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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
发育时期和光诱导对拟南芥 AtSUC2 基因表达的影响
肖红 张立军 杜国华 崔震海
(沈阳农业大学生物科学技术学院 辽宁省植物基因工程技术研究中心，沈阳 110866)
摘 要: 蔗糖是高等植物中碳水化合物最主要的转运形式，对于植物的生长发育至关重要。植物体内蔗糖的转运主要
依赖蔗糖转运蛋白，因此对于蔗糖转运蛋白基因的研究具有重要意义。拟南芥蔗糖转运蛋白 AtSUC2 在蔗糖装载中起主要作
用，通过半定量 RT-PCR测定拟南芥叶片不同发育时期和不同光强下 AtSUC2 基因的表达量，研究拟南芥特定发育阶段和光诱
导作用下 AtSUC2 基因表达的影响。结果表明，在野生型拟南芥叶片中，AtSUC2 基因在 16 d幼叶、30 d营养期叶片、生殖期叶
片中均表达，在 16 d幼叶和生殖期叶片中表达强度较弱，在营养生长旺盛时(30 d叶龄)表达较高。同时，植株在暗处理 12 h
时，AtSUC2 基因表达量降低，在强光处理 12 h时，AtSUC2 基因表达量与对照差异不显著，可能 AtSUC2 基因的表达受光诱导
但与光强无关。
关键词: 拟南芥 AtSUC2 基因 蔗糖转运蛋白 半定量 PCR
Effect of Light Induction and Developmental Stages on
Expression of AtSUC2 Gene in Arabidopsis
Xiao Hong Zhang Lijun Du Guohua Cui Zhenhai
(College of Biological Science and Technology，Shenyang Agriculture University，Liaoning
Plant Gene Engineering Research Center，Shenyang 110866)
Abstract: Sucrose is the main transporter of higher plants in the form of carbohydrates，essential for plant growth and develop-
ment． The main transporter in plants dependent on sucrose transporter protein，so the research of sucrose transporter gene is more signifi-
cances． AtSUC2 gene plays a major role in loading the sucrose． This study aims to research the function of light induction and develop-
mental stages of Arabidopsis by measuring the expression of different light intensities and different developmental stages． The results
shows that，the lack of AtSUC2 gene has no impact on seeds bourgeon and the conform of injure tissue． In the wild-type Arabidopsis leav-
es，the expression of AtSUC2 gene is induced by light． The period of vegetative growth(Leaf age 30 d)has high expression． The period of
immature(Leaf age 16 d)has low expression． Meanwhile，the expression of AtSUC2 gene will reduce when they are in dark light(12 h)．
Compared with the normal light(12 h)and strong light(12 h) ，the expression has undistinguished difference． Maybe gene expression At-
SUC2 gene induced by light but independent of light intensity．
Key words: Arabidopsis AtSUC2 gene Sucrose transporter Semi-QRT-PCR
收稿日期:2011-04-08
基金项目:国家自然科学基金项目(30870190) ，国家自然基金青年科学基金项目(31000673)
作者简介:肖红，女，硕士研究生，研究方向:植物基因工程;E-mail:wzshadow@ 163． com
通讯作者:张立军，男，教授，E-mail:lijunzhang8@ yahoo． com． cn
光合作用产生的糖，主要是蔗糖在植物成熟叶
片(源)中合成后，进一步转运到其他组织(库)中，
为植物生长发育提供碳架和能量。在植物体内，蔗
糖的运输依赖于蔗糖转运蛋白(sucrose transporters，
SUTs)［1］。蔗糖转运蛋白(sucrose transporter / sucrose
carrier，SUT /SUC)是质膜上的一个蔗糖转运载体，
它可以与 H + -ATPase 偶联形成质膜电化学势差进
行蔗糖的跨膜转运，在蔗糖的韧皮部装载和从韧皮
部到库组织的卸载过程中都起重要作用［2］。作物
的产量与成熟叶片(源)的光合潜力的大小、果实或
籽粒(库)储存同化物的潜力以及光合产物从源到
库的运输(流)通畅程度有关。要提高作物的产量
2011 年第 7 期 肖红等:发育时期和光诱导对拟南芥 AtSUC2 基因表达的影响
就要做到协调源、库及流三者的关系，即源要足、库
要大、运转要通畅［3，4］。目前，光合产物蔗糖运输的
不畅是作物产量提高受限的重要因素之一。因此研
究蔗糖的运输环节对提高作物产量有着重要的
意义。
目前，已经在 31 种双子叶植物中鉴定出 68 个
蔗糖转运蛋白基因，而仅在 6 种单子叶植物中发现
15 个蔗糖转运蛋白基因。在这 83 个蔗糖转运蛋白
基因中，72 个为完整编码序列［5］。在拟南芥(Arabi-
dopsis)中，蔗糖转运蛋白基因包括 9 个，分别为 At-
SUC1、AtSUC2、AtSUC3、AtSUC4、AtSUC5、AtSUC6、
AtSUC7、AtSUC8 和 AtSUC9。AtSUC2 基因编码的
Atsuc2 蛋白对韧皮部糖的转运是必不可少的［6］。
AtSUC2 基因缺失的突变体植株则表现出发育不良、
糖和淀粉类物质大量积累［7］，在无蔗糖培养基萌发
力弱，即使萌发也是在幼苗阶段停止生长并器官畸
形;加入蔗糖可部分恢复生长，早期加入蔗糖植株可
开花，但不能结实，如蔗糖加入的时期太晚突变体则
无花器官的发育，而拟南芥蔗糖转运蛋白家族的其
他成员基因突变体并未发现有明显的表型变化。据
此认为，AtSUC2 基因是控制拟南芥蔗糖转运的主效
基因［8］。但是 AtSUC2 基因的功能不能被其他转运
蛋白所替代(基因纯合敲出突变体有明显的表现型
变化) ，因此推测 AtSUC2 基因可能是拟南芥中还未
被鉴定出来的蔗糖信号感受器，其主要作用是调节
其他家族成员的转运活性，进而影响植物蔗糖运输
和器官发育，确定其作用和揭示其作用机制，是研究
拟南芥蔗糖运输和分配调节的关键。蔗糖转运蛋白
的表达和活性在转录及翻译水平上是受到严格调控
的。光质、植物激素、发育时期等都是重要的调节因
素，而蔗糖自身也是一种信号分子［9，10］，这种信号分
子不但对其在植物体内的库源关系起调控作用，而
且与果实蔗糖转运蛋白基因的表达也有关系。但
是，蔗糖信号从何时开始，以何种形式作用，以及如
何受到调控，尚不清楚。深入研究蔗糖转运蛋白基
因表达的调控因素，有利于揭示蔗糖转运机制对植
物生长发育的调节功能，为提高作物产量与改良品
质的基因工程研究提供遗传学依据。
我们前期根据拟南芥 AtSUC2基因的启动子及调
节序列用在线软件 http:/ /www-bimas． cit． nih． gov /
cgi-bin /molbio对其进行分析预测，结果发现，At-
SUC2 基因的调节序列具有光诱导因子结合位点
GAAAGAA。但关于不同发育时期、光诱导和不同
光强对 AtSUC2 基因表达的研究鲜见报道。因此研
究拟南芥 AtSUC2 基因在不同发育时期、光诱导和
不同光强的表达，为进一步探索 AtSUC2 基因在拟
南芥蔗糖转运中的作用具有重要意义，也将为转基
因研究中提高转基因植物外源基因的表达提供有益
参考，从而提高植物的产量和品质。
1 材料与方法
1. 1 材料培养
拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型(Columbia-
O型)种子，于 4℃春化 3 d，将春化后的种子播种于
营养土和蛭石 3 ∶ 1 的混合土中，浇透水，封上保鲜
膜，在日光灯下按光 /暗周期为 12 h /12 h，22 － 25℃
培养。
1. 2 不同光强处理
将 30 d 营养期的拟南芥在试验前部分暗处理
12 h、部分正常光照 12 h、部分强光照(光照强度约
为 4 万 lx)12 h。
1. 3 RNA提取和半定量 RT-PCR
1. 3. 1 总 RNA 提取、定量与完整性检测 用 TR-
Izol(Invitrogen，USA)试剂分别提取拟南芥 16 d 幼
叶、30 d营养期叶片、生殖期叶片、30 d 营养期叶片
试验前暗处理 12 h、30 d 营养期叶片试验前正常光
照 12 h、30 d 营养期叶片试验强光照 12 h 的总
RNA。(1)定量:测 260 nm、280 nm 处的吸光值，计
算 A260 /A280的值，估计总 RNA 的纯度，通过 A2的值
分别对不同器官的总 RNA 进行定量。(2)RNA 完
整性的检测:在 1%琼脂糖凝胶上分离总 RNA，若有
3 条清晰无拖尾的带，则说明总 RNA完整。
1. 3. 2 第一条链 cDNA 的合成 取等量不同器官
的总 RNA，用天根试剂盒“1st Strand cDNA Synthesis
Kit for RT- PCR”(Roche，Germany)合成第一链 cD-
NA。
1. 3. 3 Semi-QRT-PCR循环数的确定
1. 3. 3. 1 拟南芥 UBQ10 基因 PCR 循环数的确定
根据拟南芥 UBQ10 基因(GenBank 登录号:
240255761)序列，设计了一对特异性引物:UBQ10 F:
5-GATCTTTGCCGGAAAACAATTGGAGGATGGT-3，
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UBQ10R: 5-CGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGA-
TA-ACAGG-3。PCR扩增采用 50 μL 反应体系，分
别加入等量不同器官的 cDNA 模板，TaKaRa Taq(5
U /μL)0. 25 μL，10 × PCR Buffer(Mg2 + Plus)5 μL，
dNTP Mixture(各 2. 5 mmol /L)4 μL，引物 UBQ10 F
(20 μmol /L)1 μL，引物 UBQ10 R(20 mmol /L)1
μL，加灭菌蒸馏水至 50 μL。PCR反应程序:94℃预
变性 1. 5 min;94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延
伸 1 min，分别设置 20、25、30、30 个循环;72℃延伸
10 min，4℃保存。拟南芥 UBQ10 基因扩增产物长
度为 483 bp。取等体积的 PCR 产物加上样缓冲液
经 1%琼脂糖凝胶电泳，Goldview 染色，经美国伯乐
BIO-RAD GelDoc凝胶电泳成像分析系统照相分析。
1. 3. 3. 2 拟南芥 AtSUC2 基因 PCR 循环数的确定
根据已克隆的拟南芥 AtSUC2 基因(GenBank 登
录号:42562249)序列，结合拟南芥蔗糖转运蛋白基
因家族的同源性分析，设计了一对特异性引物，
SUC2F: 5-GACGCAACCGCAACCGCAGCCTCT-3，
SUC2R:5-TGTTTTAGCGCCGCCGTGATC-3。 PCR
反应体系及反应条件同上，其扩增产物长度约 200
bp。取等体积的 PCR产物加上样缓冲液经 1%琼脂
糖凝胶电泳，Goldview 染色，经美国伯乐 BIO-RAD
GelDoc凝胶电泳成像分析系统照相分析。
1. 3. 4 Semi-QRT-PCR 拟南芥 UBQ10 基因的
PCR扩增采用处于指数期的 25 个循环，其他体系和
条件同上。拟南芥 AtSUC2 基因的 PCR扩增采用处
于指数期的 25 个循环，其他体系和条件同上。
2 结果
2. 1 总 RNA的检测
电泳结果(图 1)表明具有 3 个条带，分别是
28S、18S和 5S，条带清晰无托尾现象，说明提取的总
RNA比较完整，可以用于 Semi-QRT-PCR。
2. 2 AtSUC2 基因在拟南芥叶片不同发育时期中的
表达
半定量 PCR分析原理是通过 PCR 产物来推断
样品中原始模板的量，该技术要求定量一般是在
PCR扩增的指数期进行。PCR 扩增产物的量与循
环数之间有一线性关系。前期的扩增产物量随循环
数的递增而成比例增加，随着 DNA聚合酶活性的下
降和溶液中反应底物的消耗，扩增产物将达到一个
平台。用凝胶成像系统对电泳条带进行光密度分
析，选择循环次数在线性范围内。对这 4 个不同循
环数分析，发现 AtSUC2 和 UBQ10 基因到 25 个循环
时，扩增都在指数增长期，见图 2、图 3。因此，选用
25 个循环来扩增 AtSUC2 和 UBQ10 基因。
1． 16 d叶片总 RNA;2． 30 d叶片总 RNA;3．生殖期叶
片总 RNA;4． 30 d叶片强光照处理总 RNA;5． 30 d叶
片正常处理总 RNA;6． 30 d叶片暗处理总 RNA
图 1 总 RNA电泳结果
图 2 UBQ10 基因产物电泳条带 IOD值的变化趋势
图 3 AtSUC2 基因产物电泳条带 IOD值的变化趋势
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2011 年第 7 期 肖红等:发育时期和光诱导对拟南芥 AtSUC2 基因表达的影响
用 RT-PCR测定拟南芥不同生长阶段 AtSUC2
基因表达量，并对数据进行均一化处理。结果(图
4)显示，AtSUC2 基因在 16 d幼嫩叶片、30 d 营养期
叶片和生殖期叶片中表达量分别为 0. 72、0. 86 和
0. 70，说明均有表达且 30 d营养期叶片中表达量最
高，16 d 幼嫩叶片和生殖期叶片较低，与 16 d 幼嫩
叶片相比表达量高 19. 4%，16 d 幼嫩叶片和生殖期
叶片中的 AtSUC2 基因表达较少。
图 4 拟南芥 AtSUC2 基因在叶片不同发育时期的表达
2. 3 AtSUC2 基因在拟南芥 30 d 叶片不同光照处
理中的表达
与 30 d营养期正常光强叶片相比，暗处理 12 h
叶片 AtSUC2 基因表达量为 0. 73，与对照相比下降
15. 1%，强光照 12 h 叶片 AtSUC2 基因表达量基本
不变(图 5)。
图 5 拟南芥 AtSUC2 基因在叶片不同处理下的表达
3 讨论
3. 1 AtSUC2 基因在拟南芥叶片不同发育时期中的
表达
根据在 GenBank上公布的拟南芥 AtSUC2 基因
cDNA片段(GenBank 登录号:gi:42562249) ，结合分
析拟南芥蔗糖转运蛋白家族其他成员的序列，设计
了针对拟南芥 AtSUC2 基因的特异性引物。选择
UBQ10 基因为内参，采用 UBQ10 基因的特异引物，
通过半定量 RT-PCR 对 AtSUC2 基因在拟南芥叶片
不同发育时期中的表达进行了研究。结果表明，At-
SUC2 基因在拟南芥 16 d幼叶、30 d营养期叶片、生
殖期叶片中均表达，在 16 d幼叶和生殖期叶片中表
达强度较弱，其原因可能是幼叶光合作用弱，生殖期
叶片开始衰老，这两个时期需要装载的蔗糖有限，不
需要 AtSUC2 基因高表达。
3. 2 AtSUC2 基因在拟南芥 30 d 叶片不同光照处
理中的表达
光对于 SUC 基因的转录至关重要，叶片中的蔗
糖转运蛋白能感受环境中的光信号，诱导蔗糖转运蛋
白的表达。根据拟南芥AtSUC2基因的启动子及调节
序列用在线软件 http:/ /www-bimas. cit. nih． gov /cgi-
bin /molbio对其进行分析预测，结果发现，AtSUC2 基
因的调节序列具有光诱导因子结合位点 GAAAGAA。
因此，我们对拟南芥叶片进行暗处理和强光照处理，
分析 AtSUC2 基因的表达，结果表明，该基因在暗处
理 12 h后与强光处理 12 h 相比表达量明显减弱。
可能 AtSUC2 基因的表达受光的诱导，这与蔗糖转
运蛋白基因的表达受光等因素的严格调控［10］的结
果相符。在光照条件下，光可以直接作用于光受体，
提高光合速率并增加碳水化合物的积累，因此 At-
SUC2 基因表达量较暗处理下增强，但本试验结果显
示，AtSUC2 基因表达量与光强无关。
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(责任编辑 马鑫)
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