全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
猪繁殖与呼吸综合征病毒M+ N基因重组腺病毒载体的构建
徐娜 李宝玉 柳纪省
(中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兰州 730046 )
摘 要: 本研究构建了 M + N基因的重组腺病毒载体。首先用反转录聚合酶链反应 ( RTPCR )的方法分别扩增出猪繁
殖与呼吸综合征病毒 M基因和 N基因,将两者用口蹄疫病毒 2A序列串联起来, 将连接好的 M + N基因插入腺病毒穿梭载体
pAdT rackCMV, 经筛选获得了重组质粒 pAdT rackCMV /M + N; 然后在大肠杆菌 B J5183内将此重组质粒和腺病毒骨架载体
pAdEasy1进行同源重组, 获得了插有外源基因的重组腺病毒质粒 pAd / M + N;最后, 经 Pac 酶切线性化后转染 HEK293细
胞, 成功获得含有 M + N基因的重组腺病毒,为重组腺病毒活载体疫苗的研究奠定基础。
关键词: 猪繁殖与呼吸系统综合征病毒 M + N基因 重组腺病毒
Construction ofRecombinant Adenovirus Vector Coexpressing theM
and N Gene of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome V irus
Xu Na L iBaoyu L iu Jix ing
(Animal InfectiousD iseases Research Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese A cademy of Agricultural Sciences, State
K ey Laboratory of Veterinary E tiological B io logy, Key Laboratory of Veterinary PublicH ealth of M inistry of A griculture, Lanzhou 730046)
Abstrac:t In th is study, the recomb inant adenov irus containing theM and N genes s imu ltaneously was successfu lly obta ined fo r
the f irst tim e. To construct recomb inant adenov irus, first, theM and N genew ere amp lified by RTPCR, linked by FMDV 2A sequence,
and inserted into shuttle vector pAdT rackCMV, then be ing screened and ob tained a recom b inant p lasm id o f pAdT rackCMV /M + N;
secondly, using pAdT rackCMV /M + N and the pAdEasy1 system by em ploy ing hom o logous recomb ination was effic iently constructed
intoE. co li stra in BJ5183, bearing exogenous PRRSV genes o f recomb inant adenov irus; th ird, the recomb inant vecto r construct w as
cleaved byP ac and transfected intoHEK293A packag ing cell line. The stra in o f recomb inant adenov irus containingM and N gene
from PRRSV stra in w as successfully obta ined. Th is treatise prov id ing a basis for the resea rch o f recom binant rep licationde fective ade
nov irus vaccine coexpressing theMP and NP o f PRRSV.
Key words: PRRSV M + N gene Recomb inant adenov irus
收稿日期: 20100702
作者简介:徐娜,女,在读硕士研究生,研究方向:分子病毒学; Em ai:l jun jun258660350@ 126. com
通讯作者:柳纪省, Em ai:l liu jixing@ hotm ai.l com
猪繁殖与呼吸综合征 ( porcine reproductive and
resp iratory syndrome, PRRS)俗称猪蓝耳病, 是由病
毒引起的一种高度接触性传染病, 可导致母猪晚期
流产、早产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪严重
的呼吸道症状及高死亡率。 PRRSV是一种有囊膜
的单股正链 RNA病毒, 基因组长约 15 kb,有 8个不
同程度的开放阅读框 ( ORFS ) ,即 ORF1- ORF7。该
病毒具有 3个重要的结构蛋白、即 E蛋白、M蛋白
和 N蛋白, 这三种蛋白分别由病毒基因 ORF5、
ORF6和 ORF7编码。其中 M蛋白在所有的 PRRSV
株间高度保守, 其聚集于粗面型内质网上, 并与 E
蛋白形成异源二聚体。通过对感染猪康复血清的
W estern免疫印迹分析, M 蛋白具有很强的免疫原
性, 感染 10 d即可激发可检测的抗体应答 [ 1, 2] ,表达
的重组 M蛋白可以作为血清学试验的靶抗原 [ 3]。N
蛋白是一种碱性磷酸蛋白, 自身以二硫键形成同源
二聚体。N蛋白构成病毒的主要抗原, 免疫原性极
强, N蛋白有 6个疏水区和 5个抗原决定簇, 包括对
所有毒株保守的共同决定簇和北美型或欧洲型特异
性决定簇 [ 4] ,其主要的抗原决定簇主要分布在蛋白
2010年第 10期 徐娜等:猪繁殖与呼吸综合征病毒 M + N基因重组腺病毒载体的构建
的中央。
腺病毒载体具有稳定性、对外源 DNA的高容
量、宿主范围广以及可以产生高滴度后代等优点,在
基因治疗、基因工程疫苗的开发上具有广泛的应用。
PRRSV基因重组腺病毒活载体疫苗多是以缺失 E1
和 E3基因编码区的人 5型腺病毒为载体进行构建
的。鉴于此, 本研究通过构建 M + N基因的重组腺
病毒载体, 为重组腺病毒活载体疫苗的研究奠定
基础。
1 材料与方法
11 病毒、细胞及载体
猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲毒株由中国农业
科学院惠赠; pGEM 7Zf ( + )载体购自大连宝生物
( TaKaR a)公司; 大肠杆菌菌株 JM 109等为中国农
业科学院兰州兽医研究所传染病室保存, 腺病毒穿
梭载 体 ( pAdTrackCMV )、腺 病 毒 骨 架 载 体
( pAdE asy1)、BJ5183、DH10B菌株购于上海杰美生
物技术公司。
12 主要试剂及工具酶
病毒总 RNA提取试剂盒购自 Promega公司;
BamH I, H ind !, Kpn I, Xho I等限制性内切酶; 反
转录酶 AMV, DNA连接酶和 Taq DNA聚合酶, 高保
真酶, RNA酶抑制剂 ( RNAsin), DNA回收试剂盒,
质粒快速提取试剂盒购自大连宝生物 ( TaKaR a)
公司。
13 方法
131 引物设计与合成 设计合成 M基因 5∀和 3∀
端分别带有 Kpn I和 H ind !限制酶切位点的引物,
分别命名为 M1和 M2; 同时设计合成 N基因 5∀和
3∀端分别带有 H ind !和 BamH I, Xho I限制酶切
位点的引物, 分别命名为 N1和 N2。引物序列
如下:
M 1: 5∀CTTGGTACC GGGTCGTCTCTAGAC3∀
Kpn I酶切位点
M 2: 5∀CGCAAGCTT AAGAAGGTCAAAATTCAACAG
GAGACGACCCCATAGTTC3∀
H ind !酶切位点 2A序列
N1: 5∀CTTAAGCTT GCGGGAGACGTCGAGTCCAAC
CCCGGGCCCATGCCAAATAACAACGGC3∀
H ind !酶切位点 2A序列
N2: 5∀CGCGGATCCCTCGAGTCATGCTGAGGGTGAT
GC3∀
BamH I酶切位点 Xho I酶切位点
132 RTPCR反应 取模板 RNA溶液 10 L, 5
# Reverse Transcriptase Buffer 4 L, dNTP M ixture 2
L, RNase Inh ib itor 2 L,下游引物 1 L, AMV R e
verse Transcriptase 1 L。点击离心混匀, 室温放置
10 m in后, 移入 42∃ 恒温槽中 , 42∃ 保温 1h, 在
冰水中冷却 2 m in。得到的 cDNA用于 PCR扩
增, 加入 Taq预混酶 25 L, 上下游引物各 1 L,
cDNA 2 L, ddH 2O 21 L。 95∃ 5 m in, 94∃ 30
s, 58∃ 40 s, 72∃ 1 m in, 共进行 30个循环, 然后
72∃ 延伸 10 m in。取 PCR产物进行 %l 琼脂糖凝
胶电泳。
133 M基因和 pGEM 7Zf( + )载体的连接 将
扩增好的 M基因克隆入 pMD18T Simp le载体上,用
Kpn I和 H ind !分别酶切重组质粒 pMD18T S im
ple /M和 pGEM 7Zf ( + )载体, 将切下的 M 基因亚
克隆入 pGEM 7Zf ( + )载体中, 完成 M 基因和
pGEM 7Zf( + )载体的连接,阳性质粒命名为 pGEM
7Zf( + ) /M。
134 N基因和 PGEM 7Zf( + ) /M质粒的连接
用H in d!和 BamH I分别双酶切 N基因和 pGEM7Zf
( + ) /M质粒,完成 N基因和 pGEM7Zf( + ) /M质粒
的连接,阳性质粒命名为 pGEM 7Zf( + ) /M + N。
135 M + N基因连接入穿梭载体 用 Kpn I和
Xho I 分别双酶切 pGEM 7Zf ( + ) /M + N 和
pAdT rackCMV穿梭载体, Pme I线性化重组好的穿
梭质粒。
136 细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒 制
备 BJ5183电转化感受态细菌, 重组穿梭质粒经 Pme
I线性化和碱性磷酸酶处理后电转化感受态细菌,
卡那霉素抗性筛选, Pac I酶切鉴定出重组腺病毒质
粒, 命名为 pAd /M + N。
137 重组腺病毒质粒转染 HEK293细胞 Pac I
酶切线性化, 乙醇沉淀后, 用 L ipo fectam ine2000 ( In
v itrogen产品 )转染试剂进行转染。
138 荧光显微镜检测报告基因 EGFP的表达
取转染 48 h的 HEK293细胞, 置于荧光显微镜
下观察。
169
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
2 结果与分析
21 重组质粒 pGEM 7Zf( + ) /M的鉴定
211 酶切鉴定 用 Kpn I和H in d !酶切重组质
粒 pGEM 7Zf( + ) /M, 可获得长约 2 950 bp和 532
bp左右大小的片段 (图 1), 说明目的基因 M已插入
pGEM 7Zf( + )载体中。
M. 100 bp marker; 1.酶切产物
图 1 重组质粒 pGEM7Zf( + ) /M的酶切鉴定
21. 2 PCR鉴定 用重组质粒作模板, 用引物 M1
与 M2进行扩增, 获得了长约 532 bp左右的酶切片
段 (图 2), 说明插入的片段为目的基因 M。
M. 100 bpm arker; 1. PCR产物
图 2 重组质粒 pGEM 7Zf( + ) /M 的 PCR鉴定
2. 2 重组质粒 pGEM 7Zf( + ) /M + N的鉴定
221 酶切鉴定 用 Kpn I和 BamH I酶切重组质
粒 pGEM 7Zf( + ) /M + N, 可获得长约 2 940 bp和
950 bp左右大小的片段 (图 3) ,说明目的基因 M +
N已插入 pGEM 7Zf( + )载体中。
1.酶切产物; M 1. 200 bp marker; M 2. 100 bp m ark er
图 3 重组质粒 pGEM 7Zf( + ) /M + N的酶切鉴定
222 PCR鉴定 用重组质粒作模板, 用引物 M1
与 N2进行扩增,获得了长约 950 bp左右的酶切片
段 (见图 4), 说明插入的片段为目的基因M+ N。
M. 100 bp m ark er; 1, 2. PCR产物
图 4 重组质粒 pGEM7Zf( + ) /M + N的 PCR鉴定
23 重组腺病毒质粒的鉴定
重组腺病毒质粒经卡那霉素抗性筛选, Pac I
酶切鉴定正确, 切出一条约 4. 5 bp大小的片段
(图 5) , 说明外源基因已经插入腺病毒骨架载
体中。
170
2010年第 10期 徐娜等:猪繁殖与呼吸综合征病毒 M + N基因重组腺病毒载体的构建
M. T14m arker; 1, 2.酶切产物
图 5 重组腺病毒质粒的酶切鉴定
24 重组腺病毒转染 HEK293细胞
将 Pac I酶切线性化的重组腺病毒质粒转染生
长良好的低代次 293细胞, 可产生重组腺病毒。用
此重组腺病毒再次感染低代次 293细胞, 3– 5 d后
可见细胞病变 ( CPE) ,病变细胞肿胀、变圆、聚集,部
分病变细胞脱落 (图 6A ), 与正常细胞 (图 6B )比
较,可见明显的病变。
3 讨论
腺病毒载体具有宿主范围广, 对人致病性低;
在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因; 基因组相
对稳定;能有效进行增殖, 滴度高;与人类基因同源;
不整合到染色体中,无插入致突变性;能在悬浮培养
液中扩增;能同时表达多个基因等优点。构建重组
腺病毒工作中的限速步骤是将目的基因整合入腺病
毒基因组中。以前大都是将外源基因插入以质粒形
式存在的腺病毒穿梭载体上,而后用真核细胞内质
粒间同源重组的方式得到重组腺病毒。这种方法虽
然有效,但同源重组效率低,不能完全避免野生型病
毒的产生,需进行噬斑纯化,试验周期长。利用大肠
杆菌细胞内同源重组的方法构建重组腺病毒显示了
优越性。
图 6 A.病变组; B.正常组
本研究在 PRRSVM和 N基因之间导入 2A序列,
能使一个阅读框同时表达两种不同的免疫蛋白,避免
了融合表达对蛋白活性的影响。多肽片段 2A能够在
绝大多数真核细胞中裂解,裂解效率 97%以上。
参 考 文 献
[ 1] Yoon KJ, Zmi m erm an JJ, Sw enson SL, et a.l Characterizat ion of hum or
al mi m un e respon se to porcine reproductive and resp iratory syndrom e
( PRRS) virus infection. JVetD iagn Inves,t 1995, 7: 305312.
[ 2 ] Loem baHD, M oun ir S, M ardass iH, et a.l Kin etics of hum oral mi mune
respon se to them ajor structu ral proteins of the porcine rep roductive and
respiratory synd rome virus. A rchV iro,l 1996, 141: 751761.
[ 3]M eng XJ, Pau lPS, H albu r PG, et a.l S equ ences com parison ofopen
reading fram es 2 to 5 of low and h igh v iru lence Un ited s tates isolates
of porcine rep roduct ive and respiratory syndrom e virus. JGen V iro,l
1995, 76: 31813188.
[ 4] Dea S, Gagnon CA, MardassiH, et a.l Ant igen ic variab ility ofporcine
reproduct ive and respiratory synd rome as def ined by m onoclonal an ti
bod ies to them atrix protein. J C linM icrob io,l 1996, 34: 14881493.
171