全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第1期
收稿日期:2007-08-13
作者简介:李倩(1980-),硕士研究生,讲师;E-mail:liqian20012001@163.com
干扰素(interferon,IFN)的抗病毒作用是通过
其诱导许多干扰素刺激基因的转录上调而实现的,
双链 RNA激活的蛋白激酶 [doublestranded(ds)
RNAactivatedproteinkinase,PKR]是 IFN诱导的主
要抗病毒蛋白之一,它作为干扰素系统中重要的效
应子而受到广泛的研究。而且,PKR的活性也涉及
调节细胞增殖、凋亡、信号转导和细胞分化等。后
来的研究证实,除 dsRNA外,PKR还可以被其他的
激活剂而激活。目前 3种已知的 PKR的激活剂是
dsRNA、肝磷脂和 PACT(PKR-activatingprotein)。其
中,当细胞被病毒感染时,病毒 dsRNA作为激活
剂活化 PKR;肝磷脂在体外可活化 PKR;PACT是
胁迫细胞内 PKR的一种新发现的激活剂。当细胞
受到胁迫时,PACT以直接地蛋白质-蛋白质相互
作用的方式激活 PKR。此外,PACT本身与其他基
因表达的调节,与 RNA沉默和哺乳动物耳的发育
等均有关系。近年来,关于 PACT的研究受到越来
越多的关注,就近年来对 PACT的研究进展作一
综述。
1 PACT与 PKR的活化
IFN诱导的 PKR是 IFN的抗病毒活性的关键
调节者。在被病毒感染的细胞中,dsRNA已显示出
结合并活化 PKR的功能。在没有被病毒感染但受到
胁迫的细胞中,PACT作为 PKR新的蛋白激活剂[1]。
与 PKR一样,PACT在多数类型的细胞内微量表
达,而在哺乳动物细胞内 PACT被迫的过表达会引
起 PKR的活化。例如 PACT在鼠结肠上皮细胞系中
短暂的高表达会活化 PKR而导致诱导细胞凋亡[2]。
在酵母中,PACT与 PKR的共表达增强了 PKR的抗
生长作用[1]。PACT具有直接激活 PKR的特点,而且
PACT对 PKR的活化是依赖胁迫条件的。PatelCV
等[3]证实,在不同的胁迫条件下,例如血清饥饿、过
氧化物或亚砷酸盐处理的细胞中,PACT被磷酸化,
以高的亲和力与 PKR结合成为异二聚体 (即异二
聚化),通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用的方式
激活 PKR,引起 PKR在细胞内的作用底物真核细
胞起始因子 2的 α亚基(eIF2α)磷酸化的增强,从
而抑制蛋白质的合成和导致细胞凋亡。PetersGA
PACT的研究进展
李倩 1 张桂彬 2 廖尚英 3
(1烟台大学化学生物理工学院,烟台 264005;2高密二中生物教研室,潍坊 261505;
3中国科学院动物研究所生殖发育中心,北京 100080)
摘 要: 在受到胁迫的细胞中,PACT是PKR的蛋白激活剂。主要论述了PACT与PKR活化的研究进展,并且介
绍了PACT与基因表达,PNA沉默和哺乳动物耳的发育等功能。
关键词: PACT PKR 活化机制 其他功能
AdvanceontheStudyofPACT
LiQian1 ZhangGuibin2 LiaoShangying3
(1ChemistryandBiologyColegeYantaiUniversity,Yantai264005;2DepartmentofBiology,GaomiNo.2MiddleSchool,Weifang
261505;3ReproductiveBiologyCenterInstituteofZoologyChineseAcademyofSciences,Beijing100080)
Abstract: PACTcanactivatePKRinresponsetocelularstreses.Thereviewexpatiatedtheadvanceinthestudy
onPKR activatedbyPACT.IthasalsointroducedotherfunctionsofPACT,suchasPACT actingasregulatorfor
othergeneexpresing,theroleofPACTintheRNAsilencingpathwayandinmammalianeardevelopment.
Keywords: PACT PKR Activationmechanism Otherfunctions
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等[4]报道了单纯疱疹病毒类型 I的 Us11蛋白在细
胞外和细胞内均能阻碍 PACT对 PKR的活化,揭
示了 Us11与 PKR的结合是抑制作用的关键。这种
抑制作用是通过 Us11部分 C末端与 PKR的 N末
端结构域的相互作用介导的。Us11与 PKR的结合
不能阻碍 PKR与 PACT的结合,但是阻碍了 PKR
的活化。Us11是能抑制 PACT对 PKR作用的首例
病毒蛋白。人类 TAR(transactivatingregion)结合蛋
白(TRBP)与 PACT非常相似,也能与 PKR相互作
用,但是导致抑制了 PKR的活性。而且 TRBP与
PACT以相同的残基与 PKR相互作用,这两种相互
作用没有差异。PACT与 TRBP的结构域交换实验
表明,TRBP对 PKR活性的抑制作用是通过它的 C
末端残基 (包括 TRBP的第三个 dsRNA结合元件)
介导的[5]。
1.1 PACT的结构
PACT活化 PKR的功能是与它的结构密切相
关的。PACT与 PKR均属于 dsRNA结合蛋白,但
PACT在细胞内的含量不受 IFN或 dsRNA的调节。
dsRNA结合蛋白从埃希氏菌属大肠杆菌到人类已
经发现有 100多个成员。这些蛋白质大多均包含不
止一个结合 dsRNA的无序列特异性的保守区域。
PACT具有三个明显的功能结构域:N末端两个串
联保守的 dsRNA结合结构域(dsRBD1和 dsRBD2)
以及 C末端的第三个功能结构域(D3)。dsRBD1和
dsRBD2不仅对 dsRNA有很高的亲和力,并且也是
二聚化作用(包括 PACT的同二聚化和与 PKR结合
时发生的异二聚化)所需要的;而 D3对与 dsRNA
的结合以及与 PKR的相互作用是可有可无的。
HuangX等[6]通过实验确定了 PACT的 D3是活化
PKR所需的功能结构域。删除 D3尽管不会影响
PACT与 PKR的正常的相互作用,但会失去活化
PKR的能力,经纯化的重组 D3在体外也能有效的
活化 PKR。因此 PACTD3是 PACT活化 PKR所必
须的结构域。尽管 D3在体外可单独活化 PKR,但
是在体内还需要 dsRBD1和 dsRBD2,dsRBD1和
dsRBD2与 PKR强有力的相互作用而有利于 D3对
PKR的活化作用。在没有胁迫的条件下,dsRBD1和
dsRBD2可以抑制 D3对 PKR的活化作用。在被胁
迫细胞中,PACT本身被磷酸化后再去活化 PKR。
PetersGA等[7]发现了 PACT的 D3结构域发生磷酸
化的特异丝氨酸残基。Ser246和 Ser287两个丝氨
酸残基的磷酸化对 PACT在的细胞内的作用是必
须的。表明在 PACTD3结构域的特异丝氨酸残基
的磷酸化是传送细胞内胁迫给 PKR的重要方式。
而 PKR由 以 下 明 显 的 结 构 域 组 成 :N末 端 的
dsRNA结合结构域(dsRBD,包含dsRBM1和dsRBM2
两个串联保守的 dsRNA结合基序)和 C末端的激
酶结构域(KD)。PKR的 dsRBM1和 dsRBM2不仅具
有 dsRNA的结合活性,而且介导蛋白质之间的相
互作用,涉及 PKR的二聚化作用,因此 PKRN末端
的 dsRBD也称为二聚化结构域(DD)。
1.2 PACT的表达
由于细胞在受到胁迫的条件下,PACT能够活
化 PKR而发挥作用,因此 PACT表达的调节已经成
为研究的热点。GilbertSJ等[8]利用细胞因子处理牛
原软骨细胞与软骨外植体来研究 PACT与 PKR在
关节软骨细胞降解中的作用,发现肿瘤坏死因子 α
在处理 3h后能增加 PACT的表达,继而增加 PKR
的磷酸化。从而揭示了在关节炎疾病的发病机理中
软骨细胞降解的新机制。Fasciano等[9]定性了在PACT
启动子区域的 PACT表达所必须的序列元件。利用
启动子删除分析,在转录起始位点上游的 101个核
苷酸是 PACT表达所需的最小限度的启动子。对此
区域的进一步的突变分析、电泳淌度移位分析和染
色质免疫沉淀反应分析显示,特异性蛋白 1(SP1)
是调节 PACT启动子活性的主要转录因子。
1.3 PACT活化 PKR的机制
对于被病毒感染的细胞内 dsRNA活化 PKR的
机制已经研究清楚。其他的聚阴离子,例如肝磷脂,
在体外也可以活化 PKR,但是这些聚阴离子的生理
作用仍未知。PACT能通过 dsRNA非依赖机制活化
PKR。例如在细菌中纯化的 PACT能在无 dsRNA时
激活 PKR;缺乏 dsRNA结合能力的 PKR突变体仍
能被 PACT活化[1]。对于在胁迫条件下 PACT如何激
活 PKR的机制,最初,GregoryA等[10]提出了以下
PACT活化 PKR的模型(图 1、图 2、图 3)。
此模型指出,PKR的 N末端包含结构域 dsRBD
(因为此结构域与蛋白质二聚化作用有关,因此也
称为 DD),C末端包含激酶结构域(KD)。而 PACT
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具有三个功能结构域:dsRBD1和 dsRBD2和 D3。其
中 dsRBD1和 dsRBD2可相互 作 用 。dsRBD1和
dsRBD2都能单独与 PKR相互作用,这种强有力的
相互作用在体内是必须的。PACT的 D3与一尚未
确定的 PKR位点以弱的亲和力结合,从而改变
PKR的构像,暴露出 ATP结合位点(用手形表示),
从而导致 PKR的自磷酸化而被激活。此模型可说
明 PACT三个功能结构域的协调作用,即 dsRBD1
和 dsRBD2与 PKR强有力的相互作用有利于 D3对
PKR的活化作用。
后来,HuangX等[6]进一步验证了 PACT的 D3
是活化 PKR的功能结构域,并结合另一 PKR激活
剂 dsRNA,通过以下模型说明 PKR的活化机制。
此模型指出,PKR在没有其激活剂存在时,以
单体或二聚体的形式存在。PKR在 N末端具有两
个 dsRNA结合结构域 dsRBD(用白色椭圆表示);
其 C末端激酶结构域 KD(用黑色曲线表示)是折
叠的,没有暴露出 ATP结合位点。当 dsRNA以高亲
和力与 PKR的 dsRBD结合时,引起 PKR的构像发
生变化,暴露出 ATP结合位点(用黑色圆点表示),
从而导致 PKR的自磷酸化而被活化。当 PACT与
PKR结合后,也会引起 PKR的构像发生变化,暴露
出 ATP结合位点。其中 PACT的 D3是与 PKR的
KD结合的。但缺乏 D3的 PACT与 PKR作用时,虽
然也可以与 PKR相互结合,但是却不能引起 PKR
的构像发生变化,从而使 PKR处于抑制失活状态。
因此,此模型说明了 PACT的 D3是活化 PKR的功
能结构域。
经过进一步研究,ShoudongLi等[11]确定了 PKR
与 PACT的 D3的结合位点,并结合另一 PKR激活
剂 dsRNA,出了更精确的模型。
此模型指出,在无激活剂结合时,PKR的激酶
结构域(KD)中的 PMB(PKR的 328~335个残基)与
dsRBM2结合,这种分子内的抑制作用使 PKR保持
非 活 化 的 状 态 。 激 活 剂 dsRNA与 dsRBM1和
dsRBM2的结合或 PACTD3与 PBM的结合,都会中
断这种分子内的相互作用,从而引起相似的构像变
化,导致 PKR的活化。在此模型中,显示了 PKR结
构域 KD与 dsRBM2的分子内抑制作用,突出了
PACTD3的功能。
2 PACT的其他功能
近年来的研究发现,PACT不仅可以作为激活
剂激活 PKR,还可以不依赖于 PKR而发挥作用。
2.1 PACT与基因表达
病毒感染引发的宿主细胞的先天反应包括产
生类型 I的干扰素(IFN)。IwamuraT等[12]调查了
dsRNA结合蛋白对病毒诱导的 IFN-β基因活化的
作用。发现 PACT涉及被新城病毒诱导的 IFN-β基
因活化。其中 PACT的 dsRNA结合活性是关键的。
实验确定了 PACT的残基与假定的目标分子相互
作用而发挥功能。此外,还发现在感染细胞内,
PACT与病毒复制复合体共局域化。因此,PACT的
作用涉及病毒复制的调节,结果导致细胞内 IFN-β
基因的表达水平大增。
图 2 PKR的活化模型
图 3 PKR的活化模型
PKR结合 PACTD3的区域称为 PBM
图 1 PACT结合并活化 PKR的模型
李倩等:PACT的研究进展 63
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
2.2 PACT与 RNA沉默
小 RNA介导的基因沉默(RNA沉默)已在真核
细胞中作为一重要的调节途径。在此途径中涉及的
关键因子的确定一直是近年来重点研究的课题。在
人类,小 RNA是由外源导入细胞的双链 RNA被
RNaseⅢ核酸內切酶 Dicer切割产生的,然后通过
多种因子被装配成一效应复合物,称为 RNA诱导
的沉默复合体(RISC)。这些因子包括 Argonaute蛋
白家族成员 hAgo2和 TRBP,其中 TRBP是一种与
Dicer和 hAgo2均相互作用的 dsRNA结合蛋白。因
此,人类的 RISC至少包括三种蛋白质:Dicer,Ago2
和 TRBP[13]。后来,LeeY等[14]表明了另一种 dsRNA
结合蛋白 PACT作为 RISC新的组分而起作用,在
RNA沉默中意义重大。像 TRBP一样,PACT虽然是
前体小 RNA裂解步骤中所不需要的,但是 PACT
的删除强烈的影响了成熟小 RNA的积累,并在一
定程度上减少了小 RNA诱导的 RNA干涉效率。进
一步的研究证实,PACT可与 TRBP直接相互作用,
并且与 Dicer联合而刺激双链或短的具发夹结构的
RNA裂解成小干涉 RNA,从而在 RNA沉默中发挥
作用[15]。
2.3 PACT与耳的发育
为了确定哺乳动物 dsRNA结合蛋白 PACT的
生理功能,老鼠 Pact基因的单拷贝被破坏,表达的
蛋白质被完全溶解。结果发现老鼠显形尺寸减小并
有严重的小耳。作为外与中耳的先天性异常的结
果,这些老鼠听力减弱。原位杂交揭示,PACT的
mRNA在成年与胚胎野生型老鼠中耳的三部分的
特异区域表达。结果表明 PACT在哺乳动物耳的发
育中起重要作用,为研究人类小耳提供了第一个动
物模型[16]。
尽管 PACT研究领域已经取得一定的进展,但
仍然有许多疑问亟待解开:PACT要成为细胞内有
效的激活剂还需要第二信使,那么第二信使是什
么,具体是哪一种激酶去磷酸化 PACT的,PACT激
活 PKR时,PKR发生磷酸化的位点是什么,PACT
是否具有抗病毒功能,换句话说,在一种或其他病
毒感染时,是否 PACT能中介 PKR的活化,还有,既
然 PACT可以不依赖于 PKR而发挥作用,那么除了
以上介绍的功能外,PACT还有哪些重要的新的功
能,这些问题,都需要进一步研究和解答。
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