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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
I型单纯疱疹病毒胸苷激酶真核
表达载体的构建及其表达鉴定
樊萍 1 　杨竹 1 　胡接力 2 　崔静 2 　汤雄文 1 　王露颖 1 　甘胜伟 3
(1 重庆医科大学附属第二医院妇产科 ,重庆 400010; 2 重庆医科大学感染性疾病重点
实验室 ,重庆 400016; 3重庆医科大学解剖教研室 ,重庆 400016)
　　摘 　要 : 　为构建单纯疱疹病毒 I型胸苷激酶 (HSV1 TK)的真核表达载体 pcDNA3. 12EGFP /HSV1 TK,鉴定其在真核细胞中
的表达和功能。以 pORF2HSV1 TK为模板 , PCR扩增的目的基因 HSV1 TK片段与 pMD182T载体相连接构建重组克隆 pMD182T/
HSV1 TK。再双酶切出 HSV1 TK片段 ,插入 pcDNA3. 12EGFP多克隆位点 ,构建 pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK真核表达载体并进行酶
切、测序鉴定 [1 ]。分别用荧光显微镜观察和 RT2PCR方法检测脂质体介导 pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK在卵巢癌细胞 SKOV3 的表
达 ;分别用 MTT法和光镜检测胸苷激酶 /丙氧鸟苷 (HSV1 TK/GCV)系统对 SKOV3 体外杀伤作用及旁观者效应。结果表明 ,重组
载体酶切鉴定结果与预期结果一致 ,基因序列与 GenBank上报道的 HSV1 TK基因序列完全一致。荧光显微镜观察转染后的细胞
发出绿色荧光 ; RT2PCR结果表明 HSV1 TK基因能在 SKOV3 内有效表达。MTT和光镜结果显示转染 HSV1 TK基因的 SKOV3 细
胞 ,加入前体药物丙氧鸟苷 ( GCV)处理后对其有明显的杀伤作用和旁观者效应。成功构建的真核表达载体 pcDNA3. 12EGFP /
HSV1 TK能在 SKOV3 细胞中稳定表达 ,且 HSV1 TK对卵巢癌细胞株 SKOV3 体外有强大的杀伤作用和旁观者效应。
关键词 : 　自杀基因 　胸苷激酶 /丙氧鸟苷 　真核表达载体 　旁观者效应 　卵巢癌
Construction of Enhanced Green Fluorescent Prote in and HSV1 TK
Co2expression Vector and Expression in Ovar ian Cancer Cells SKOV3
Fan Ping1 　Yang Zhu1 　Hu J ieli2 　Cui J ing2 　Tang Xiongwen1 　W ang Luying1 　Gan Shengwei3
(1 Departm ent of Obstetrics and Gynecology, 2nd Affilia ted Hospital of Chongqing M edical University, Chongqing 400010;
2 Key Laboratory of M olecular Infectious D iseases, M inistry of Education, Chongqing M edical University,
Chongqing 400016; 3 Anatom y Departm ent of Chongqing M edical University, Chongqing 400016 )
　　Abs trac t: 　 It was construct EGFP and HSV1 TK co2exp ression vector and detect its exp ression and function in eukaryocyte ovarian
cancer cells SKOV3. The HSV1 TK gene were inserted into cloning vector pMD182T to construct the p lasm id of pMD18 / HSV1 TK. The
HSV1 TK gene fragment obtained from pMD18T/HSV1 TK that was digested, and then inserted into pcDNA3. 12EGFP. The recombinant
pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK was identified with restriction analysis and DNA sequence. The exp ression p lasm id pcDNA3. 12EGFP /
HSV1 TK was transfected into ovarian cancer cells SKOV3 mediated by liposome reagent, then the exp ressions of EGFP in cellswere ob2
served by fluorescence m icroscopy and HSV1 TK was detected with RT2PCR. The killing SKOV3 effect and bystander effect of HSV1 TK/
GCV was observed by MTT and light m icroscope. Results showed that the sequence of the cloned DNA fragment was identical to
HSV1 TK that was reported on GenBank, and the exp ression of vector pcDNA3. 12EGFP was correct. The recombinant exp ression p las2
m id was successfully transferred into ovarian cancer cells SKOV3 , and effective exp ression of HSV1 TK was also testified by RT2PCR.
Thus, the recombinant eukaryotic co2exp ression vector of EGFP and HSV1 TK was successfully constructed and effectively exp ressed in
ovarian cancer cells SKOV3. HSV1 TK/GCV has better killing effects and bystander effect in SKOV3 cells .
收稿日期 : 2009201212
基金项目 :重庆市教委重点科研项目 ( KJ070310)
作者简介 :樊萍 (19792) ,女 ,硕士研究生 ,主要研究方向 :妇科肿瘤 ; E2mail: fanfan8231@ gmail. com
通讯作者 :杨竹 ,教授 , E2mail: cqyangz@ vip. 163. comKey wo rds: 　Suicide gene　HSV1 TK/GCV　Eukaryotic co2exp ression vector　Bystander effect　Ovarian cancer
2009年第 7期 　　樊萍等 : I型单纯疱疹病毒胸苷激酶真核表达载体的构建及其表达鉴定
　　HSV1 TK基因是从 I型单纯疱疹病毒 (HSV1 )中
提取的能编码胸苷激酶的基因。Moolten [ 2〗在 1986
年首先报道 ,癌细胞在插入胸苷激酶基因、并经
GCV作用后 ,发生细胞死亡 ,其原因为胸苷激酶能
在肿瘤细胞内将抗病毒的无毒药物前体 GCV磷酸
化 ,转化成为核苷酸类似物三磷酸 GCV,三磷酸
GCV进入 DNA合成途径 ,作为链的终止剂 ,干扰细
胞分裂时 DNA合成从而杀伤肿瘤细胞 [ 3 ]。旁观者
效应是自杀基因系统另一重要抗肿瘤机制 ,即部分
肿瘤细胞未被成功转染 ,凋亡小体或毒性代谢产物
通过胞间缝隙连接通道 ( GJ Ic)的传递 ,通过旁观者
效应杀死邻近未转染的肿瘤细胞。自杀基因 ( sui2
cide genes)疗法又称为前药敏感基因 (p ro2drug sen2
sitive genes)疗法 ,是利用转基因的方法 ,将哺乳动
物不含有的药物酶基因
转入肿瘤细胞内 ,该基因表达的产物可以将无
毒的药物前体转化为肿瘤内代谢有毒性的药物 ,影
响细胞 DNA的合成 ,从而杀死肿瘤细胞。具有代表
性的自杀基因系统包括 HSV1 TK/GCV、CD /52Fc。
本课题构建 pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK真核表
达载体 ,转染卵巢癌细胞使其能有效表达目的基因
并在卵巢癌细胞中发挥抗肿瘤效应 ,为下一步研究
靶向非病毒载体介导自杀基因治疗卵巢癌的抗肿瘤
机制和对旁观者效应的影响奠定基础 ,为临床试验
提供理论依据。
1　材料和方法
111　材料
Primestar高保真 DNA 聚合酶、LA Taq 酶、
dNTPs、H ind III、EcoR I限制性内切酶、逆转录试剂
盒、pMD182T载体及通用引物 RV2M /M13247 (大连
TaKaRa公司 )、质粒抽提试剂盒 (Q IAGENE M ID I
KIT)、DNA凝胶回收试剂盒 (Omega公司 )、T4 DNA
连接酶 ( Promega公司 )、DNA Marker III (北京天根
公司 )、DNA Marker gene ruler ( Fermentas公司 )、阳
离子脂质体 L ipofectam ine 2000、Trizol试剂 ( Invitro2
gen公司 )、引物、LB 培养基、琼脂糖 (上海生工 )、
Goldview (北京天为时代公司 )、JM109菌株、卵巢癌细
胞株 SKOV3 本实验室保存 ; GCV产自中国潜江制药
厂 , pORF2HSV1 TK载体由本实验室保存 ; pcDNA3.
12EGFP载体由重庆医科大学感染性疾病分子生物
学重点实验室崔静惠赠。
112　方法
11211　HSV1 TK基因的克隆 　根据 GenBank所公
布的 HSV1 TK全长序列 ,利用 Prem ier Primer 5. 0软
件辅助设计引物。在 HSV1 TK两端设计并合成分别
带有 H ind III和 EcoR I两酶切位点 (下划线部分 )
的一对引物 , 酶切位点端分别加入保护碱基 ,
HSV1 TK基因上游引物 P1: 5′2GCAAGCTTATGGC2
CTCGTACCCCGGCCA23′下游引物 P2: 5′2AGCGAAT2
TCTCAGTTAGCCT23′。以 pORF2HSV1 TK载体为模
板 , PCR扩增出的目的基因片段。 PCR 反应条件 :
94℃ 2 m in; 94℃ 15 s 60℃ 10 s; 72℃ 1. 5 m in, 10个
循环 ; 94℃ 15 s 50℃ 10 s, 72℃ 1. 5 m in, 25个循环 ;
72℃ 5 m in, 4℃保存。乙醇沉淀法纯化 PCR产物。
11212　重组克隆 pMD182T/HSV1 TK的构建 　将纯
化的 PCR产物 HSV1 TK加 A ,琼脂糖凝胶电泳后胶
回收加 A HSV1 TK产物 ,将 pMD218T载体和胶回收
产物在 16℃连接 3 h。转化感受态细菌 JM109 ,接种
于氨苄抗性的 LB平板 , 37℃过夜培养 ,次日挑单克
隆摇菌 ,进行酚氯仿初筛 ,用菌落 PCR、提质粒后酶
切鉴定和通用引物 DNA测序鉴定重组克隆 pMD182
T/HSV1 TK中的 HSV1 TK基因序列。
11213　真核表达载体 pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK
的构建及鉴定 　将质粒 pMD182T/HSV1 TK和 pcD2
NA3. 12EGFP分别用 H ind III和 EcoR I双酶切 ,胶
回收 HSV1 TK片段和线性化的 pcDNA3. 12EGFP载
体 ,将片段与载体用 T4 连接酶连接 ,按以上方法提
质粒后双酶切及测序鉴定重组克隆 pcDNA3. 12EG2
FP / HSV1 TK,酶切产物行 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定
并于 - 20℃保存。用 Q IAGENE M ini Kit提取质粒 ,
用紫外分光光度计测得浓度为 1μg/μl。
11214　转染 pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK入卵巢癌
细胞 SKOV3 进行功能鉴定 　用含 10%胎牛血清
( FBS)的 1640培养液 ,在 37℃, 5% CO2 孵箱中培养
SKOV3。转染前 24 h,换取新鲜培养液调整细胞浓
度为 1 ×105 个 /m l,以 1 m l/孔接种于 24孔培养板
中培养 ,设空质粒对照组 pcDNA3. 12EGFP,待细胞
增至 80%时进行转染 ,转染前换成无血清无抗生素
的培养基。质粒 0. 8μg(0. 8μl)与脂质体 2000TM 2
μl轻轻混匀 ,室温静置 30 m in,使其互相黏附 ,稳定
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
后吸取加入每孔中吹打混匀。置 37℃, 5% CO2 孵
箱中培养 4 h后 ,换新鲜含 10%胎牛血清 ( FBS)的
1640培养液 ,继续培养 24 h后荧光显微镜 488 nm
下观察真核表达载体 pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK和
空质粒 pcDNA3. 12EGFP的 EGFP蛋白在卵巢癌细
胞的表达情况。
11215　RT2PCR 检测 HSV1 TK基因在 SKOV3 的表
达 　按以上方法转染 SKOV3 ,调整细胞浓度为 5 ×
105 个 /m l,以 2 m l/孔接种于 6孔培养板 ,待细胞增
至 80%时进行转染。质粒 4. 0μg ( 4. 0μl)与脂质
体 2000TM 4μl轻轻混匀 ,室温静置 30 m in,使其互相
黏附 ,稳定后混匀转染每孔细胞 ,继续培养至第 48
h,用 Trizol提取细胞总 RNA,紫外分光光度计测其
浓度 ,按逆转录试剂盒说明书的标准体系 ,反应条
件 : 37℃, 15 m in; 85℃, 5 s;逆转录得到 cDNA,内参
为β2actin ,引物 actin 2F: 5′2GTGGATCAGCAAGCA
GGAGT23′, actin2R: 25′TGTGTGGACTTGGGAGAGGA23′。根据设计的引物 P3: 5′2GCCGTTCTGGCTCCTC
ATAT23′P2: 5′2AGCGAATTCTCAGTTAGCCT23′, 以
逆转录得到 cDNA为模板扩增得到 HSV1 TK片段 ,
反应条件 : 94℃ 2 m in; 94℃ 15 s, 60℃10 s, 72℃ 115
min, 10个循环 ; 94℃ 15 s, 50℃10 s, 72℃ 1. 5 min, 25个
循环 ; 72℃5 min, 4℃保存。
11216　光镜观察 GCV对转染 HSV1 TK基因的 SK2
OV3 细胞作用 　按以上方法调整细胞浓度为 1 ×104
个 /m l种 96孔板转染后培养至第 48 h,加入 GCV
终浓度为 100μg/m l,继续培养至第 72 h,光镜下观
察转染 HSV1 TK基因阳性细胞与对照组阴性细胞数
量形态变化。
11217　M TT检测 GCV对转染 HSV1 TK基因的 SK2
OV3 的生长抑制率 　按以上方法转染培养至第 72
h,每孔吸弃培养液 , PBS冲洗 2遍 ,每孔加入 M TT
(浓度 5 mg/m l) 20μl液 ,置孵箱培养 4 h后 ,每孔
加入 DM SO 150μl,充分振荡 10 m in,酶标仪读板
检测 ,观察不同处理组的细胞生长抑制率 = ( 1 -
试验组吸光度 OD 值 /对照组吸光度 OD 值 )
×100%。
2　结果
211　HSV1 TK基因片段克隆
以 pORF2HSV1 TK载体为模板 , 以分别带有
H ind III和 EcoR I两酶切位点的一对引物 , PCR扩
增出的目的基因片段 1 128 bp ,凝胶电泳结果 (图
1)。
M. DNA Marker III; 1～4. 目的基因 HSV1 TK的 PCR产物
图 1　目的基因 HSV1 TK的 PCR产物
M. DNA Marker ; 1. H ind III + EcoR I
双酶切 ; 2. H ind III单酶切
图 2　pMD182T /HSV1 TK酶切鉴定
213　重组克隆 pMD182T/HSV1 TK的构建
将重组克隆 pMD182T/HSV1 TK分别进行 H ind
III单酶切和 H ind III + EcoR I双酶切鉴定 ,因为 T载
体的多克隆位点有 H ind III、EcoR I两个酶切位点 ,
目的基因片段也引入了 H ind III、EcoR I两个酶切位
点 ,只有定向克隆目的基因插入方向正确的酶切才
能够出现 1 128 bp的片段 (图 2)。通用引物测序结
果同 GenBank中公布 HSV1 TK的序列完全一样。
214　酶切鉴定重组克隆 pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK
经过一系列的酶切 ,连接反应过程 , HSV1 TK基
因全编码序列的 DNA片段被定向克隆入质粒载体
pcDNA3. 12EGFP多克隆位点的 H ind III和 EcoR I
之间 ,酶切鉴定 (图 3)。
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2009年第 7期 　　樊萍等 : I型单纯疱疹病毒胸苷激酶真核表达载体的构建及其表达鉴定
M. DNA Marker gene ruler; 1. EcoR I单酶切 ; 2. H ind III
单酶切 ; 3. H ind III + EcoR I双酶切
图 3　重组克隆 pcD NA3. 12EGFP / HSV1 TK酶切鉴定
M. DNA Marker gene ruler; 1. 转染空质粒 pcDNA3.
12EGFP组 ; 2. 转染 pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK组
图 4　SKO V3转染质粒后 RT2PCR结果
215　荧光显微镜观察重组克隆 pcDNA3. 12EGFP /
HSV1 TK在 SKOV3 的表达
转染 pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK和 pcDNA3. 12
EGFP质粒后 24 h,在荧光显微镜下 SKOV3胞质中
可观察到特异性的绿色荧光 (图 5) ,两组绿色荧光
的强度无明显差异 ,高倍镜下计数转染效率分别为
17. 50% ±0. 55% , 16. 86% ±0. 73% , P = 0. 0512 >
0. 05,说明两组转染效率差异的比较无统计学意义 ,
从而说明 EGFP的表达对目的基因的表达无明显
影响。
216　RT2PCR检测 SKOV3 中 HSV1 TK基因的表达
SKOV3 细胞分别转染空质粒 pcDNA3. 12EGFP
和 pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK质粒后 ,提取总 RNA,
逆转录得到的 cDNA为模板 PCR扩增产物的凝胶
　　A. 转染空质粒 pcDNA3. 12EGFP ( ×100) , a ×200;
　　B. 转染构建目的质粒 pcDNA3. 12EGFP /HSV1 TK( ×100) , b ×200
图 5　荧光显微镜下 EGFP在卵巢癌细胞 SKO V3中的表达
A.转染 TK基因加入 GCV后 48 h细胞数量和形态 ( x100) , a ×200;
B.未转染 TK基因加入 GCV后 48 h细胞数量和形态 ( x100) , b ×200
图 6　光镜下 GCV对细胞生长状态的影响
电泳结果 (图 4)。空质粒组只有β2actin内参条带
416 bp,试验组扩增出 728 bp HSV1 TK片段和内参条
带 416 bp,与预期结果相符。
217　GCV对转染 HSV1 TK基因的 SKOV3 细胞抑制
作用光镜观察
转染 HSV1 TK基因的 SKOV3 细胞培养至第 48
h,加入 GCV终浓度为 100μg/m l,培养至第 72 h,光
镜下观察到转染 HSV1 TK基因阳性细胞数量明显减
少 ,细胞整体轮廓模糊 ,细胞胞突消失 ,胞体变圆变
小 ,胞膜变形皱缩 ,细胞内出现很多颗粒物质及空
泡 ,贴壁不牢、皱缩 ,部分细胞脱落漂浮于培养液 ,并
有较多细胞碎片 ;未转染 HSV1 TK基因的细胞数量
无明显减少 ,生长状态较好 ,细胞呈正常的梭形 (图
6)。说明 HSV1 TK基因转染到 SKOV3 细胞发挥了
其对细胞的杀伤功能。
218　MTT检测 GCV对转染 HSV1 TK基因的 SKOV3
生长抑制
转染 HSV1 TK基因 48 h后 ,加入 GCV终浓度为
100μg /m l,培养至第 72 h进行 MTT检测。GCV对
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
转染 HSV1 TK基因的 SKOV3 有明显杀伤作用 ,而对
空白对照组未转染 HSV1 TK基因细胞无明显杀伤作
用 ,光密度值及抑制率见表 1。
表 1　GCV对转染 TK基因的卵
巢癌细胞 SKO V3 的生长抑制
试验分级 光密度值 (OD) 抑制率 ( % )
空白对照级 0. 893 ±0. 071 0
脂质体组 0. 577 ±0. 084 35. 39
3　讨论
近年来 ,肿瘤的生物学治疗已经成为除传统手
术、化疗、放疗之外重要的治疗方式。实验研究表明
卵巢癌的自杀基因治疗疗效显著 ,已发现多种克隆
的药物前体基因 ,其中应用最广泛的是单纯疱疹病
毒胸苷激酶 (HSV1 2TK)基因及胞苷脱氧酶 (CD )基
因。由于肿瘤自杀基因疗法操作相对容易 ,疗效确
切 ,尤其是大部分自杀基因存在明显的旁观者效应
( bystander efect) [ 4 ] ,能数十倍地增加对肿瘤的杀伤
作用 [ 5 ] ,还可以通过胞间缝隙连接通道 ( GJ Ic)的增
效剂来进一步提高旁观者效应 [ 6 ]。从而弥补基因
治疗载体的众多不足。HSV1 TK对卵巢癌细胞除了
自杀基因本身的杀伤作用之外 ,还可以提高肿瘤细
胞对化疗的敏感性 [ 7 ]。因此 ,自杀基因治疗卵巢癌
有极广阔的应用前景。
采用新型报告基因 ———增强型绿色荧光蛋白
( EGFP)基因 ,其优势在于 EGFP标记技术是目前迅
速发展的一种新型细胞示踪技术 [ 8 ]。在 470 nm (或
395 nm)波长处可吸收激发光 ,在 510 nm发射绿色
荧光 ;在紫外光或蓝光照射下 ,只要有足够的表达 ,
无需像氯霉素 2乙酰转移酶 Ⅱ、β2半乳糖苷酶、荧光
素酶等报告基因 ,要引入底物、辅助因子才能检测其
活性 ,直接在体外细胞或活体内通过荧光显微镜或
流式细胞技术就能清晰地检测到。并且 EGFP蛋白
因缺乏免疫原性并不引起宿主产生强的免疫反
应 [ 8, 9 ]。将 EGFP与 HSV1 TK基因的编码区连接到
一个载体上 ,可以在活体细胞或生物体内动态观察
目的蛋白的表达、分布及其效应 [ 10 ]。在质粒转染
后 ,通过荧光显微镜观察到大量绿色荧光 ,说明已有
大量质粒转染入细胞并表达功能蛋白 ,为后期研究
不同转染方法的转染效率提供直观的检测方法。
DNA质粒易导入细胞内 ,而且质粒导入细胞后长时
间稳定表达 ,这就便于对靶基因的表达进行较长时
间的功能研究。
自杀基因系统治疗卵巢癌可在一定程度上弥补
基因转染效率低、特异性差的缺陷 ,提高基因治疗效
果。通过选择构建高效能载体系统、应用靶向性调
控机制可增强疗效 [ 11～13 ] ,在表达载体上引入组织特
异性启动子成为基因靶向治疗的热点。pcDNA3. 12
EGFP /HSV1 TK质粒组成包括 4部分 : EGFP的真核
表达载体 pcDNA3. 1 ( + ) ;位于多克隆位点上游的
CMV启动子 ;多克隆位点 ;目的基因 HSV1 TK插入多
克隆位点。通过 PCR技术在 HSV1 TK基因序列两端
克隆引入 H ind III、EcoR I两个限制性内切酶位点 ,
H ind III位点端加入 2个保护碱基、EcoR I位点端加
入 3个保护碱基。由于 H ind III端只有两个保护碱
基直接酶切不能被切成粘性末端 ,而影响连接到
pcDNA3. 12EGFP,所以先选择构建重组克隆 pMD182
T/HSV1 TK,再将酶切后 HSV1 TK连接到 pcDNA3. 12
EGFP载体上 ,最后构建的重组 pcDNA3. 12EGFP /
HSV1 TK载体 ,通过酶切鉴定及测序证明重组 pcD2
NA3. 12EGFP / HSV1 TK 载体构建成功。将重组
pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK 转 染 SKOV3 鉴 定
HSV1 TK基因功能 ,在 SKOV3 胞核和胞浆中获得高
表达 ,说明 pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK能在真核细
胞中高表达 ,空质粒组 EGFP的表达不影响目的基
因表达 ,这为后期研究不同转染方法的转染效率提
供直观的检测手段。HSV1 TK基因位于 EGFP上游 ,
EGFP与 HSV1 TK表达的蛋白为非融合蛋白 ,细胞中
有绿色 EGFP表达还不能完全说明 HSV1 TK有表
达 ;进一步用 RT2PCR检测到转染了 pcDNA3. 12EG2
FP / HSV1 TK质粒的 SKOV3 中 HSV1 TK基因的 mR2
NA表达 ,得到 728 bp HSV1 TK片段 ,证明 HSV1 TK能
够在卵巢癌细胞中表达。只要 HSV1 TK在宿主细胞
内有足够的表达活性 ,表达蛋白有正常的功能 ,转染
HSV1 TK基因的细胞加入无毒药物前体 GCV后 ,出
现明显的细胞杀伤作用。本研究用脂质体介导
pcDNA3. 12EGFP / HSV1 TK转染 SKOV3 效率为 17.
50% ,MTT检测到在 GCV浓度为 100μg/m l时就可
杀死 35. 39 %的细胞 ,给药后光镜观察到细胞数量明
显减少 ,胞突消失 ,胞体变圆变小 ,胞膜变形皱缩 ,部
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2009年第 7期 　　樊萍等 : I型单纯疱疹病毒胸苷激酶真核表达载体的构建及其表达鉴定
分细胞脱落漂浮有较多细胞碎片 ,而对照组未转染
HSV1 TK基因的细胞加入 GCV后数量无明显减少 ,生
长状态较好 ,细胞呈正常的梭形 ,证明了 HSV1 TK基
因发挥对细胞的杀伤功能和明显的旁观者效应。
本研究构建的重组载体分别通过酶切测序鉴定
其序列结构正确 ,从转录、蛋白表达水平鉴定其能在
真核细胞表达并发挥正确功能 ,都证明 pcDNA3. 12
EGFP /HSV1 TK质粒构建成功 ,为下一步研究靶向
非病毒载体介导自杀基因治疗卵巢癌的抗肿瘤机制
和对旁观者效应的影响奠定基础。
参 考 文 献
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本刊启事
　　从 2010年第 1期开始 ,将严格按“编辑作者常用国家标准 ”,对参考文献进行著录。因此
从现在作者来稿时 ,所引用的期刊类参考文献要加注文章题 (篇 )名。具体著录格式如下 :
作者 ,作者. 文章题 (篇 )名. 刊名 ,出版年 ,卷号 (期号 ) :页次.
例 1:朱立煌 ,徐吉臣 ,陈英. 用分子标记定位一个未知的抗稻瘟病基因. 中国科学 (B辑 ) ,
1994, 24: 1408～1502.
例 2: Veluthambi R, Krishnan M , Gould J , et al . Op ines Stimulate Induction of the vir Gene
of the Agrobacterium Tum ifaciens Ti Plasm id . J Bacterol, 1989, 171 (7) : 3696～3703.
其它类参考文献的著录格式等 ,详见本刊稿约 ( http: / / aii. caas. net. cn)。
本刊编辑部
2009年 6月
721