全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-05-09
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30470173）
作者简介：孙建（1981-），男，山东省诸城市人，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学
通讯作者：张春义，E-mail：chunyi.zhang@caas.net.cn，Tel：86-10-62135337
磷脂是构成细胞脂双分子层的主要成分， 降解磷脂的酶称为磷脂酶。 根据裂解酯键的位置的不同，
磷脂酶可为磷脂酶 A1﹑磷脂酶 A2﹑磷脂酶 C 和磷脂酶 D。 其中，磷脂酶 C 特异水解甘油磷脂分子中的第 3
位磷酸酯键， 而磷脂酶 D 催化磷脂分子中磷酸与取代基团间的酯键， 释放出取代基团。 植物磷脂酶 C
（PLC）可分为 3 类：水解磷脂酰肌醇的 PI-PLC、主要水解磷脂酰胆碱和其他磷脂的 PC-PLC 以及水解糖基
化磷脂酰肌醇锚蛋白的 GPI-PLC[1] 。
与其它 2 种 PLC 相比，PI-PLC 研究较多。动物中的 PI-PLC 主要分为 3 类，即 PLCβ﹑PLCγ 和 PLCδ [2]。植
物中 PI-PLC 的结构域﹑分子量大小和序列相似性与哺乳动物中的 PLCδ 最为相似。 植物 PI-PLC 都含有磷
酸酯酶活性所必需的结构域 X（约 170 个氨基酸）和结构域 Y（约 260 个氨基酸），但缺少 pleckstrin 同源结
构域，Ca2+为其活性所必需 [3]。 PI-PLC 在大多数植物组织中表达，但不同的 PI-PLC 在不同组织中的表达水
拟南芥非特异性磷脂酶 C4基因表达模式的研究
孙建 1，3 裴慧娟 2，3 路小铎 2，3 王晓云 1 张春义 3，4
（1山东农业大学生命科学学院，泰安 271018；2兰州大学生命科学学院，兰州 730000；3中国农业科学院生物技术研究所，
北京 100081；4国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程楼，北京 100081）
摘 要： 拟南芥非特异性磷脂酶C4（AtNPC4）具有降解磷脂酰胆碱（PC），产生二酰甘油（DAG）和磷酸胆碱的活
性。本研究从拟南芥基因组中分离了 NPC4基因起始密码子上游1 379bp的启动子序列，与GUS报告基因融合后转化拟
南芥，获得转基因植株。GUS组织化学染色表明，AtNPC4基因主要在处于衰老过程中的叶片中高水平表达，在根、茎、种
荚和花中也有一定程度的表达，这种表达模式与RT-PCR结果相一致。另外，通过RT-PCR发现，AtNPC4基因在转录水
平上受脱落酸的诱导，但不受水杨酸和茉莉素诱导。
关键词： 拟南芥 磷脂酶 C启动子 表达
Expression Pattern of Arabidopsis Nonspecific
Phospholipase C4 Gene
Sun Jian1，3 Pei Huijuan2，3 L Xiaoduo2，3 Wang Xiaoyun1 Zha g Chunyi3，4
（1College of Life Science，Shandong Agricultural University，Taian 271018；2College of Life Science，Lanzhou University，
Lanzhou 730000；3Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081；4National Key
Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Beijing 100081）
Abstract： Non-specific phospholipase C（NPC） has the activity that hydrolyzes phosphatidylcholine （PC） and
consequently yields diacylglycerol（DAG）and phosphorylcholine. In this study，1 379 bp upstream region ofAtNPC4 gene
fromArabidopsis genome was isolated，and fused with GUS reporter gene. The resulting expression cassette was
introduced into wild typeArabidopsis thaliana byAgrobacterium-mediated transformation. The result showed thatAtNPC4
gene was expressed predominantly in aging leaves，with low level of expression in roots，stems，siliques，and flowers，in
accordance with RT-PCR results，whereAtNPC4 gene as specific primers were used. It was also found that AtNPC4
expression was induced largely by abscisic acid.
Key words： Arabidopsis thaliana Phospholipase C promoter Expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
平是不同的，对环境胁迫的反应也不同 [3]。 例如，干旱条件下马铃薯叶片中 PLC1 的转录本水平下降，PLC2
转录本水平增加，而 PLC3 转录本水平保持不变 [1]。 在经干旱和低温处理后的拟南芥中，PLC1 的 mRNA 增
加，而 PLC2 基因的表达不变 [4]。 植物 PLDα、PLDβ 和 PLDγ 已经在拟南芥中得到克隆 [5]。 由于 PLDα 在植物
组织中表达量高且分布广泛，生化和基因功能研究主要集中在 PLDα 上。 在拟南芥叶片中，PLDα 比 PLDβ
和 PLDγ 表达更丰富 [6]，PLDα 的启动子在新陈代谢旺盛的组织（如分生组织）中比在成熟组织和衰老组织
中的活性更高，主要在植物生长和发育过程中表达 [7]。 Northern 杂交分析也表明，在叶片和种子发育早期，
PLDα 的 mRNA 丰度高 [7，8]，其蛋白含量和活性也表现出相同趋势 [9]。 当用 ABA 处理拟南芥离体叶片时，可
以诱导 PLDα 基因的表达，PLDα 的 mRNA﹑蛋白质及其活性都明显增加 [10]；ABA 也可以诱导蓖麻离体叶片
中 PLDα 基因的表达 [11]。
模式植物拟南芥基因组中已发现 6 种非特异性磷脂酶 C 组成的一个基因家族， 称为 NPC（nonspecific
phospholipase C）家族，其编码蛋白由 514～538 个氨基酸残基组成，分子量为 60kD 左右。 其中，NPC1 和 NPC2
分别定位于 1 号和 2 号染色体上，NPC3、NPC4 和 NPC5 位于 3 号染色体上， 并且以串联形式排列。 这 6
个 NPC 氨基酸水平的同源性在 52.8％~84.7％之间 [12]。 其中，NPC1﹑NPC2 和 NPC6 在其肽链的 N 端含有可
能的信号肽序列，指导蛋白进入分泌途径。 目前，已经确定拟南芥非特异性磷脂酶 C 的基因家族与细菌磷
脂酶 C 存在序列相似性，但其基因功能还有待进一步研究 [1]。 关于拟南芥非特异性磷脂酶 C 基因家族的研
究目前只有一篇报道，发现非特异性的磷脂酶 C4（AtNPC4）在磷饥饿的条件下被诱导表达，分解磷脂酰胆
碱产生二酰甘油（DAG）和磷酸胆碱，磷酸胆碱为植物生长提供磷源，二酰甘油为糖脂的合成提供碳骨架，
修复由于磷脂被分解而破坏的细胞膜 [12]。 为更深入了解 AtNPC4 基因在植物生长发育中的生物学功能，用
RT-PCR 和组织化学染色相结合的方法对该基因的时空表达模式进行了详细研究。
1 材料和方法
1.1 材料
拟南芥（Arabidopsis thaliana ecotype Columbia-0）种子﹑大肠杆菌 TOP10﹑DH5α﹑农杆菌菌株 LBA4404 和
植物表达载体均由中国农科院生物技术研究所植物代谢工程实验室提供。 克隆载体 T-easy 购自北京天为
时代公司。 各种限制性内切酶购自 New England Biolab 公司和 Takara 公司。 Taq DNA 聚合酶购自东盛生物
技术公司，高保真聚合酶和 DNaseⅠ购自 Takara 公司。 DNA 序列测定及引物合成由北京奥科生物公司、上
海博亚生物技术有限公司和上海生工生物技术有限公司完成。
1.2 实验方法
1.2.1 拟南芥 DNA 和 RNA 的提取 具体实验方法见参考文献 [10]。
1.2.2 植物表达载体构建 将 NPC4 promoter 用 EcoRⅠ酶切，回收目的片段，连接到 pENTR1A 载体上，获
得 pENTR1A-NPC4 promoter 重组质粒。 将鉴定正确的 pENTR1A-NPC4 promoter 质粒重组到植物表达载体
pKGWFS7，转化入 E.coli 菌株 DH5α。 在含有壮观霉素（Spec，25mg·L-1）的 LB 培养基平板上筛选转化菌落，
获得植物表达载体 pKG-NPC4 promoter。
1.2.3 植株 PCR 检测 提取转基因植株基因组 DNA 进行 PCR 检测，引物序列 FW：5-CTTGCATGCCGGTC
GATCTA-3；RV：5-TGGGGTTCGGACTCTAGCTA-3。其中 FW，RV 是 pKGWFS7 载体引物。 PCR 条件：94℃预
变性 5min；94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 30s，35 个循环；72℃延伸 10min；电泳检测。
1.2.4 GUS 染色 取不同生长时期的阳性拟南芥植株（20℃，16h 光照），进行 GUS 染色（1M 磷酸缓冲液、
100mM 高铁氰化钾 、100mM 亚铁氰化钾 、50mg·ml-1 X-Gluc，37℃过夜 ），70%乙醇脱色后 ， 在体视镜下
（Nikon DigitaL Camera DXM1200F）观察。
1.2.5 RT-PCR 检测 取生长于 1/2 MS 培养基上的萌发后 1d、2d、4d、7d 的拟南芥幼苗和盆种 6 周成熟
根、成熟茎、成熟叶片、花、种荚、幼嫩的叶片、幼嫩根、茎生叶，用 RT-PCR 方法（首先采用 Trizol 法提取总
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RNA，然后用 1μg RNA 进行反转录，用内标基因 ACTIN 标定模板量 ）检测其表达模式。 用 1mM SA﹑1mM
MeJ，100μM ABA 喷洒刚刚展开的叶片，分别取 0、3、6、12 和 24h 的叶片进行 RT-PCR，观察其诱导表达情况。
2 结果
2.1 AtNPC4 在拟南芥不同生长阶段和组织器官中的表达模式
为了检测 NPC4 基因在萌发早期不同发育阶段的表达模式， 取生长于 1/2 MS 培养基上的萌发后 1d、
2d、4d 和 7d 的拟南芥幼苗提取 RNA，反转录出 cDNA，用 NPC4 基因特异引物半定量分析基因的发育早期
表达模式。 结果表明，在萌发初期没有检测到 NPC4 基因的表达（结果没有显示）。 分别取 6 周龄拟南芥的
根、茎、叶、茎上的叶、花和种荚，10d 龄拟南芥的根和叶提取 RNA，反转录成 cDNA，用基因特异引物鉴定
NPC4 基因在不同组织器官中的表达，发现 NPC4 基因在成熟叶中表达量比较高，在其它组织器官中表达
相对较低，幼嫩的组织中没有表达（图 1）。 该结果表明，NPC4 基因主要在处于分化成熟的组织器官中表
达，而在生长发育时期的器官中表达很微弱。
2.2 载体构建及转基因植物的 PCR 鉴定
为了深入研究 AtNPC4 基因在不同组织器官中的表达模式， 利用 PCR 方法克隆了该基因启始密码子
ATG 上游的 1 379 bp 启动子区，并用 Gateway 系统构建了启动子融合 GUS 报告基因的载体 PKG（图 2）。 用
农杆菌介导的花沾法转化野生型拟南芥，将收获的种子种于含有 50 mg·L-1 卡那霉素的 1/2 MS 培养基上，
筛选阳性苗（绿苗），移栽至土中，3 周后随机取 10 株转化植物的叶片和一株未转化的野生型的叶片，提取
基因组 DNA，用 GUS 特异引物（引物序列见“材料和方法”）进行 PCR 检测，以鉴定转化植物是否为阳性。
转化植株（图 3 中 1~10）均得到与阳性对照（图 3 中 13）一致的 PCR 扩增条带，说明所取植株都为阳性转
基因植物。

图 1 AtNPC4 基因在不同组织器官中的表达模式 图 2 AtNPC4 启动子融合 GUS 报告基因的载体
R:根； S:茎； L:叶； F:花； Si:种荚； YL:幼嫩的叶片； SL:茎生叶
2.3 转基因植株的 GUS 组织化学染色分析
取 10d 的转基因拟南芥幼苗和成熟植株的不同组织器官进行 GUS 染色。结果表明，转基因幼苗没有可
见的 GUS 染色反应（图 4D），说明 NPC4 基因在拟南芥发育早期不表达或者表达水平很低；在花、花序、种
荚和叶片中有明显的染色反应（图 4 中 A、B、C，图 5 中 e、f），这与 RT-PCR 结果一致。
图 3 转基因植物的 PCR 鉴定
1~10:转基因植株 ； 11:100bp Marler；
12:阴性对照；13:阳性对照
图 4 AtNPC4 基因在不同组织器官的表达
A:花； B:花序； C:种荚； D:种子
孙建等：拟南芥非特异性磷脂酶 C4基因表达模式的研究
为详细了解在不同发育阶段拟南芥 NPC4 基因的表达模式， 取 GUS 转基因植株上不同衰老程度的叶
片分别进行 GUS 组织化学染色。结果表明，幼嫩叶片没有染色反应（图 5A-a，d），大部分发黄的叶片有明显
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的染色反应（图 5A-c，f），而正在开始衰老的叶片染色最深 （图
5A-b，e）。为进一步确定拟南芥内源 NPC4 基因是否也具有相似
的表达模式，又用该基因的特异性引物对上述处于不同发育阶
段的叶片进行了半定量 RT-PCR 分析 。 结果显示 ，NPC4 在幼
嫩的叶片中并没有表达， 在已经衰老的叶片中有微弱的表达，
而在正在衰老的叶片中有大量表达（图 5B）。 这与组织化学染
色结果相一致。
2.4 AtNPC4 基因的表达受脱落酸的诱导
水杨酸（SA）、茉莉酸（MeJ）和脱落酸 （ABA）等激素可以诱
导植物细胞衰老。 分别用 1mM SA、1mM MeJ 和 100μM ABA 处
理刚刚展开的叶片后进行半定量 RT-PCR 分析，以检测 AtNPC4
基因的表达是否受到上述这些激素的调节 。 在经不同时间的
SA 和 MeJ 处理后，没有检测到 NPC4 基因的表达；而 ABA 处理
后 3h 开始检测到 AtNPC4 基因的转录本，处理 12h 后转录本达
到最高丰度，处理 24h 后转录本水平明显下降（图 6）。说明
AtNPC4 基因表达在转录水平上受 ABA 诱导。
3 讨论
2005 年，一个日本研究小组从拟南芥中克隆到了非特
异性磷脂酶 C4（NPC4）基因 ，该基因编码的蛋白能够非特异性地降解磷脂酰胆碱 （PC），产生二酰甘油
（DAG）和磷酸胆碱；同时发现该基因的表达受磷饥饿的诱导，但没有对该基因的表达模式进行深入研究 [12]。
用 RT-PCR 和组织化学染色相结合的方法对该基因的表达模式进行了较为详细的研究表明，AtNPC4 基因
在发育早期基本不表达，在成熟植株的根﹑茎﹑花和种荚中有较弱表达，而在开始衰老的叶片中表达最强。
另外还发现，ABA 能够诱导 AtNPC4 基因的表达，但 SA 和 MeJ 不能诱导 NPC4 基因的表达。
在针对拟南芥 NPC 家族基因进行研究过程中发现，只有 NPC4 和 NPC6 在转录水平上的表达受脱落酸
的诱导（结果未发表），说明不同的 NPC 基因可能参与到不同的生物学过程。 与此相类似，在干旱低温等处
理条件下，马铃薯和拟南芥叶片中的不同 PLC 基因呈现出不同的表达模式 [4]。 NPC4 能分解多种磷脂，其中
主要是分解 PC。 因为 NPC4 蛋白主要分布在质膜上， 在植物磷饥饿时降解质膜上的磷脂产生二酰甘油
（DAG）和磷酸胆碱，为植物提供所需的磷元素。 一种毒性细菌中的 NPC4 能够破坏寄主细胞的质膜从而能
够产生侵染 [12]。 因此 NPC4 的生物学功能主要是降解膜脂。
研究中还发现，植物光合作用旺盛的组织中 NPC4 基因的表达水平很低，而在花中及衰老的叶片中有
较高水平的表达。考虑到 NPC4 的主要生物学功能是降解膜脂，植物进行光合作用的组织中，如果 NPC4 的
表达高就会使其细胞受到损害。 而衰老叶片或者花中磷脂转换进行的非常迅速，因此需要 NPC4 基因的高
表达。 NPC4 基因在衰老的叶片中高表达可能与衰老过程的磷脂降解有关。
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图 5 AtNPC4 在不同发育阶段叶片中表达
A:GUS 染色 ； B:RT-PCR 分析 a:嫩叶 ； b:发黄叶
片； c:开始衰老的叶片 ； d:染色后的嫩叶 ；e:染色
后发黄叶片； f:染色后开始衰老的叶片
图 6 SA, MeJ, ABA 处理后 AtNPC4 基因的表达
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