全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
内含肽介导的蛋白连接技术及其应用
赵仲麟1 袁超1 朱伟2 宋晓燕3 李聪1 马斌强1
(1河南农业大学理学院，郑州 450002;2河南农业大学农学院，郑州 450002;3河南农业大学食品科学技术学院，郑州 450002)
摘 要: 内含肽介导的蛋白质剪接是一种自发的翻译后事件，内含肽可介导其自身从前体蛋白上切除，同时将其两侧
的外显肽连接起来。在过去 10 多年中，基于蛋白质剪接原理发展出的蛋白连接技术被广泛的用于蛋白质工程的研究中。这
些技术打破了化学合成方法中对目标物大小的限制，有助于化学和生物学的研究。针对近年由蛋白质连接演化出来的新技
术及其应用做简要的阐述。
关键词: 内含肽 蛋白质剪接 技术 蛋白连接
Applications of Intein-mediated Protein Ligation
Zhao Zhonglin1 Yuan Chao1 Zhu Wei2 Song Xiaoyan3 Li Cong1 Ma Binqiang1
(1College of Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002;2College of Agronomy，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002;
3College of Food Science and Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002)
Abstract: Protein splicing is a naturally occurring posttranslational processing event in which intein performs a molecular act by
cutting itself from the host protein precursor and ligating of the flanking protein regions，termed exteins． In the past decade，novel tech-
niques have been developed to use intein-mediated protein ligation techniques for the production and manipulation of proteins and pep-
tides in protein-engineering research． These new approaches have broken down the size limitation barrier of chemical synthetic method
and helped bridge the fields of chemistry and biology． This article provided a brief review of techniques and their applications underlie
intein-mediated protein ligation．
Key words: Intein Protein splicing Technique Protein ligation
收稿日期:2011-06-03
基金项目:国家水体污染控制与治理科技重大专项资助项目(2009ZX07423-003) ，河南农业大学博士启动项目(30300171)
作者简介:赵仲麟，男，博士，讲师，研究方向:环境微生物及基因工程菌构建与表达;E-mail:gill2015@ hotmail． com
通讯作者:袁超，男，副教授，E-mail:yuanchaobio@ 163． com
内含肽(intein)是类似内含子的蛋白质等价物，
在越来越多的生物体内都发现其存在。内含肽通过
翻译后蛋白剪接过程催化其自身从宿主蛋白上脱离。
内含肽具有内切酶和连接酶活性，这使得内含肽获得
了遗传的灵活性。近来对于内含肽结构和蛋白剪接
机制的研究揭示出了内含肽作用方式，以及内含肽的
起源、传播和进化等［1，2］。内含肽能够进化出很多新
结构和新功能，例如内含肽的转剪接作用。
内含肽是位于蛋白质前体内的插入序列，其两
侧的氨基酸序列称为蛋白质外显肽(extein)。内含
肽的编码序列和外显肽的编码序列共同构成连续的
开放阅读框，经过翻译形成蛋白质前体。在蛋白质
翻译后成熟过程中，内含肽进行自我剪接，以肽键连
接两侧外显肽形成成熟蛋白质，该过程被称之为内
含肽介导的蛋白质剪接(intein-mediated protein spli-
cing) (图 1)［3，4］。基于蛋白质剪接原理发展出多种
蛋白连接技术(intein-mediated protein ligation，IPL)
已用于蛋白质工程和化学生物学研究中。蛋白连接
技术是蛋白质半合成中最重要的技术，而蛋白质半
合成主要是使用基于内含肽技术的合成方法，将化
学合成和生物重组表达的多肽或蛋白质片段进行连
接，得到目标蛋白。传统的化学合成方法对合成物
的大小有限制，不适于合成较大的蛋白质，且对技术
的要求较高。而蛋白质连接技术的出现打破了这一
限制，通过生物学的方法对蛋白质进行合成和其他
操作。
2011 年第 11 期 赵仲麟等:内含肽介导的蛋白连接技术及其应用
图 1 内含肽介导的蛋白质剪切
1 蛋白质纯化
以蛋白质的结构与功能为基础，从分子水平上
认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方
向。研究蛋白质首先要得到高度纯化并具有生物活
性的蛋白质。常用于纯化蛋白质的传统方法有凝胶
过滤和离子交换等，但是这些方法要求操作人员有
较为丰富的经验。亲和层析是一种常用的纯化方
法，具有高效、快速、简便等优点。缺点是亲和标签
可能对目的蛋白产生影响，常需要使用蛋白酶将亲
和标签从目的蛋白上切下，而蛋白酶处理有时特异
性差，且效率较低。
内含肽介导的蛋白质纯化方法可通过亲和层析
的方法得到无亲和标签的蛋白［5 － 7］，剪切能够在不
使用蛋白酶的情况下切断肽键(图 2) ，从而达到去
除标签的目的。Wu等［8］使用内含肽介导的单步纯
化的方法，将几丁质结合域———内含肽融合体作为
亲和标签，在几丁质柱上诱导剪切的发生，纯化得到
人的抗体片段。Zhao 等［9］利用双内含肽的方法对
绿色荧光蛋白(GFP)进行了纯化，得到了无亲和标
签的 GFP，蛋白具有较高的纯度和良好的活性，避免
了纯化过程中内含肽剪切不可控的缺点。最近研究
者发展出一种更加经济、非色谱纯化的方法。以弹
力蛋白样多肽(Elastin-like polypeptide，ELP)与内含
肽连结作为纯化标签，通过改变温度和盐浓度使溶
液中的蛋白可逆沉淀，实现分离，最后通过改变 pH
值诱发内含肽的剪切，将 ELP 从目标蛋白上切
离［10］。该方法可进行大规模的蛋白纯化操作［11］，
有望打破传统的蛋白质纯化方案，具有广泛的应用
前景。
图 2 内含肽介导的蛋白纯化过程
2 毒蛋白生产
某些情况下，如果表达的目的蛋白具有细胞毒
性作用，会导致宿主菌体死亡。此外，蛋白的过量表
达也可能引起胞浆中包涵体的聚集。使用内含肽介
导的连接技术，将目的蛋白与内含肽融合可解决此
类问题。通过连接和重折叠，细胞毒性蛋白可恢复
其天然的构象和生物学活性。具有潜在细胞毒性蛋
白 RNase A就是通过此方法进行表达的［12］。目的
蛋白的一部分表达时在它的 C 端连有一个内含肽，
硫诱导的内含肽剪接可使两个无活性的蛋白片段连
接产生全长的蛋白，在几步复性阶段后重新产生了
酶活性。内含肽介导的蛋白质连接系统既可利用天
然的内含肽，也可利用人造的内含肽，都可很好地合
成细胞毒蛋白。2005 年，Miao 等［13］利用内含肽介
导的方法纯化了内含子编码的 DNA 内切核酸酶毒
蛋白 I-TevI。内含肽介导的蛋白连接方法为产生毒
蛋白提供了新的思路。
3 蛋白质固定化
目前，内含肽介导的蛋白质连接技术已被进一
步发展并用于蛋白质或肽芯片中。可将羧基端生物
素标记的蛋白质附着到有亲和素蛋白涂层的玻璃片
上制作蛋白芯片［14］。同样，大肠杆菌表达的单链抗
体也可被标记，用于芯片筛选中［15］。位点特异性导
向的蛋白固定化技术可保持蛋白的生物学活性，牢
固的亲和素 －生物素偶联物有适用于各种的分析条
件。每一个目标蛋白只与一个生物素标签连接，通
过生物素标签绑定到玻璃片上的亲和素配体上用于
17
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
芯片的定量分析。
此外，也发展出利用低成本的硝酸纤维素制作
肽芯片。利用内含肽介导的蛋白质连接技术，将合
成的肽底物连接到内含肽产生的载体蛋白上，最后
将连接产物固定到低成本的硝酸纤维素上(图 3)。
该方法解决了小肽的底物不易绑定到芯片矩阵上的
难题。普通的合成肽芯片方法是在膜支持物上加入
过量的肽，因此限制了肽的定量化或标准化。而内
含肽生产的载体蛋白，每一个载体蛋白分子对应一
个肽的反应活性位点，所以膜上肽的量可以有效的
被标准化。内含肽介导的肽芯片也被用于抗体的特
性分析、抗原表位扫描及激酶的分析中，灵敏度可提
高 104倍［16］。
图 3 蛋白质固定化用于生物芯片研究
4 分子间蛋白质转剪接研究蛋白质相互
作用
蛋白质相互作用对众多生物学过程的研究，如
受体配体结合、蛋白质多聚体化、基因表达等都较关
键。内含肽介导的剪接同样也被用于蛋白质互作的
研究中，通过使用蛋白质转剪接，内含肽的一部分被
加尾于一个功能蛋白上，当内含肽的两部分相互作
用以后，功能蛋白得到了重组。
Ozawa等［17 － 19］在该原理的基础上，使用劈裂绿
色荧光蛋白和荧光素酶研究蛋白质的相互作用。他
们将 VDE 内含肽 N 端片段与 GFP 的 N 端片段相
连，VDE 内含肽 C 端片段与 GFP 的剩余的片段相
连。这两个融合蛋白分别与目的蛋白 A 和它的靶
蛋白 B 相连。当蛋白 A 和靶蛋白 B 发生相互作用
的时候，VDE内含肽 C端片段和 N端片段同时也在
一个比较接近的空间位置上，此时 VDE内含肽进行
正确的折叠诱导剪接的发生，GFP的 N、C 两个片段
被一个肽键连接，形成荧光团，发出绿色荧光［18］。
通过检测 GFP产生的荧光密度的量，辨别蛋白质相
互作用。劈裂 GFP 和荧光素酶的方法在蛋白质互
作中的优点是，可监测细胞中任意位置的蛋白质互
作，而且数小时内都可以获得信号。
5 IPL技术在生物安全控制中的应用
转基因作物是植物生物技术领域的研究热点，
其中的生物安全性问题引起了人们的重视。转基因
作物的潜在风险是外源基因随花粉传播到相关的植
物中，或是通过种子传播到环境中。Kempe 等［20］将
解淀粉芽孢杆菌的核糖核酸酶基因拆分为 N 和 C
两部分，转入小麦中，通过 DnaB 内含肽的作用将两
部分核糖核酸酶蛋白前体重新组装，完整的蛋白可
在花药发育阶段选择性地破坏植物组织，得到雄性
不育的小麦。
大多数母性遗传农作物的花粉中不含叶绿体
DNA，如果将转入的基因拆分成无活性的两部分，一
部分在叶绿体中表达，另一部分在细胞核中表达，然
后通过内含肽介导的蛋白连接技术使拆分的蛋白恢
复完整的功能。由于随花粉扩散的只是基因的部分
无活性片段，因此可以大大降低转基因扩散的风险。
Dun等［21］利用内含肽技术在烟草中成功恢复了拆
分的荧光假单胞菌 G2 的 5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草
酸-3-磷酸(EPSP)合酶的草甘膦抗性，显示出良好
的生产应用潜力。
6 展望
蛋白质连接技术的出现极大地促进了蛋白质工
程的发展，为人们提供了多种的蛋白质研究手段，不
仅可用于生产目的蛋白或小肽，同时也可用于高通
量筛选和蛋白质定量分析中，可以从一个全新的角
度去理解和研究蛋白质。未来一个新的研究方向是
利用内含肽介导的蛋白连接技术将荧光蛋白或化学
合成的发光分子与目标蛋白连接，用于蛋白质分子
的细胞定位中，或是针对不同的蛋白进行特异性的
标记。多种内含肽的不断发现及其特性的深入研
究，必将为人们提供越来越多精巧的蛋白质研究
27
2011 年第 11 期 赵仲麟等:内含肽介导的蛋白连接技术及其应用
手段。
参 考 文 献
［1］Liu XQ． Protein-splicing intein:Genetic mobility，origin，and evolu-
tion． Annu Rev Genet，2000，34:61-76．
［2］Perler FB． Protein splicing of inteins and hedgehog autoproteolysis:
structure，function，and evolution． Cell，1998，92(1) :1-4．
［3］Paulus H． Protein splicing and related forms of protein autoprocess-
ing． Annu Rev Biochem，2000，69:447-96．
［4］Perler FB，Davis EO，Dean GE，et al． Protein splicing elements:in-
teins and exteins--a definition of terms and recommended nomencla-
ture． Nucleic Acids Res，1994，22(7) :1125-7．
［5］ Gillies AR，Mahmoud RB，Wood DW． PHB-intein-mediated protein
purification strategy． Methods Mol Biol，2009，498:173-83．
［6］Sharma SS，Chong S，Harcum SW． Intein-mediated protein purifica-
tion of fusion proteins expressed under high-cell density conditions in
E． coli． J Biotechnol，2006，125(1) :48-56．
［7］Srinivasa Babu K，Muthukumaran T，Antony A，et al． Single step in-
tein-mediated purification of hGMCSF expressed in salt-inducible E．
coli． Biotechnol Lett，2009，31(5) :659-64．
［8］Wu WY，Miller KD，Coolbaugh M，et al． Intein-mediated one-step
purification of Escherichia coli secreted human antibody fragments．
Protein Expression and Purification，2011，76(2) :221-228．
［9］Zhao Z，Lu W，Dun B，et al． Purification of green fluorescent protein
using a two-intein system． Appl Microbiol Biotechnol，2008，77(5) :
1175-80．
［10］Fong BA，Wu WY，Wood DW． Optimization of ELP-intein mediated
protein purification by salt substitution． Protein Expr Purif，2009，66
(2) :198-202．
［11］ Fong BA，Wood DW． Expression and purification of ELP-intein-
tagged target proteins in high cell density E． coli fermentation． Mi-
crobial Cell Factories，2010，9(1) :77．
［12］Mills KV，Lew BM，Jiang S，et al． Protein splicing in trans by puri-
fied N-and C-terminal fragments of the Mycobacterium tuberculosis
RecA intein． Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(7) :3543-8．
［13］Miao J，Wu W，Spielmann T，et al． Single-step affinity purification
of toxic and non-toxic proteins on a fluidics platform． Lab Chip，
2005，5(3) :248-53．
［14］Lue RY，Chen GYJ，Zhu Q，et al． Site-specific immobilization of bi-
otinylated proteins for protein microarray analysis． Methods Mol Bi-
ol，2004，264:85-100．
［15］Sydor JR，Mariano M，Sideris S，et al． Establishment of intein-medi-
ated protein ligation under denaturing conditions:C-terminal labe-
ling of a single-chain antibody for biochip screening． Bioconjug
Chem，2002，13(4) :707-12．
［16］Sun L，Rush J，Ghosh I，et al． Producing peptide arrays for epitope
mapping by intein-mediated protein ligation． Biotechniques，2004，
37:430-443．
［17］Ozawa T，Takeuchi M，Kaihara A，et al． Protein splicing-based re-
constitution of split green fluorescent protein for monitoring protein-
protein interactions in bacteria:improved sensitivity and reduced
screening time． Anal Chem，2001，73(24) :5866-74．
［18］Kanno A，Ozawa T，Umezawa Y． Intein-mediated reporter gene as-
say for detecting protein-protein interactions in living mammalian
cells． Anal Chem，2006，78(2) :556-60．
［19］Ozawa T，Kaihara A，Sato M，et al． Split luciferase as an optical
probe for detecting protein-protein interactions in mammalian cells
based on protein splicing． Anal Chem，2001，73(11) :2516-2521．
［20］Kempe1 K，Rubtsova M，Gils M． Intein-mediated protein assembly
in transgenic wheat:production of active barnase and acetolactate
synthase from split genes． Plant Biotechnology Journal，2009，7
(3) :283-297．
［21］Dun BQ，Wang XJ，Lu W，et al． Reconstitution of glyphosate resist-
ance from a split 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase
gene in Escherichia coli and transgenic tobacco． Appl Envir Micro-
biol，2007，73(24) :7997-8000．
(责任编辑 马鑫)
37