全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第5期
收稿日期:2008-06-30
作者简介:魏刚才(1962-),男,副教授,主要从事动物病毒学研究
通讯作者:郑玉姝,E-mail:yszheng2003@163.com
霍乱毒素 Choleratoxin(CT)是由霍乱弧菌产生
的外毒素,是霍乱弧菌的主要致病因子,具有典型
的 A-B两个亚单位。其中 A亚单位 (CTA)具有
ADP核糖基转移酶活性,是毒素的活性中心;5个
B亚单位(CTB)装配成五聚体,以高亲和力结合表
达于有核细胞—包括上皮细胞、淋巴细胞和抗原呈
递细胞 (antigen-presentingcels,APC)细胞膜上的
GM1神经节苷酯,为球形 A亚单位结合细胞表面
受体后内化所必需。与抗原共同使用,CT虽能有效
增强针对抗原的局部免疫和系统免疫,但是由于
CT的毒性,限制了 CT的临床应用。霍乱毒素 B亚
单位(choleratoxinBsubunit,CTB)除去了 CT的毒
性,但保留了强的免疫原性和佐剂活性,近年来在
疫苗研究领域用作粘膜佐剂和/或载体系统获得
了许多研究进展。深入理解 CTB的免疫调节机理
及其在疫苗研究中的应用,有助于开发和改良疫
苗。
1 CTB的免疫调节机理
1.1 调节 APC反应
树突状细胞(DC)是整个生物体哨兵的专职抗
原抗原递呈细胞(antigen-presentingcels,APC)。一
旦遇见炎症信号,DC运输抗原到淋巴器官,激活抗
原特异性 CD4+和 CD8+T细胞,因此是特异性免疫
诱导的最重要决定因素之一。偶联 CTB的卵清蛋
白(CTB-OVA),在体外脉冲刺激 DC,随后将 DC静
脉注射小鼠,结果表明,CTB-OVA增强了随后针对
对 OVA的 B细胞和 T细胞反应,并优先诱导 2型
T辅助细胞(T-helper2,Th2)反应。进一步研究发
现,CTB偶联抗原的免疫增强能力与 CTB-OVA脉
冲 DC分泌 IL-1β上调和 DC表面共 刺激分子
CD80和 CD86表达增加有关[1]。这些结果提示,CT
andCTB有应用于基于 DC疫苗开发的潜力。Isomura
等[2]研究表明重组 CTB(rCTB),对鼠脾 DC成熟具
有佐剂效应。在体外,rCTB孵育 DC后,DC上 MHC
霍乱毒素B亚单位在疫苗研究中的应用
魏刚才 赵朴 郑玉姝
(河南科技学院动物科学学院,新乡 453003)
摘 要: CTB不同于CT,没有毒性,在体内和体外CTB具有强的免疫调节活性。越来越多的证据表明CTB在疫
苗研究中发挥重要作用。深入理解CTB的免疫调节机制及其在疫苗研究中的应用,有助于设计新疫苗和改良疫苗。因
此,将对CTB在疫苗研究中的应用进展进行综述。
关键词: 霍乱毒素B亚单位 免疫调节机制 疫苗
ApplicationsofCholeraToxinBSubunitinVaccineResearch
WeiGangcaiZhaoPu ZhengYushu
(DepartmentofAnimalScienceandTechnology,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003)
Abstract: Diferentfrom CT,CTBisnontoxic.Interestingly,CTBhasstrongimmunomodulatorypropertiesboth
invivoandinvitro.ThereisgrowingevidencethatCTB playsan importantrolein vaccineresearch.Beter
understandingofimmunomodulatorymechanismofCTBandapplicationsinvaccineresearch,wouldbehelpfultodevelop
novelvaccinesandimprovevaccines.Therefore,applicationsofcholeratoxinBsubunitinvaccineresearchwerereviewed
inthetext.
Keywords: CholeratoxinBsubunitImmunomodulatorymechanism Vaccine
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
I和 B7-2表达上调,并且 DC分泌 IL-12增强。此
外,观察到 DC树突更长,体积更大,这些数据表明
rCTB诱导 DC成熟。
近来,Schnitzler等[3]发现 CT-B诱导了 APC中
细胞信号。在体外 CTB能增加 B细胞和巨噬细胞
中包括 Erk1/2和 p38在内的多个信号分子的磷酸
化作用。CTB也诱导了转录因子 cAMP效应元件 和
NF-κB的转录激活,随后被磷酸酪氨酸抑制作用所
抑制。虽然 MEK1/2的特异性抑制不降低 CTB诱导
细胞表面标志表达,但确实弱化 CTB介导的 IL-6
分泌。这些数据表明,CTB诱导了细胞激活、表面分
子表达和细胞因子产生相关的一系列信号,这有助
于阐明缺乏酶活性全毒素时 CTB佐剂活性。
1.2 调节 T细胞反应
T细胞反应在抗体产生和细胞免疫中发挥重
要作用,CTB能通过调节 T细胞反应而在机体免疫
调节中发挥作用。有研究表明,在小鼠中CTB-OVA能
诱导生殖道中OVA特异性 CTL[4]。阴道内应用 CTB-
OVA激活了引流淋巴结 (draininglymphnodes,
DLN)内产生 IFN-γ的 OVA特异性 CD4+和 CD8+T
细胞。而且,阴道内 CTB诱导 DLN和阴道粘膜分泌
IFN-γ的 CD8+T细胞扩增,并促进了针对 OVA的
抗体产生。重要的是,阴道内 DLN和阴道粘膜中
CTB-OVA促进 OVA特异性细胞毒 T淋巴细胞产
生。另有研究表明,接受 OVA特异性 T细胞受体转
基因的 CD4+T细胞的小鼠中,舌下服用 CTB-OVA
能有效抑制外周效应 T细胞(Tef)对 OVA反应,并
且该抑制与外周淋巴结中 OVA特异性 Foxp3+、
CD25+和 CD4+调节 T细胞发育和 OVA特异性 Tef
细胞的凋亡和损耗有关[5]。
1.3 调节抗体产生
Adamsson等[6]研究表明,体外偶联 CTB的 CpG
寡脱氧核苷酸(ODN)(CTB-CpG)较单独 CpGODN
能更有效刺激鼠脾细胞和人 PBMC促炎症细胞因
子和趋化因子反应。而且,破伤风类毒素作疫苗抗
原皮下免疫,CTB-CpG显著增强抗原特异性 IgG抗
体反应,并改变抗体同种型向 Th1型反应的特异性
模式。与此类似,幽门螺旋杆菌(H.pylori)裂解物与
CTB-CpG鼻内免疫 C57Bl/6小鼠,产生了高水平 H.
pylori特异性 IgG抗体反应,并且免疫鼠具有 IgG2c
抗体反应[7]。重要的是,体外抗原再刺激时,H.pylori
抗原和 CTB-CpG免疫鼠肠系膜淋巴结 CD4+T细胞
产生了有力地 H.pylori特异性增殖和 IFN-γ反应。
而且,H.pylori攻击后,增强了免疫鼠胃肠道内特异
性 IgA抗体反应。
2 CTB在疫苗研究中的应用
2.1 CTB在病毒疫苗中的应用
合成人呼吸道合胞体病毒 T细胞表位 F蛋白
200~225和 255~278氨基酸序列,并分别偶联于匙
孔血蓝蛋白 (KLH)。单独或与 CTB一起鼻内免疫
BALB/c小鼠。结果表明,偶联肽与 CTB混合物不仅
增加了系统反应,而且增加了唾液的粘膜免疫反应[8]。
最近,Isaka等[9]用 A型流感病毒和 B型流感病毒
HA和 rCTB粘膜佐剂鼻内免疫小鼠。结果表明,存
在 rCTB时,这两种 HA疫苗的血清抗 HAIgG和
IgA反应显著增加,并检测到更高水平的 HI和中
和抗体滴度及呼吸道内粘膜 IgA抗体反应。小鼠免
疫后用鼠适应 A型流感病毒鼻内攻毒,HA和 rCTB
同时免疫的所有小鼠生存 7d而肺内没有任何炎症
变化,而没用 rCTB的 HA免疫小鼠仅部分存活,并
且幸存小鼠具有肺实变。这些结果表明,rCTB作为
粘膜佐剂和流感病毒 HA鼻内共同使用,不仅能诱
导系统和粘膜 HA抗体,而且降低小鼠由于病毒感
染造成的发病率和死亡率。
2.2 CTB在 DNA疫苗中的应用
DNA疫苗是近年来发展起来的新型疫苗,但是
由于表达产物的弱免疫原大大限制其应用。近来有
研究表明 CTB能增强 DNA疫苗的效力,这给 DNA
疫苗的开发注入了新的活力。表达人乳头瘤病毒
16L1衣壳蛋白的 DNA疫苗 p16L1与编码 CTB亚
单位的质粒 pCTB共同免疫小鼠,显著升高宫颈分
泌物内(P<0.05)和粪便提取液中(P<0.005)L1
特异性 IgA抗体,并且 pCTB共同免疫增强了脾细
胞的 IL-2和 IFN-γ产量,但没有影响 IL-4产量。表
明是 Th1型辅助反应,而且 pCTB作为 DNA疫苗佐
剂的免疫鼠中观察到 CD8+T细胞介导的细胞毒活
性改善[10]。这些结果表明,使用 pCTB是增强 DNA
疫苗诱导粘膜、Th1和 CD8+T细胞介导细胞毒反应
的有效方法。与此相一致,Han等[11]研究表明 pCTB
能在小鼠中显著增强变形链球菌细胞壁相关蛋白
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ADNA疫苗唾液 IgA反应,并且比编码 IL-5质粒
pil-5的增强效应更持久。
2.3 CTB在肿瘤疫苗中的应用
肿瘤抗原的弱免疫原性是肿瘤疫苗开发的重
要障碍。Isomura等[2]发现 rCTB能激活 DC,并增强
抗肿瘤免疫。皮下注射 MethA肿瘤细胞裂解物刺
激的 rCTB处理 DC能以依赖于 DC数量方式抑制
肿瘤细胞生长。而且,瘤内注射肿瘤裂解物脉冲刺
激的 rCTB处理 DC对已经形成的 MethA肿瘤具
有治疗效应。进一步研究发现,rCTB和肿瘤裂解物
激活的 DC免疫小鼠增加了识别 MethA肿瘤 CTL
前体的数量,而这种抗肿瘤免疫反应在 CD8+T细胞
缺失的小鼠中显著抑制。这些结果表明,rCTB作为
佐剂通过 DC成熟增强抗肿瘤免疫,并且 CD8+T在
肿瘤免疫中发挥重要作用。该研究结果为肿瘤疫苗
的研究开辟了新思路。
2.4 CTB在治疗自身免疫病中的应用
研究表明抗原偶联CTB促进外周免疫耐受的诱
导,这为自身免疫病的治疗提供了新途径。Ruhlman
等[12]用 8mg表达 CTB-人前胰岛素(CTB-Pins)融合蛋
白的转基因烟草叶粉,口服治疗 5周龄雌性非肥胖
糖尿病(non-obesediabetic,NOD)小鼠,一周一次,
共 7周。结果表明 CTB-Pins治疗鼠的胰腺细胞浸
润降低;产生胰岛素的 β细胞显著保护,具有较低
血糖或尿糖水平。相反,阴性对照鼠胰岛中 β细胞
剩余很少,并且 CTB-Pins治疗 NOD鼠中免疫抑制
细胞因子如 IL-4和 IL-10表达增加。血清 IgG1水
平而不是 IgG2a,在治疗鼠中升高。这些结果表明,
Th2介导的口服免疫耐受是阻止胰腺炎和产生胰
岛素的 β细胞保护的可能机制。与此相一致,
Bublin等[13]利用 CTB-变态反应原基因融合,诱导
BALB/c小鼠 Th2反应抑制。这些结果表明 CTB应
用于外周免疫耐受诱导的可行性。
3 结语
综上所述,没有毒性的 CTB在调节 APC反应、
T细胞反应和抗体产生中具有重要的调节作用,并
且在病毒疫苗、DNA疫苗和肿瘤和自身免疫病治
疗疫苗研究中都取得很大的进展。随着 CTB免疫
调节机制的深入研究及其在疫苗研究应用中的不
断完善,CTB将会在新疫苗的开发及疫苗效力的改
良中发挥更大的作用。
参考 文献
1 ErikssonK,FredrikssonM,NordstromI,etal.InfectImmun,2003,
71(4):1740~1747.
2 IsomuraI,YasudaY,TsujimuraK,etal.MicrobiolImmunol,2005,
49(1):79~87.
3 SchnitzlerAC,BurkeJM,WetzlerLM.InfectImmun,2007,75(6):
3150~3159.
4 LuciC,HervouetC,RousseauD,etal.JImmunol,2006,176(5):
2749~2757.
5 SunJB,CzerkinskyC,HolmgrenJ.ScandJImmunol,2007,66(2~
3):278~286.
6 AdamssonJ,LindbladM,LundqvistA,etal.JImmunol,2006,176
(8):4902~4913.
7 Nystrom-AsklinJ,AdamssonJ,HarandiAM.ScandJImmunol,
2008,67(5):431~440.
8 KimHJ,KimJK,SeoSB,etal.ArchPharmRes,2007,30(3):
366~371.
9 IsakaM,ZhaoY,NobusawaE,etal.MicrobiolImmunol,2008,52
(2):55~63.
10 SanchezAE,AquinoG,Ostoa-SalomaP,etal.ClinDiagnLab
Immunol,2004,11(4):711~719.
11 HanTK,DaoML.JMedMicrobiol,2007,56(Pt5):675~680.
12 RuhlmanT,AhangariR,DevineA,etal.PlantBiotechnolJ,2007,
5(4):495~510.
13 BublinM,HoflehnerE,WagnerB,etal.Vaccine,2007,25(50):
8395~8404.
魏刚才等:霍乱毒素B亚单位在疫苗研究中的应用 53