全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 1期
单纯疱疹病毒 2型感染细胞多肽 27
真核表达质粒的构建及表达
张发洲 1 杨慧兰 2
( 1华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510006; 2中国人民解放军广州军区广州总医院,广州 510010)
摘 要: 为了构建单纯疱疹病毒 2型 ( HSV2)感染细胞多肽 27( ICP27)真核表达质粒,应用 PCR技术从 H SV2 333株
的基因组中扩增 ICP27基因,并连接至真核表达载体 pEGFPC2, 对阳性克隆进行菌落 PCR、酶切和测序鉴定后,成功构建了重
组质粒 pEGFPC2ICP27。用 Xfec t转染试剂盒将重组质粒 pEGFPC2ICP27转染至 Vero细胞中, 并用 RTPCR及 W este rn blot
ting检测其表达情况。结果显示, ICP27基因在 Vero细胞中得到正确表达。真核表达质粒 pEGFPC2ICP27的构建成功, 为进
一步研究 ICP27对宿主细胞的影响奠定了基础。
关键词: 单纯疱疹病毒 2型 感染细胞多肽 27 真核表达载体 转染
Construction and Expression of Eukaryotic Expression Plasm id for
ICP27 ofHerpes Simplex V irus Type 2
Zhang F azhou
1
YangH uilan
2
(
1
School of Bioscience and B ioengineering, South China University of Techno logy, Guangzhou 510006;
2
Guangzhou GeneralH osp ital of GuangzhouM ilitary Command, Guangzhou 510010)
Abstrac:t To construct the euka ryotic expression p lasm id for in fectedce ll po lypeptide 27( ICP27) and detect its expression in Ve
ro ce lls, the sequence o f ICP27 w as c loned by PCR and then the PCR products w ere inse rted into pEGFPC2 to construct a recomb inant
p lasm id. The constructed recomb inant p lasm id was fina lly transfected into Vero ce lls w ith X fect fo r expression afte r the r ight sequence
w as confirm ed by restr ic tive endonuc lease ana lys is and DNA sequenc ing. The expression of ICP27 was de tected in the lysate o f trans
fected V ero cells by RTPCR and w estern blotting. The successfu l construction o f eukaryo tic expression p lasm id pEGFPC2ICP27 has
la id the foundation o f further study ing on the effect of ICP27 on host ce lls.
Key words: H erpes sim plex v irus type 2 ( HSV2) In fectedce ll po lypeptide 27 ( ICP27 ) Euka ryotic expression vec to r
T ransfec tion
收稿日期: 20100720
基金项目:全军医学科学技术研究 十一五 计划课题 ( 06 J008)
作者简介:张发洲,男,硕士研究生,研究方向:医学病毒分子生物学; Em ai:l zhangfzh@ gma i.l com
通讯作者:杨慧兰, Em ai:l hu ilany@ m edm ai.l com
单纯疱疹病毒 ( herpes simp lex v irus, HSV )属疱
疹病毒科 亚科, 是人类病毒性疾病的常见病原体
之一, 包括两个血清型: 1型 ( herpes simplex v irus
type 1, HSV1)和 2型 ( HSV2 )。HSV2主要感染
外生殖器和躯干下部皮肤, 通过生殖器黏膜以及破
损皮肤进入人体内而造成生殖器疱疹 ( gen ital her
pes, GH ) , 且 HSV2与 H IV ( human immunoddf icien
cy virus)具有协同感染的作用 [ 1]。
感染细胞多肽 27( in fectedcell polypeptide 27,
ICP27)是 HSV即早期 ( immed iate early, IE )基因或
基因编码的蛋白之一, 由 512个氨基酸组成,分子
量约为 63 kD。病毒的复制、早期 ( early, E )及晚期
( la te, L )基因的表达需要 ICP27, 且 ICP27对宿主细
胞基因的表达也具有调节作用 [ 2, 3]。HSV可在宿主
的神经节内终身潜伏,又可因多种非特异刺激而激
活, 导致相关的临床症状。HSV的这种潜伏 -再激
2011年第 1期 张发洲等:单纯疱疹病毒 2型感染细胞多肽 27真核表达质粒的构建及表达
活过程与宿主细胞的凋亡作用密切相关。Durm ano
va等 [ 4]研究发现, ICP27基因在 HSV1潜伏 - 再激
活过程中的高表达可导致细胞凋亡。目前, 国内外
都集中于对 HSV1 ICP27的研究, 而有关 HSV2
ICP27的功能及其对宿主细胞影响的研究尚无报
道。为此,本研究首次构建 HSV2 ICP27真核表达
质粒 pEGFPC2ICP27,并检测其在 V ero细胞中的表
达情况,为进一步研究 HSV2 ICP27对宿主细胞的
生物学作用奠定了基础。
1 材料与方法
11 材料
111 病毒株、菌株、细胞及质粒 HSV2 333株、
Ecoli Top 10、非洲绿猴肾细胞 (V ero)及质粒 pEGF
PC2均为本实验室保存。
112 主要试剂 Pfx DNA聚合酶、PureLinkH ipure
Plasm idM idiprep kit及 TR Izo l购自上海 Inv itrogen公
司;病毒基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收
试剂盒及逆转录试剂盒购自 TaK aRa(大连 ); 胎牛血
清, 新生牛血清及 RPM I1640培养基购自 H yclone公
司; E coR I、B amH I及 T4 DNA连接酶为 NEB公司
产品; 转染试剂盒 X fect购自 C lontech; R IPA细胞裂
解液购自上海申能博彩公司;鼠抗 ICP27单抗购自
Abcam, HRP标记抗鼠多克隆抗体购自 CST公司;
ECL发光液为 M illipore公司产品。
113 引物的设计与合成 ICP27基因上游引物
P1: 5CCGGAATTCGCGACCTACAACATGGCTAC
CG3(下划线为 E coR I酶切位点 ) , 下游引物 P2:
5CGCGGATCCGCGTCTGCCGTGAGTTCCTG3(下
划线为 BamH I酶切位点 )。内参 actin上游引物
P3: 5CGTACCACTGGCATCGTGAT3, 内参下游引
物 P4: 5GTGTTGGCTGACAGGTCTTT G3。引物由
上海 Inv itrogen公司合成。
12 方法
121 V ero细胞的培养 用含 10%胎牛血清的
RPM I1640培养基在 37 、5% CO2及饱和湿度条件
下对 Vero细胞进行常规培养, 2- 3 d以 13进行 1
次传代。
122 病毒的接种及基因组的提取 HSV2感染
V ero细胞参考高建等 [ 5]报道的方法,并于显微镜下
观察细胞病变。待 70% - 80%细胞发生病变时收集
细胞,反复冻融使细胞充分裂解,低速离心后取上清
液,用病毒基因组提取试剂盒提取 HSV2基因组。
123 PCR扩增 ICP27基因 以提取的病毒基因
组为模板, PCR扩增 ICP27基因。反应体系: 10
Pfx扩增缓冲液 25 L, dNTP (各 25 mmol /L )
05 L, 50 mmo l /L M gSO 4 05 L, 引物 P1、P2各
05 L, 病毒基因组 1 L, 10 PCR加强液缓冲液
5 L, P fx DNA聚合酶 03 L, 加双蒸水至 25 L。
扩增程序: 94 预变性 4m in; 94 变性 15 s, 68 退
火、延伸 2 m in 15 s,共 35个循环; 72 再延伸 5 m in
后冷却至 4 。并设立空白对照: 除不加病毒基因
组外,其余相同。1%琼脂糖电泳检测 PCR产物。
124 真核表达质粒 pEGFPC2ICP27的构建及鉴
定 EcoR I、BamH I双酶切质粒 pEGFPC2及 PCR产
物,酶切后的产物经胶回收, T4 DNA连接酶于 16 过
夜连接目的基因及载体。连接产物转化感受态的
E coli Top 10,经卡那抗性培养基筛选,菌落 PCR鉴
定阳性克隆, 提取质粒, E coR I、BamH I双酶切及测
序鉴定,将完全正确的质粒命名为 pEGFPC2ICP27。
125 pEGFPC2ICP27转染 Vero细胞 待 6孔板
中的细胞生长密度达到 70% - 80%时, 用 X fectTM转
染试剂盒分别将 pEGFPC2ICP27、pEGFPC2转染至
Vero细胞。具体方法参照 C lontech公司的 X fectTM
Transfection Reagents说明书。
126 RTPCR鉴定 ICP27基因在 Vero细胞中的
表达 转染 48 h后, 于荧光显微镜下观察 V ero细
胞中绿色荧光蛋白的表达情况, 并收获细胞提取总
RNA。逆转录试剂盒合成 cDNA, 以此为模板, PCR
扩增 ICP27基因及 act in。反应体系: 10 Pfx扩增
缓冲液 25 L, dNTP (各 25 mmol /L ) 05 L,
50mmol /L M gSO 4 05 L, 引物 P1、P2或 P3、P4各
05 L, 逆转录产物 cDNA 3 L, 10 PCR加强液缓
冲液 5 L, P fx DNA 聚合酶 03 L, 加双蒸水至
25 L。扩增 ICP27基因条件同 123, 共 25个循
环; 扩增 actin基因的条件: 94 预变性 4 m in;
94 变性 25 s, 55 退火 30 s, 72 延伸 30 s, 共 25
个循环; 72 再延伸 5m in后冷却至 4 。 PCR产物
经 1%琼脂糖电泳鉴定。
127 W estern b lotting检测 EGFPICP27融合蛋白
转染 48 h后,贴壁细胞经消化后离心, 弃上清, 用
209
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
预冷 PBS洗 3次。加 20 L R IPA细胞裂解液,充分
裂解细胞后于 4 , 12 000 g离心 30 m in。上清
SDSPAGE电泳后转印至 PVDF膜, 一抗为小鼠抗
ICP27单克隆抗体, 二抗为 HRP标记的抗小鼠多克
隆抗体, ECL化学发光显色, X光片显影。
2 结果
21 HSV2对 Vero细胞的细胞病变
HSV2感染 48 h后, V ero细胞呈泡状, 细胞核
周围形成网状结构,部分细胞已坏死,发生典型的细
胞病变 (图 1)。
A. Vero细胞; B. HSV2感染 Vero细胞 48 h后
图 1 HSV2对 Vero细胞的病变 ( 100 )
22 ICP27基因的扩增
以提取的病毒基因组为模板, P1、P2为引物扩
增 ICP27基因, PCR产物进行 1%琼脂糖电泳。以
200 bp DNA Ladderm arker为参照,所扩增条带约为
1 800 bp,与预期片段大小 ( 1 740 bp)一致, 而空白
对照未扩增出条带 (图 2)。
23 重组质粒 pEGFPC2ICP27双酶切及测序鉴定
E coR I、BamH I双酶切重组质粒, 酶切后的产
物进行 1%琼脂糖电泳鉴定。电泳结果 (图 3)显
示, 在约 2 000 bp及 5 000 bp处出现条带, 与预期相
符。测序结果经 B last比对分析后, 与 NCB I中的序
列相同。
M. DNA m ark er; 1.空白对照; 2. ICP27
基因 PCR扩增产物
图 2 ICP27基因 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
M. DNA marker; 1. EcoR I、BamH I双酶切质粒 pEGFPC2;
2. E coR I、B amH I双酶切重组质粒 pEGFPC2ICP27
图 3 重组质粒 pEGFPC2ICP27的双酶切鉴定
24 重组质粒 pEGFPC2ICP27转染 Vero细胞及表
达鉴定
重组质粒 pEGFPC2ICP27及质粒 pEGFPC2转
染 V ero细胞 48 h后, 于倒置荧光显微镜下观察。
转染两种质粒的细胞均有绿色荧光蛋白表达 (图
4)。RTPCR结果 (图 5)表明, 只有转染重组质粒
pEGFPC2ICP27的 V ero细胞所提取的 RNA才能扩
增出 ICP27基因,而 actin ( 452 bp)在转染了两种
210
2011年第 1期 张发洲等:单纯疱疹病毒 2型感染细胞多肽 27真核表达质粒的构建及表达
质粒的 Vero细胞所提取的 RNA中均可扩增出来。
W estern blotting结果 (图 6)显示, 在转染 pEGFPC2
ICP27的 Vero细胞中能检测到 EGFPICP27融合蛋
白, 而在转染空质粒的 V ero细胞中未检测到。
A. Vero细胞 /pEGFPC2; B. V ero细胞 /pEGFPC 2ICP27
图 4 pEGFPC2ICP27在 V ero细胞中表达 ( 100 )
M. DNA m arker; 1. Vero细胞 /pEGFPC2ICP27; 2. Vero细
胞 /pEGFPC2
图 5 RTPCR鉴定 ICP27基因在 V ero细胞中的表达
1. Vero细胞 /pEGFPC2ICP27; 2. V ero细胞 /pEGFPC 2
图 6 W estern blotting检测 EGFPICP27融合蛋白
3 讨论
细胞凋亡是细胞进化出的一种抗病毒机制,而
病毒也进化出调节宿主细胞凋亡的机制, 从而有利
于病毒自身的存活与增殖。目前至少已发现 18种
以上的病毒科可调节目标细胞凋亡, 且这类病毒的
数量还在不断增加,病毒对细胞凋亡的调节机制也
日渐清楚,一些与凋亡相关的病毒蛋白或基因已陆
续得到确定 [ 6 ]。HSV含有多个能调节宿主细胞凋
亡的基因,如 US3、U S5、U s6、ICP22和 LAT等 [ 7, 8]。
ICP27是 HSV IE基因编码的一种多功能的磷
酸化蛋白,在病毒的复制、病毒早期及晚期基因的表
达 [ 9, 10]、RNA稳定性以及潜伏病毒的再激活过程中
起着重要的作用, 且 ICP27是 HSV IE基因编码的蛋
白中唯一一个与人疱疹病毒及所有疱疹病毒科中具
有同系物的蛋白 [ 2]。在研究 HSV1潜伏 -再激活过
程中发现,期间 ICP27的高表达可使宿主细胞发生典
型的凋亡特征,如胞膜起泡、染色质凝聚及 DNA断裂
形成阶梯状等 [ 11] ,且这种凋亡可能是由于 ICP27激
活 p38及 JNK细胞信号通路而使 Bc l2失稳定化而
导致的 [ 12, 13]。K im等 [ 14]研究表明, ICP27可破坏细
胞的抗氧化系统而增加细胞内活性氧 ( reactive oxy
gen species, ROS)水平从而使细胞发生凋亡, 但
ICP27对细胞的凋亡作用可能与 HSV感染的细胞
类型有关, A ubert等 [ 15 ]试验表明, HSV1感染人细
胞后, ICP27的表达可阻止细胞发生凋亡。目前, 有
关 ICP27与凋亡相关的文献均局限于对 HSV1
ICP27的研究, 而 HSV2 ICP27参与细胞凋亡的文
献尚未见报道。HSV2是引起生殖器疱疹的主要
病原菌,但有关 HSV2 ICP27基因在病毒的潜伏与
复发的中的作用机制尚不明了。
本研究首次成功构建了 HSV2 ICP27真核表达
质粒 pEGFPC2ICP27, 并转染至 Vero细胞, 通过荧
211
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
光显微镜、RTPCR及W estern b lotting检测其表达,
为进一步研究 HSV2 ICP27参与细胞凋亡的机制、
探讨其参与细胞发生凋亡的途径、解释 ICP27在病
毒潜伏与再激活过程中的作用奠定了基础, 也可为
临床防治生殖器疱疹提供试验依据。
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红 )
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