计算 cDNA序列的 GC
含量;利用 ClustalX 1. 83 和 BOXSHADE 3. 21 在线
软件 (http:/ /www． ch． embnet． org / software /BOX _
form． html)进行氨基酸序列相似性比对分析;根据
TMPRED网站 (http:/ /www． ch． embnet． org / software /
TMPRED_form． html)和 Antheprot 软件进行跨膜分
析。根据 http:/ /bioweb． pasteur． fr / intro-uk． html 预
测甜研 7号 NADH-NR编码蛋白 C端的跨膜结构。
1. 2. 3 Southern杂交 以 Hind III，BamH I，EcoR I
和 DraⅠ四种常用酶对甜研 7 号基因组进行了酶解，
经电泳与转膜、预杂交和杂交，然后检测照相，以分析
NADH-NR基因在甜研 7号基因组中的拷贝数。
1. 2. 4 以基因组为模板的 NR 基因克隆和内含子
分析 CTAB法提取甜菜叶片总 DNA，取溶解后的
DNA稀释 50 倍，然后以去离子水做对照，紫外分光
光度计检测 DNA 的纯度。以基因组 DNA 为模板，
以 S152 和 A2830 为引物(表 1)进行 PCR 扩增，
94℃5 min;94℃30 s，60℃30 s ，72℃3 min，25 个循
环;72℃10 min;4℃保存。将 PCR 产物电泳条带切
下，按照 TIAN gel Midi Purification Kit 使用说明书
回收 PCR 产物。将回收产物连接到 pEASY-T1 载
体上，转化连接产物到 Trans1-T1 感受态细胞中。
挑取白色单克隆培养，鉴定阳性克隆，测序。采用相
关分析软件对基因的内含子进行分析。
19
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
2 结果
2. 1 NADH-NR基因的克隆
采用 RACE技术对前期研究获得的 1 438 bp的
中间片段进行全长序列克隆，3RACE 克隆获得了 1
109 bp的序列(图 1) ;5RACE 克隆获得了 803 bp
的序列(图 2) ，回收产物利用通用引物鉴定，显示克
隆结果较好。使用 contig Express 软件将 5RACE
序列、中间序列和 3RACE 序列拼接，获得全长序列
3 247 bp，找到了完整的 ORF。甜菜甜研 7 号
NADH-NR cDNA全序列共 3 247 bp，含有一个 2 718
bp的开放阅读框(ORF) ;包括 147 bp 的 5非翻译
区(UTR)和 382 bp 的 3非翻译区。该序列编码
905 个氨基酸，分子量大小为 102 kD(ExPASy 的分
子量分析) ，等电点为 6. 12。将全序列提交 NCBI的
GenBank注册，注册序列号为 EU163265。
M． DL2000 marker;1 － 5． cDNA 3端巢式 PCR
图 1 拼接序列的 3RACE的 inner PCR电泳检测
M． DL2000 marker;1 － 6． cDNA 5端巢式 PCR
图 2 5RACE的 inner PCR电泳检测
2. 2 NADH-NR基因编码蛋白序列特性分析
在 cDNA编码蛋白的氨基酸序列中(ABW05098)，
Gly含量最多为 7. 85%。编码蛋白的氨基酸序列中含
有 14个 Cys，说明编码产物中可能含有二硫键。现有
的研究表明，植物 NADH-NR 编码蛋白 C 端都具有
二肽(Cys-Gly)保守的基序(motif)。在甜研 7 号
NADH-NR基因编码氨基酸序列下游的氨基酸残基
中含有 NADH-NR特有的 CGPPP-M 基序(图 3) ，其
功能为专一绑缚 NADH，说明该蛋白以 NADH 为电
子供体，属于专一型 NADH-NR。
经比对，甜研 7 号 NADH-NR 的 cDNA 编码产
物与同属藜科的菠菜的 NR基因编码的蛋白的同源
性最高，为 86. 18%(图 4)。两基因编码产物除了
在各功能区域具有较高同源性外，在其他区域也有
较大的相似性。
图 3 NADH-NR特有的 CGPPP-M保守的基序
如图 5 所示，分析甜研 7 号 NADH-NR 基因
编码蛋白的结构域，从第 93 个氨基酸开始进入 3
个氧化还原中心的功能区(MoCo、Fe-血红素、
FAD) ，其中第 93 － 478 位氨基酸为钼辅因子功
能区(eukary NR Moco) ，含有 386 个氨基酸残基;
第 535 － 608 位氨基酸为 Fe-血红素结合区(Cyt-
b5) ，含 75 个氨基酸;第 653 － 760 位氨基酸为
FAD 结合区(FAD binding 6)。第 779 － 888 位氨
基酸为连接 FAD 和 NAD 的铰链(NAD binding
1)。
29
2011 年第 10 期 丁广洲等:甜菜 NADH-NR基因的克隆和序列分析 39
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
图 4 软件分析的甜菜 NADH-NR和菠菜 NADH-NR
基因编码氨基酸的同源性比较
图 5 甜研 7 号 NADH-NR基因编码蛋白的结构域
根据 TmPred的疏水曲线预测甜研 7 号 NADH-
NR基因编码产物的 C 端可能含有跨膜区，经 An-
theprot分析的跨膜曲线更能直观地说明这一点。从
图 6 中可以看出，蛋白 C 端是一个跨膜区。图 7 是
http:/ /bioweb． pasteur． fr / intro-uk． html 预测的甜研
7 号 NADH-NR C端的跨膜结构。
图 6 Antheprot软件分析的编码蛋白的跨膜曲线
图 7 甜研 7 号 NADH-NR编码蛋白 C端跨膜结构的预测
2. 3 Southern杂交
与甜菜同属藜科的菠菜 NADH-NR基因是单拷
贝［17］，在进行杂交试验前，我们推断甜研 7 号
NADH-NR基因在基因组中也应以单拷贝形式存
在，但从 Southern 杂交印记结果判断，甜研 7 号
NADH-NR基因为 1 － 3 个拷贝即低拷贝(图 8)。
49
2011 年第 10 期 丁广洲等:甜菜 NADH-NR基因的克隆和序列分析
M． 1 kb Ladder Mark;1． Dra I ;2． BamH I ;3． Hind III ;4． EcoR I
图 8 Southern杂交印记检测
2. 4 以基因组为模板的 PCR扩增及基因克隆和内
含子分析
为了探索甜菜 NADH-NR基因有无内含子序列，
以便对该基因的结构有更多的了解，提取甜研 7 号叶
片的 DNA，用 RNase A去除 RNA污染后，在 gDNA基
因两端设计引物(S152、A2830)对甜研 7 号基因组进
行了扩增，获得了约 6. 2 kb的扩增产物(图 9 )。
M． DL15000 Marker;1 － 5．扩增的 gDNA序列
图 9 gDNA PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
回收扩增产物，连接 pEASY-T1 载体上，转化大
肠杆菌 Trans1-T1，经过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，
接种到 LB液体培养基中过夜培养，从大肠杆菌中
提取出重组质粒，采用双酶切鉴定重组质粒，验证插
入片段，然后挑选其中一个克隆，进行序列测定。经
测序获得 6 346 bp的 DNA序列，经序列比对显示该
基因含 4 个外显子和 3 个内含子(图 10) ，其外显子
与内含子连接区与经典剪接序列 GT /AG 基本吻合
(表 2)。4个外显子长度分别为1 022 bp，141 bp，234
bp 和 1 321 bp;3 个内含子长度分别为 197 bp，1 088
bp和 2 343 bp。与 cDNA 序列相比对，该序列多出
了 3 个内含子，除此之外与 cDNA序列基本相同(图
11)。将 该 序 列 提 交 GenBank 注 册，注 册 号
为 EU571714。
图 10 甜菜 NR mRNA CDNA 和 DNA 序列的比较
表 2 甜研 7 号 NADH-NR的内含子与外显子结合区序列及内含子大小
内含子 位置 大小(bp) 5端结合序列 3端结合序列
1 1023 － 1219 197 CAAATACTGA /aggtatatat ttaaatttgc /AGCTTGGTGG
2 1362 － 2449 1088 TGCTTATTCT /ggtatgtttt aaattgtaca /GGAGGAGGAA
3 2683 － 5025 2343 GGAATGTCAT /ggtaaaaact tgtaaatgta /GGGTATGATG
小写字母表示内含子边界序列，大写字母表示外含子边界序列
图 11 甜菜 NADH-NR gDNA的基因结构分析
59
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
3 讨论与结论
目前，生产上所采用的栽培糖甜菜大多是高度
杂合的多倍体品种，基因组成比较复杂，因此选用当
前栽培面积比较大的标准偏高糖型二倍体纯系甜菜
品种甜研 7 号，利于试验操作和结果分析。
高等植物 NR 的基因高度保守，基因编码区的
核苷酸序列具有较高的同源性，但其中的内含子数
不等。甜菜 NR DNA 的外显子序列与菠菜的同源
性达到 78%，而内含子序列在进化期间发生了较大
的分化，甜菜 NR DNA 的内含子相对菠菜要大，两
者也不处于同样的位点，相比较之下，甜菜 NR DNA
的内含子靠近 5端较早出现，且每个内含子大小均
是菠菜的 1. 10 － 1. 71 倍。位于甜菜 NR 基因的
25 － 510 位含有 TATA框和 CAAT框，与菠菜的这一
区域有 75%的同源。这表明两基因的表达调节似乎
是相似的，但在这一序列的上、下游则不具同源性。
甜菜 NR基因可编码 905 个氨基酸残基组成的蛋白，
其大小较番茄(911 个氨基酸)、拟南芥(917 个氨基
酸)和菠菜(926个氨基酸)都小。这种较大内含子的
基因作用与调控机制还有待于进一步研究。
与甜菜同属藜科的菠菜的 NADH-NR基因是单
拷贝，甜菜 NADH-NR 基因为 1 － 3 个拷贝即低拷
贝。根据克隆结果，基因组序列与 cDNA 序列间只
存在 4 bp的差异，说明二者是同一条基因。所以关
于甜菜 NADH-NR基因的拷贝数应通过增加限制酶
的数量和重复试验继续加以验证。
本研究从二倍体纯系甜研 7 号中克隆得到了甜
菜的 NADH-NR基因，该基因 ORF长度 2718 bp，编码
905个氨基酸。编码蛋白的等电点为 6. 12，推测分子
量大小为 102 kD，C 端(778 － 891 aa)有一个跨膜区
域。该基因编码多肽含有 3个氧化还原功能区。甜研
7号的 NADH-NR 与菠菜 NADH-NR 同源性最高，为
86. 18%。经 Southern杂交检验，甜研7号中NADH-NR
基因以低拷贝数存在。经基因组克隆分析，甜研 7 号
NADH-NR含有 3个内含子，4个外显子。
参 考 文 献
［1］Tucker DE，Allen DJ，Ort DR． Control of nitrate reductase by circa-
dian and diurnal rhythms in tomato． Planta，2004，219:277-285．
［2］Wang LQ，Wang Y，Dong Y，Wang WB． Induced activity of nitrate
reductase by nitrate and cloning of nitrate reductase gene． Chinese
Journal of Biotechnology，2003，19(5) :632-635．
［3］Vaucheret H，Vincenta M，Kronenberger J，et al． Molecular cloning
and characterization of the two homeologous genes coding for nitrate
reductase in tobacco． Mol Gen Genet，1989，216:10-15．
［4］Cheng CL，Dewdney J，kleinhofs A，et al． A new locus(NIAI)in Ar-
abidopsis thaliana encoding nitrate reductase． EMBO J，1988，7:
3309-3314．
［5］Crawford NM，Smith M，Bellissimo D，Davis RW． Sequence and ni-
trate regulation of the Arabidopsis thaliana mRNA encoding nitrate
reductase，a metalloflavoprotein with three functional domains． Proc
Natl Acad Sci USA，1988，85:5006-5010．
［6］Wilkinson JQ，Crawford NM． Identification of the Arabidopsis CHL3
gene as the nitrate reductae structural gene NIA2． Plant Cell，1991，
3:461-471．
［7］Choi H，Kieinhofs A，An G． Nucleotide sequence of rice nitrate re-
ductase gene． Plant Mol Biol，1989，13:731-733．
［8］Hoff T，Stummann BM，Henningssen KW． Cloning and expression of
gene encoding a root specific nitrate reductase in bean(Phaseolus
vulgaris)． Physiol Plant，1991，82:197-204．
［9］Jensen PE，Hoff T，Moiler MG，et al． Identification and characteriza-
tion of a nitrate reduetase gene from bean(Phaseolus vulgaris)cont-
gxning four introns． Physiol Plant，1994，92:613-623．
［10］ Jensen PE，Hoff T，Stummann BM，et al． Functional analysis of two
bean nitrate reductase promoters in transgenic tobacco． Physiol
Plant，1996，96:357-358．
［11］Miyazaki J，Juricek M，Angelis K，et al． Characterization and se-
quence of a novel nitrate reductase from barley． Mol Gen Genet，
1991，228(3) :329-334．
［12］Schnorr KM，Juricek M，Huang C，et al． Analisis of barley nitrate
reductase cDNA and genomic coones． Mol Gen Genet，1991，227:
411-416．
［13］Fukuoka H，Ogawa T，Minami H，et al． Developmental stage-specif-
ic and nitrate independent regulation of nitrate reductase gene ex-
pression in rapeseed． Plant Physiol，1996，111(1) :39-47．
［14］Sun FF，Hou XL，Li Y，et al． Molecular cloning and characteriza-
tion of nitrate reductase gene from non-heading Chinese cabbage．
Scientia Horticulturae，2008，119(1) :1-10．
［15］Li J，Xue LX，Yan HX，et al． The nitrate reductase gene-switch:A
system for regulated expression in transformed cells of Dunaliella
salina． Gene，2007，403(15 ) :132-142．
［16］Hettmann T，Siddiqui RA，Frey C． et al． study on amino acids a-
round the molybdenum centre of the periplasmic nitrate reductase
from Ralstonia eutropha． Biochemical and Biophysical Research
Communications，2004，320(4) :1211-1219．
［17］Prosser IM，Lazarus CM． Nucleotide sequence of a spinach nitrate
reductase cDNA． Plant Mol Biol，1990，15(1) ，187-190．
［18］王利群，王勇，董英，等． 硝酸盐对硝酸还原酶活性的诱导及硝
酸还原酶基因的克隆．生物工程学报，2003，19(5) :632-635．
(责任编辑 李楠)
69