全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
伪狂犬病基因缺失疫苗的研究进展
凌宗帅 1 郭文龙 2 刘冠华 2 马荣德2 阎振贵 2
( 1 济南出入境检验检疫局,济南 250014; 2 山东农业大学动物科技学院,泰安 271018)
摘 要: 伪狂犬病是由疱疹病毒科伪狂犬病病毒引起的多种畜、禽及野生动物的一种急性传染病。动物感染后表现为
从隐性临床症状到严重的呼吸道和神经症状综合症。该病给世界养猪业造成巨大的损失, 目前预防该病主要是以疫苗接种
为主。综述了当今广泛应用的伪狂犬病基因缺失疫苗的研究现状和进展。
关键词: 伪狂犬病病毒 基因缺失疫苗 进展
The Progress of Genedeleted Vaccine against Pseudorabies V irus
L ing Zongshuai
1 GuoW enlong2 L iu Guanhua2 M a Rongde2 Yan Zhengui2
(
1
J inan Entryex it Insp ection and Quarantine Bureau, J inan 250014; 2Co llege of A nimal Science
and T echnology, Shandong Agriculture University, T aian 271018)
Abstrac:t Pseudo rabies is caused by Pseudo rabies v irus ( PRV ) which is amember o f fam ily herpesv iridae and is the agen t o f a
cute infectious d isease in dom estic and w ild an im als. Infection m ay resu lt in signs rang ing from c lin ica lly inapparen t latent ca rr ie r states
to fa tal resp irato ry tract or neuro log ic disease syn drom es. The virus is responsible form a jor econom ic loss in pig industr ies. Vaccina
tion is one of themost e ffective prophy lacticm easure to prevent the disease. In this assay, research progress o f PRV gene de leted vac
cine that has been used extensive lyw as d iscussed.
Key words: Pseudorabies v irus Genede le ted vaccine P rogress
收稿日期: 20081031
作者简介:凌宗帅 ( 1976) ,男,山东临沭人,兽医学硕士,主要从事动物病毒学研究
通讯作者:闫振贵 ( 1974) ,男,山东莱芜人,讲师,博士研究生,主要从事微生物学与免疫学研究
伪狂犬病 ( pseudorab ies, PR)又称 Aujeszky氏
病,是由疱疹病毒科疱疹病毒亚科疱疹病毒 I型引
起的猪、牛、羊等多种家畜和野生动物以发热、奇痒
及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病 [ 1]。自
1902年匈牙利首次发现该病以来, 该病在世界各地
已广泛流行。在我国自 1984年刘永纯首次报道此
病后, 迄今为止, 已有 20多个省份相继发生该病,给
我国的养猪业特别是集约化养猪造成了巨大经济损
失 [ 2]。由于该病的广泛存在以及易于经空气传播、
存在潜伏感染等特点,给其防制带来了巨大的困难,
疫苗免疫接种则是防制乃至根除该病的主要手段之
一。早期的疫苗大多为弱毒苗和灭活苗, 但是弱毒
苗不能防止病毒在动物体内的复制和排出, 存在毒
力返强和散毒的危险;灭活苗虽然安全性较好,但免
疫效率却较低, 用量较大, 还可能导致注射部位肿
胀,出现过敏反应。因此, 人们在对伪狂犬病病毒分
子生物学深人研究的基础上构建了基因缺失疫苗,
基因缺失疫苗在减少伪狂犬病感染的机会、减轻感
染后的症状、减少散毒量等方面较弱毒苗和灭活苗
都有了很大的改进,也是目前预防控制伪狂犬病的
主要手段 [ 3]。
1 基因缺失疫苗的定义
将病原菌或病毒致病力相关的基因删除后构建
成的活疫苗称之为基因缺失疫苗, 是野毒株发生定
向缺失性突变的活苗。这类疫苗保持了比较完全的
免疫原性,但因其缺少相关毒力基因,对敏感动物致
病力低,同时水平传播几率也较低,或者根本没有致
病性,在动物体内连续传代后也不会恢复毒力。由
于缺少本病原的某些相关成分, 相应免疫群体也没
有对应的抗体,可通过一定的检测技术来识别免疫
群与自然感染群, 有利于养殖企业对本场动物群体
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
的某种疾病的净化,降低成本, 提高效益 [ 4 ]。
该类疫苗中最有代表性的例子是猪伪狂犬病毒
( PRV )糖蛋白 E基因 (原称 gT基因 )缺失 ( gE- )及
胸腺核苷酸激酶基因突变失活 ( TK- )株的活疫苗。
gE和 TK 基因产物的缺失使野毒 PRV的致病性显
著减弱,其免疫力不仅与常规的弱毒苗相当,而且由
于 gE基因的缺失, 使其成为一种标记性疫苗。即
接种该疫苗免疫的猪在产生免疫力的同时不产生抗
gE抗体,而自然感染的带毒猪具有抗 gE抗体。正
是它具有这一特殊的优点, 因此正在实施根除伪狂
犬病计划的欧共体国家, 只允许采用这种 gE-基因
工程 PRV活疫苗, 而不再允许使用常规的 PRV活
疫苗。然而,到目前为止这类疫苗中其它成功的例
子还不多 [ 5]。
2 基因缺失疫苗的研究进展
PRV基因工程缺失疫苗是利用基因工程技术
在 PRV基因组中插人或缺失一段序列致使 PRV的
某些基因不能表达, 从而致弱 PRV, 同时又保持其
较强的免疫原性。其中缺失的主要是其毒力基因胸
苷激酶 ( TK) ,蛋白激酶 ( PK ) , 核苷还原酶 ( RR )和
脱氧尿苷三磷酸激酶 ( dUTPase)以及一些具有免疫
原性的糖蛋白 gG, gE , gC, gD等。目前据此已构
建了多种单基因、双基因及多基因缺失疫苗。
21 第一代基因缺失疫苗
PRV的 TK基因是主要的毒力基因, 对其进行
缺失便成为第一代基因缺失疫苗。TK 基因缺失株
经生物学和动物试验证明对 Balb /c小白鼠有较高
的安全性, 接种猪能产生很强的免疫力并能抵抗
PRV强毒的攻击,而且免疫猪后还可以通过 PCR的
方法将免疫接种猪与自然感染猪区分开来。但是,
由于 TK 基因属于酶蛋白基因, 在体内不能产生其
相应的抗体,因此仅缺失 TK 基因不能用血清学方
法区别开免疫接种猪与自然感染猪, 要将此区别开
来必须缺失相应的糖蛋白基因。此外, 仅缺失 TK
基因的弱毒株对犊牛还有较低的毒力,对狗、猫毒力
更强 [ 6]。
22 第二代基因缺失疫苗
第二代基因缺失疫苗是在 TK缺失疫苗的基础
上发展起来的, 比仅仅 TK缺失的疫苗更加优越。
第一代 TK缺失疫苗只能够采用核酸杂交, 限制性
内切酶图谱,空斑放射自显影同野毒株相区别,第二
代基因缺失疫苗除了在 TK 基因引入了一个缺失
外, 在非编码必需糖蛋白的基因内引入了一个新的
缺失,或插入一个报告基因, 这样得到的突变株就不
能产生被缺失的糖蛋白, 从而免疫动物就不能产生
相应的抗体,且可以通过血清学方法将免疫接种猪
与自然感染野毒的猪相区别, 这也是第二代基因缺
失疫苗的最显著特点。此外,某些糖蛋白的缺失,可
以进一步降低毒力 [ 7]。
23 基因缺乏疫苗的国内研究情况
四川农业大学的郭万柱主持的 猪伪狂犬 (基
因缺失 )活疫苗 ( SA 215株 ) 获得国家新兽药证
书,从而成为我国第 1株动物病毒基因工程疫苗, 试
验研究和大量实际应用效果表明, 该疫苗较常规疫
苗及同类疫苗具有遗传稳定性和安全性好、免疫原
性强和抗潜伏感染能力独特等优点, 达到国际同类
疫苗的应用标准。华中农大的 TK- /gG- /LacZ+已按
新兽药证书的要求, 完成了中试与区域试验。经动
物实验和中试应用证明该产品在产生抗体的时间和
保护效果优于目前的国内外同类产品。该项基因缺
失疫苗和鉴别诊断方法的研究成功, 为当前我国控
制猪伪狂犬病和将来我国消灭此病提供了强有力的
工具 [ 8]。
24 国外应用情况
国外应用较多的基因缺失疫苗还有 N IA3株、
783和 Begonia株等。N IA3株、783疫苗株和 Begon
ia疫苗株是由高毒力和较强免疫原性的 N IA3病毒
株发展而来。首先缺失了 N IA3基因组的独特短序
列中从 gE基因到编码 11 kD蛋白基因约 2 055 bp片
段及两个 IR的大约 100 bp的片段,此突变株在 5溴
脱氧尿营苷 ( bronodeoxyurine)的选择压力下筛选出
TK缺失株,命名为 Begon ia[ 9] ; N IA3株、783疫苗株
则是直接缺失 N IA3毒株 TK 基因中 19 bp的核苷酸
片段。活疫苗之间的效力各不相同,对于血清学阴性
猪或母源抗体猪,攻毒后在降低排毒量和排毒持续时
间方面 783株比 Bartha株更具有优越性 [ 10]。用 783
株免疫的猪中, 有部分攻毒后不排毒。此外,用 783
株对血清学阴性猪免疫 2次后就能阻止试验组中 5
头猪中有 3~ 4头猪不感染攻毒病毒。这表明用 783
株两次免疫能提高猪群的免疫性以阻止病毒在猪与
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猪之间的传播。最近的田间试验表明, 严格使用
N IA3株及 783株多次免疫,能减少感染的进一步扩
散。此外,也有田间试验表明 Begon ia株比 Bartha株
免疫具有母源抗体的动物更能获得成功。
除以上以 TK基因缺失为主的疫苗外,现在还有
以 RR, PK, duTPase等缺失为主的疫苗和突变株。
RR, PK, duTPase与 TK一样,都是 PRV毒力的决定因
素,对这些基因进行失活都可降低 PRV的毒力。例
如,相关研究证明 RR单基因缺失株,以及 RR /gE双
基因缺失株对小鼠和猪都没有毒力,免疫接种猪后排
毒量减少,可产生中和抗体, 并能耐受致死量的强毒
攻击。用 dUTPase缺失的突变株接种猪能抵抗致死
量的 PRV强毒攻击。此外,许多学者还构建了 gM缺
失疫苗以及 US3, UL13, LLT, gP63等基因的缺失突变
株和 gE- /PK- , gG- /gE-等疫苗株。这些缺失突变株
或疫苗对猪的毒力均有所降低,其中一些突变株接种
动物后的散毒量也大为减少,导致潜伏感染的机会也
大大降低,而且使动物能得到较好的保护 [ 11]。
3 基因缺失疫苗的优点及安全性问题
31 优点
多种 PRV缺失弱毒株的构建成功为开发研制
伪狂犬病基因工程疫苗奠定了坚实的基础, 并己用
于伪狂犬病的防制。基因缺失疫苗具有如下的优
点: ( 1)由于 PRV基因缺失疫苗株都缺失了目的
基因的几百甚至几千个碱基, 缺失区域明确, 所以
它们返祖的可能性极小。PRV BUKd13株在专门
筛选 TK +病毒细胞介质中增殖, 没有恢复 TK活
性。 ( 2) PRV基因缺失株都缺失 1个或几个影响
病毒毒力的相关基因, 所以大多数的 PRV基因缺
失株对鼠和猪无毒力或仅有相当低的毒力, 但是,
仅缺失 TK基因的弱毒株对犊牛还有较低的毒力,
而对猫和狗毒力较强, 若同时再缺失 gC或 gE基
因, 则几乎不表现毒力。大多数的 PRV基因缺失
疫苗株都有较强的免疫原性, 免疫动物都获得了
保护。强毒攻击免疫猪不出现临床症状, 猪排毒
时间大大缩短,排毒量大为降低。 ( 3)大多数 PRV
基因缺失疫苗株都不能侵入中枢神经系统或复制
能力大大减弱, 仅能在三叉神经节处复制,但与强毒
株相比,复制水平己大大降低,难以建立潜伏感染。己
证实, PRV弱毒株在三叉神经节的定殖能阻止强毒侵
入中枢神经系统,也使强毒很难在其中潜伏。 ( 4) PRV
基因缺失疫苗株可以以缺失基因编码蛋白作为靶蛋
白,建立敏感而特异的血清学检测方法,通过检测特异
性抗体,将缺失疫苗免疫动物与野毒感染或常规疫苗
免疫动物区分开来,以便对野毒感染动物采取针对性
的防制措施 [ 12]。
32 安全性问题
基因缺失性伪狂犬病病毒疫苗在发达国家己
被批准广泛应用, 但科学家们仍在关注相应返毒
突变或返毒性重组发生的可能性。因为在采用
gE
-突变株作为疫苗实施根除 PRV规划的国家, 一
但 gE-弱毒株再突变为强毒株,将会彻底破坏这一
规划的有效实施。一个理想的安全疫苗, 不仅仅
要对被免疫动物完全无毒力, 而且在自然状况下
应非常稳定,其毒力不会因为回复性突变而返毒,
也不会由与其它疫苗或野毒的重组而修复其毒
力,因此由 TK- gE-双突变或缺失性形成的基因工
程疫苗更能防止由回复性突变或毒株间重组造成
的毒力修复。评定基因工程弱毒疫苗的安全性的
另一个很重要的指标, 就是该疫苗株在免疫动物
群内的传染性。Mu lder等 [ 13 ]在比较研究了各种不
同的基因缺失型 PRV疫苗在猪群内的传染性后,
提出用病毒复制系数 (R值 )来评定基因缺失株病
毒的传染性。当 R 1时, 该病毒能在猪群中传
播, R < 1时,病毒的传播会自然停止。研究发现,
gE基因或 TK 基因缺失株的 R 值分别是 101和
50, 因此仍能在易感猪群中自然传播。而且即使
基因完整的弱毒株也不足以竞争性抑制 gE-突变
株在猪群内的传播。 gE-及 TK-双基因缺失基因
工程 PRV株, 不论是否同时表达猪瘟病毒 E糖蛋
白,其 R值均小于 1, 不会在猪群中传播,因而更为
安全。
4 发展前景
一些国家通过应用 PRV基因缺失疫苗和与之
相配套的血清学鉴别诊断方法正在实施根除猪伪狂
犬病的计划。现行的 PRV基因缺失疫苗多为 gE-
表型,且许多国家只准使用 gE- PRV疫苗, 因此发展
以 gE-为基础的基因缺失疫苗及其配套的鉴别诊断
方法应是今后的发展方向。将 PRV发展为一种基
因转移载体在基因表达、载体疫苗研制、基因投递和
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
基因治疗等多个方而将会有广泛的应用前景。同
时,将 PRV作为一种良好的疫苗载体, 可以研制预
防猪传染病的系列化二价、多价基因工程疫苗。相
信在不久的将来,只有易于被感染相鉴别的疫苗才
可获准上市,用于动物接种,而伪狂犬病重组疫苗正
符合这一趋势。
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