全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
猪戊型肝炎病毒 swCHGS189株 ORF2
基因的克隆及序列分析
郝宝成1, 2 兰喜 2 柳纪省 2 胡永浩 1
( 1 甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070; 2 中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室
农业部畜禽病毒学重点开放实验室 农业部草食动物疫病重点开放实验室,兰州 730046)
摘 要: 为进行猪戊型肝炎病毒 ( HEV )ORF2 基因特征研究,参照 GenBank中已发表的戊型肝炎病毒 ( HEV )核酸序列,
设计了一对扩增 HEV ORF2 基因的引物,利用 RTPCR等方法克隆出了一株猪戊型肝炎病毒甘肃分离株 GS189的 ORF2基因
cDNA片段。序列测定结果表明, swCHGS189株的 ORF2 基因长 2 025 bp, 编码 674个氨基酸, 与 GenBank中公布的其它毒株
间的核苷酸序列同源性为 791% ~ 91 8% ,推导的氨基酸序列同源性为 895% ~ 98 8%。系统发育进化树结果表明, 该分离
株为基因 IV型。
关键词: 戊型肝炎病毒 ORF2基因 克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis ofORF2 Gene ofHepatitis
E V irus swCHGL189 Strain
H ao Baocheng
1, 2 Lan X i2 L iu J ix ing2 Hu Yonghao1
(
1
AnimalM edicine College, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070;
2
State K ey Laboratory Etiological Biology, K ey Laboratory
of A nimal V irology of M inistry of Agriculture, K ey Laboratory of Grazing AnimalD iseases of M inistry of Agriculture,
Lanzhou Veterinary R esearch Institute, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Lanzhou 730046)
Abstrac:t In order to study the cha racte ristics o fORF2 gene o f hepatitis E v irus( H EV ), a pa ir of pr im ers fo rORF2 gene w as
designed accord ing to the published cDNA sequence o f hepatitis E v irus in Genbank The com plete cDNA fragm en ts ofORF2 genew as
amp lified w ith the prim ers by reverse transcr iption po lym erase cha in reaction ( RTPCR ) and o ther assay s The resu lts showed the
ORF2 gene fragm ent o f swCHGS189 consists o f 2 025 bp and coded 674 am ino ac idsWh ich com pared w ith the publishedORF2 gene
o f hepatitis E v irus ( HEV ) in GenBank, the homo logy o f nuc leotide sequences was 79 1% ~ 918% , and the homo logy o f am ino acid
sequences was 895% ~ 988% The phy logenetic analysis showed swCHGL189 stra in be longs to genotype IV HEV
Key words: H epatitis E virus ORF2 gene C lon ing Sequence analysis
收稿日期: 20081020
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金 ( BRF070307 )
作者简介:郝宝成 ( 1983) ,男,甘肃古浪人,在读硕士,研究方向:动物传染病学
通讯作者:柳纪省, Em ai:l liu jixing@ hotm ail com
戊型肝炎 (HE )是由戊型肝炎病毒 ( Hepatitis E
v irus, HEV )引起的一种经消化道传播的急性接触性
人畜共患传染病, 人普遍易感。急性戊型肝炎病情
较重, 病死率为 25% , 明显高于甲型 ( 01% )和乙
型 ( 09% )肝炎, 孕期妇女死亡率可高达 15% ~
20%
[ 1~ 7]。有学者对感染猪群不同阶段猪的血清学
检测发现,可以感染所有生长阶段的猪,并在其间传
播,母源抗体一般在 2月龄时下降,此后不久开始血
清阳转。感染早期的猪的肝组织可以使接种猪感
染, 显示肝组织在传播中的作用。
HEV为单股正链 RNA病毒,基因组长度约为 72
kb, 3端有 poly A尾, 有 3个开放阅读框 ( ORF) [ 8]。
ORF1位于 5端 (约 5 kb)是非结构蛋白基因, 含依赖
RNA的 RNA多聚酶序列, ORF2位于 3端 (约 2 kb)是
结构蛋白的主要部分,可编码核衣壳蛋白, ORF3与
ORF1和 ORF2有重叠 (全长 369 bp),也是病毒结构蛋
2009年第 5期 郝宝成等 :猪戊型肝炎病毒 swCH GS189株 ORF2基因的克隆及序列分析
白基因,可编码病毒特异性免疫反应抗原。HEV主要
有 4个基因型 [ 0] ,其中、、的ORF3与ORF1和ORF2
部分重叠, ORF2 和 ORF1 不重叠, 而基因型 IV的
ORF2与 ORF1部分重叠, ORF3完全包含在 ORF2中。
大量的研究报道 HEV ORF2编码的衣壳蛋白含有多个
抗原表位,特别是其富含疏水区的 C端 2 /3部分存在
多个能诱导免疫保护力的免疫优势 B细胞抗原表位,
因而 ORF2编码蛋白也成为目前 HEV基因工程亚单位
疫苗研究的热点。
自 1997年,美国学者从猪体内分离出第一株动
物源性 HEV后,许多国家都从猪体内分离出了新的
毒株。本研究从一些疑似戊型肝炎发病猪场粪样中
分离获得了一株戊型肝炎病毒 swCHGS189株, 并
以 swCH GS189株为材料, 对 ORF2基因进行全长
cDNA克隆和序列比较分析, 为不同 HEV毒株衣壳
蛋白基因的分子特征研究,以及 HEV诊断和防制制
剂研究奠定分子基础。
1 材料与方法
11 病毒 HEV
GS189株由兰州兽医研究所传染病实验室分
离、鉴定和保存。
12 载体和宿主菌
PMD20T载体购自 TaKaRa公司, E coli DH5由
本实验室保存。
13 主要试剂
病毒 RNA小量制备试剂盒购自 Q IAGEN公司、
RT反应试剂盒、TaKaRaTaqTM、100 bp DNA M arker、
EcoT14、质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒
均购自 TaKaRa公司;限制性内切酶 BamH I、Sph I购
自 Promega公司。
14 引物设计与 PCR扩增
参照 GenBank收录的 HEV ORF2基因序列,设计
一对特异性引物, ORF2EA 5TCAATACTCCCGGG
TTTTAC3ORF2 IS 5GGGTGGAATGAATAACATG3引
物由 TaK aRa公司合成。
15 病毒 RNA的提取
取猪粪样悬液, 10 000 r/m in, 3 m in, 取上清液,
病毒 RNA小量制备试剂盒抽提病毒 RNA。上述步
骤均在 BPL3实验室进行。
16 cDNA的合成
在 02 m l EP管中依次加入 5 RT Buffer 4 ,l
RN ase Free ddH 2O 35 ,l dNTP M ixture (各 10
mmol /L) 1 ,l RN ase inh ib itor 1 ,l AMV Rverse Tran
scriptase 05 l( 5 U /l), RNA样品 10 ,l反应总体
积为 20 l。反转录条件: 42 60m in, 70 15m in。
17 PCR扩增
在 02 m l的 EP管中依次加入 2 GC Buffer
(M g
2+
free ) 25 ,l M gC l2 ( 25 mmol /L ) 10 ,l dNTP
M ixture ( 各 25mmo l/L ) 40 ,l 100 pmo l/l的上、
下游引物 ORF2EA、ORF2 IS各 10 ,l cDNA10 ,l
LA TaqDNA聚合酶 ( 5U /l) 05 ,l去离子水补足 50
,l按反应程序: 94 、2 m in; 94 、30 s, 50 、30 s,
72 、2m in 30 s,共 35个循环; 72 延伸 15m in, PCR
产物用 1%琼脂糖电泳观察。
18 cDNA克隆与鉴定
PCR产物按小量胶回收试剂盒回收, 与 pMD20T
载体连接, 含有 pMD20T 1 ,l L igation solut ion I 50
l、DNA样品 40 ,l轻轻混匀后, 16 连接过夜,连接
产物按常规方法转化 Ecoli DH5感受态细胞,涂布于
含 Amp、XGal及 IPTG的鉴别培养基。挑取蓝斑作阴
性对照提取质粒初选阳性菌落培养,用质粒 PCR以及
用 BamH+ Sph进行酶切鉴定,酶切体系: BamH10
l、Sph10 l、质粒 DNA 16 l、10 K Buffer 20l、总
体积 200 ,l 37 水浴酶切 5 h, 以 1%琼脂糖电泳分
析酶切结果。鉴定的重组质粒命名为 pMDORF2。
19 序列测定和比较分析
将阳性重组质粒送上海英骏生物技术有限公司
测序。用 DNAstar等软件分析 ORF2基因核苷酸序
列及推导的氨基酸序列,并与 GenBank上一些其它
HEV毒株 ORF2基因进行同源性比较和系统进化
分析。
2 结果
21 RTPCR扩增结果
用设计的引物对 swCHGS189株病毒粪样悬液
扩增出长度约为 2 030 bp的片段, 与预期大小一致
(图 1)。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
M 1DL2000m arker; 2ORF2基因 RTPCR产物; M2Ecot14酶切标准
图 1 ORF2基因扩增片段电泳图
1重组质粒 PMDORF2 PCR产物; MEcot14酶切标准
图 2 PMDORF2的质粒 PCR产物电泳图
22 重组质粒 pMDORF2的鉴定结果
重组质粒 pMDORF2用 PCR直接扩增可得到约
2 030 bp的片段 (图 2)。质粒 pMDORF2BamH+ Sph
双酶切得到约结果 2 030 bp片段,说明 ORF2基因成功
克隆入 pMD20T载体 (图 3)。
23 ORF2基因核苷酸序列测定及特征分析
ORF2基因重组质粒 pMDORF2经测序,结果显
示扩增的 ORF2片段核苷酸序列全长 2 032 bp(图
4) , ORF2扩增片段包含完整的 ORF2基因, ORF2基
因全长为 2 025 bp,推导其编码 674个氨基酸 (图 5),
分子量约为 7250 kD。
1BamH I+ Sph I双酶切产物; ME cot14酶切标准
图 3 PMDORF2酶切鉴定图
从获得的 ORF2基因序列中,统计得腺嘌呤 (A)的
含量为 1817%,乌嘌呤 ( G)的含量为 2385%,胸腺嘧
啶 ( T )的含量为 2810%, 胞嘧啶 ( C )的含量为
2988%, (G+ C)% = 5373%。
图 4 ORF2基因的核苷酸序列
24 ORF2基因同源性分析
序列比较结果显示, swCHGS189株 ORF2基因
与 TK15 /92株 ( AF051830, USA )、X injiang标准株
(NC001434, Ch ina)、hev037株 (X98292, Indian)、HeBei
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2009年第 5期 郝宝成等 :猪戊型肝炎病毒 swCH GS189株 ORF2基因的克隆及序列分析
图 5 ORF2基因的氨基酸序列
图 6 ORF2基因的核苷酸序列同源性比较
图 7 ORF2基因的氨基酸同源性比较
株 (M94177, Ch ina)、mexico strain株 (M74506, Mex ico )、
JKW Sap株 (AB074918, Japan)、wbJYG1株 (AB222184, Ja
pan)、swMN06A1288株 ( AB290312, Mongo lia )、JMNG
Oki02c株、(AB236320, Japan)、HEJA28株 (AB220976, Ja
pan )、ChS1 株 ( EF077630, Ch ina )、 swCH25 株
(AY594199, China)、INDSW0001株 (AY723745, Indian)
的核苷酸同源性分别为 798%、796%、800%、796%、
791%、817%、812%、806%、815%、879%、878%、
918%、877% (图 6)。氨基酸同源性依次为 911%、
914%、914%、914%、895%、935%、927%、932%、
932%、978%、982%、988%、978% (图 7)。
25 ORF2基因系统进化分析
根据 ORF2基因的核苷酸序列用 Treev iew软件绘
制系统发育进化树 (图 8)。结果显示 swCHGS189株
与 ChS1株、HEJA28株、INDSW 0001株、wbJYG1
株、JMNGOk i02c株、JKW Sap株、HEJA28株遗传距离
较近,并与国内株 SwCH25的遗传距离最近;而与 X in
jiang标准株、H eBei株、hev037株、TK15 /92株遗传距离
较远,与 mex ico strain株遗传距离最远。
图 8 ORF2基因的系统进化发育树
3 讨论
HEVORF2是病毒的衣壳蛋白, 是诱导机体产
生免疫反应的主要抗原, 也是公认的结构基因编码
区 [ 9~ 11]。ORF2的核苷酸序列最保守, 其中与 ORF3
重叠的部分又是 ORF2中最保守的部分, 但此区编
码的氨基酸序列变异性最大, 有研究推测此区的核
苷酸折叠形成较强的 RNA次级结构,从而抑制了核
苷酸序列的变异。
本研究将 swCHGL189株与已公布的不同基因
型 HEV进行了同源性比较。并选取了部分毒株序
列进行了遗传关系分析。根据不同基因型之间,
ORF2的核苷酸同源性小于 85%, 可以确定 GS189
分离株为基因 IV型。系统发育进化树分析显示,
swCHGL189分离株也为基因 IV型。有研究报道,
基因型的基因组中有一独特的单核苷酸插入, 导
致了 ORF2 和 ORF3 编码蛋白起始密码的移位, 使
得 ORF2编码蛋白比其它基因型长。此次从 swCH
GL189毒株中,得出 ORF2基因长 2 025 bp,编码蛋
白应为 674个, 与已公布的数据相同。
有研究报道, HEV基因第 I型与第 II之间的氨
基酸序列同源性达 922% ~ 928% , 第 III型与第
IV之间达 946% ,显示了在种系进化上 I、II两型间
及 III、IV两型间的氨基酸序列相近, 可能含有共同
的抗原表位 [ 12]。将代表HEV基因 III型的 JKW Sap
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
株 ( AB074918, Japan)、wbJYG1株 ( AB222184, Ja
pan )、swMN06A1288 株 ( AB290312, M ongo lia )、
JMNGOki02c株 ( AB236320, Japan)与分离的 swCH
GL189株序列比较, 氨基酸同源性为 927% ~
935%, 略低于已公布的 946%。
由以上数据可以看出 ORF2基因保守性比较高,
swCHGL189株与不同国家和地区毒株的核苷酸序列同
源性为 791% ~ 918%。氨基酸序列同源性为 895% ~
988%。其中与中国 swCH25株 (AY594199, China)同源
性最高,核苷酸同源性高达 918%,氨基酸同源性达
988%。与墨西哥株 (M74506, M exico)同源性最低,核苷
酸同源性为 791%, 氨基酸同源性为 895%。由于
swCHGL189ORF2 基因序列与已公布的 JakSai株、
JKKSap株、JY ICh isai01c株、HEJF4株、JKOChisa i98c
株、T1株、swCH25株 (AY594199, Ch ina)的 ORF2核苷酸
序列同源性很高,在 880% ~ 918%之间,系统进化树分
析显示,它们处于同一亚群,因此它们可能是来源于同一
祖先的病毒。
另外, swCHGL189株与人源性 HEV (如 X in jiang
标准株等 )的 ORF2核苷酸同源性最高为 879%, 氨
基酸同源性最高为 978%; 与猪源性 HEV (如 HeBei
株等 )的 ORF2核苷酸同源性最高为 918%,氨基酸
同源性最高为 988%。发现它与猪源性 HEV的同源
性更高一些。
根据各克隆株核苷酸、氨基酸的同源性大小及遗
传距离 (每一个核苷酸位置上发生的碱基置换率 )将
世界上已经发现的 HEV病毒株分了 7个主要基因
型 [ 13] ,各型之间总的核苷酸序列同源性为 74% ~
76%, ORF1、ORF2和 ORF3编码的氨基酸序列的同
源性分别为 82% ~ 84%、90% ~ 93%、79% ~ 87%。
不同基因型之间, ORF2的核苷酸同源性小于 85%,
遗传距离大于 0235。同一个基因型中, ORF2距离
在 0045~ 0150之间时, 又可分为不同的亚型。以
往研究表明我国 HE发病以型毒株为主要病原体,近
期的研究报告显示型 HEV是目前引起我国散发性
HE的主要病毒株 [ 14]。本实验室从甘肃地区 12个养
猪场采集猪粪样品 211份,对其中 RTPCR检测为阳
性的 29份样品进行序列分析显示, 均属基因型,提
示该地区猪群中流行的毒株主要为基因型。
研制新型戊型肝炎病毒疫苗是预防戊型肝炎的
根本措施,但是由于缺乏合适的培养体系, HEV的
体外大量培养仍没有取得重大突破, 制约了戊型肝
炎病毒疫苗的研制。国内学者已利用基因工程方
法, 对 HEV ORF2基因的部分片段进行了表达, 并
取得一定进展。动物实验证实, 表达产物具有较好
免疫原性。本研究从猪群中分离出了一株猪 HEV,
即 swCHGS189, 并克隆了其全长 ORF2 基因, 为
HEV诊断和防制制剂的研究奠定了分子基础。
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