全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2009年第 1期
收稿日期：2008-07-03
作者简介：齐孟文（1956-）,男，副教授，研究方向为核农学
18O 内标质谱法作为一种快速发展的比较定量
蛋白质组学方法，在蛋白质表达调控机理推定及疾
病标志物发现等重要研究领域都极具应用前景。在
该方法中，作为比较的蛋白组在 H218O 中被酶解，酶
解肽段被 1 个或 2 个 18O 原子所标记， 使质量谱移
动 2 个或 4 个 Du。 而作为参照的蛋白质组则在普
通 H2O 中被酶解，然后将两组蛋白质的酶解产物等
量混合， 用质谱法对肽或蛋白质进行相对差别定
量。 常采用的质谱为激光基质解析飞行质谱（MALDI-
TOF-MS）， 在胰蛋白酶肽段的分子分布范围内，其
同位素峰族是可以精确分辨的。 但此时 18O 标记肽
相对于参照肽的同位素峰族仅有 2 个或 4 个 Du 位
移，由于位移相对较小 ，与参照肽的自然同位素峰
族间相互有重叠，相对定量不能直接得出，需要发
展有效的数学解析算法对质谱进行解析。
1 18O标记及其主要特点
基于稳定性同位素标记的定量蛋白质质谱分
析，就标记而言一般可分为以下 3 类 [1]：（1）体内代
谢标记，即通过细胞培养对蛋白质进行标记 ，该方
法是一种转录前无蛋白质歧视的全域性标记过程，
但方法仅限于能够被培养的原核生物体系，对日常
蛋白质定量而言，其试验成本和试验操作分析均不
具有比较优势；（2）体外化学标记，该方法是一种转
化后氨基酸专性标记法，代表方法有同位素亲和标
签法（ICAT）及其后续开发的类似方法 。 蛋白质通
过与标签试剂反应而被标记，该方法通过对含赖氨
酸标记肽的选择分离操作，可明显降低分析样品的
复杂性，然而其局限性是不能标记无赖氨酸或赖氨
酸丰度的低的蛋白质。赖氨酸是蛋白质中丰度较低
的一种氨基酸，在人类蛋白质组适合质谱定性的质
18O内标质谱法比较定量蛋白质组学计量的数学算法
齐孟文
（中国农业大学，北京 100093）
摘 要： 18O内标蛋白质质谱定量分析是一种极具前景的比较蛋白组学研究技术， 虽然该方法与迄今所有内标法
相比有一系列优点， 但是由于其质谱是由 16O未标记品种， 单及双 18O标记品种分子同位素峰簇相互迭加所构成的复杂
谱，定量分析的关键是发展有效的质谱解析算法。 有鉴于此，综述和讨论了 18O内标质谱差异比较蛋白质分析过程中，分
子同位素簇分布的简化计算方法，以及质谱混和谱解析的数学方法。
关键词： 18O内标法 定量蛋白质组学 数学算法
Mathematical Algorithms for Differential Quantitative Proteomics
by Mass Spectrometry Using 18O-labeled Internal Standards
Qi Mengwen
（China Agricultural University，Beijing 100093）
Abstract： Relative quantization of proteins by mass spectrometry using 18O-labeled internal standards is a
promising method for differential quantitative proteomics，having a series of advantages over other stable isotope
labeling. But isotope clusters of 18O-labeled species is overlaps with natural isotope clusters of non-labeled species，thus，
effective algorithm is to be critical to quantitative analysis. Therefore，the mathematical method for analyzing 18O-labeled
peptides was summarized and discussed.
Key words： 18O-labeled internal standards Quantitative proteomics Mathematical algorithms
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
量序列中 （800~2 500 kD），约有 14%不含赖氨酸 ；
（3）体外酶促标记，18O 标记是在胰蛋白酶水解蛋白
质的过程中或过程后， 按一步法或两步法使 H218O
水中的 18O 结合到被酶解的肽段，即肽段 C 段赖氨
酸（K）/精氨酸（R）的羧基上，标记肽的单同位素分
子质量相对移动 2 个或 4 个 Da（结合 1 个 18O 或 2
个 18O）。 相对于上述其它标记法，18O 标记具有如下
优点：（1）18O 酶促标记过程具有高度专一性， 无标
记副产物产生；（2）所有的酶解肽段被标记，都用于
蛋白质定性与定量分析，有利于从数据统计学上提
高分析精度；（3）蛋白质的胰蛋白酶切位点丰度适中，
在现有质谱的质量分析范围对所有蛋白都有合适
的酶解肽段，因此 18O 标记对蛋白质是全域的；（4）
确定的羧基端标记有利于肽序列测定时将 b 型肽
离子与 y 型肽离子相区分；（5）标记操作简单，又因
为可采用两步法标记，可于蛋白质分析过程相机选
定所要标记的肽，具有较大机动性；（6）内标准在样
品准备伊始引入，可有效排除后续制备及分析过程
对差别比较的影响。 以上优势说明，18O 内标质谱法
是一种极具前景的差异比较蛋白质组学研究方法。
2 18O内标法质谱构成解析
18O 内标法蛋白质的肽谱， 每一个肽的同位素
峰族谱都是由未标记肽 、1 个 18O 原子标记和 2 个
18O 标记肽的同位素分布的部分重叠线性迭加而成
的，了解并确定其构成的同位素峰簇分布是进行质
谱解析的基础。
2.1 18O 标记类型及其分布
用胰蛋白酶在 H218O 中酶解蛋白质， 蛋白质被
酶解的同时， 水中的 1 个被 18O 结合到胰蛋白酶肽
段羧基末端的赖氨酸 （K）或精氨酸 （R）的羧基上 ，
形成 1 个 18O 原子标记的肽段，结合到羧基上的 18O
和原有的 16O 原子是共轭的， 此时若继续使酶与肽
接触 ，羧基与水则发生可逆地氧原子交换 ，使第 2
个 18O 被结合上去，形成 2 个 18O 标记的肽 [2]。 标记
的肽依照标记方式 16O，18O1，18O2 呈现为二项式 （a+
b）2 分布， 其中 a 和 b 分别是非完全 18O 富集水中
16O 和 18O 的丰度。因此，未标记 16O 分子、1 个 18O 和
2 个 18O 标记肽分子理论丰度分别为 a2，2ab 和 b2。
试验表明， 实际标记物的 18O 标记类型与理论预测
很好吻合 [3，6]。
2.2 肽质谱的同位素峰簇分布
生物分子中的元素大多均由相应的同位素构
成 ，如 2H （0.0156% ），13C （1.108% ），15N （0.366% ）17O
（0.037%），18O（0.204%），33S（0.75%）和 34S（4.22%），
因此蛋白质或肽段的质谱由同位素峰簇构成。在分
子离子[M+H]+同位素峰簇中，若单同位素分子的质
量记为 M0，依次相距 1 个 Da 的同位素分子记为 Mi
（i=1，2..n）， 则分子的同位素质量分布可以用扩展
的多项式分布描述 [4]。 但一般情况下并不需要求出
所有可能的同位素质量分布项，在质谱解析中一般
仅须考虑前 6~10 个质量峰， 这些峰的累加贡献几
乎接近总分布的百分之百。同位素峰簇分布可按如
下简化法进行近似计算 [5]，结果能很好满足分析精
度的要求。
设分子中氢 （H）、碳 （C）、氮 （N）、氧 （O）和硫
（S）原子的个数用 h，c，n，o，s 表示 ，元素同位素原
子的摩尔分数用 xk 表示 ，即 H 和 2H（x1，x2），12C 和
13C （x12，x13），14N 和 15N （x14，x15），16O，17O 和 18O， （x16，
x17，x18）等 ，则按照概率论计算各同位素分子 Mi 的
概率或同位素峰的相对强度，并 M0 对规一化，有：
M0=x
h
1·xc12·x
n
14·x
o
16·x
s
32 （1）
M1 /M0 =hx2 /1! x1 +cx13 /1! x12 +nx15 /1! x14 +ox17 /1! x16
+sx33 /1! x32 （2）
定义
m1 =
i
Σki （xi1 /xi0 ） （3）
其中，i 代表分子中的某元素，ki 为该元素原子
的个数 ，xi1/xi0 元素 i 的质量+1 的重同位素原子与
普通同位素原子的摩尔数之比，则（2）式简写为
M1/M0=m1/1! （4）
同理有
M2 /M1 =h（h-1）x
2
2 /2! x
2
1 +c（c-1）x
2
13 /2! x
2
12
+n（n-1）x
2
15 /2! x
2
14 +o（o-1）x
2
17 /2! x
2
16
+s（s-1）x
2
33 /2! x
2
32 +hx2 /x1 [cx13 /x12 +nx15 /
x14 +ox17 /x16 +sx33 /x32 ]+cx13 /x12 [nx15 /x14
+ox17 /x16 +sx33 /x32 ]+nx15 /x14 [o17 /o16
+sx33 /x32 ]+ox17 /x16 [sx33 /x32 ]+ox18 /x16
+sx34 /x32 （5）
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2009年第 1期
取近似，h（h-1）≈h2，c（c-1）≈c2 等，且定义
m2 =
i
Σki （xi2 /xi0 ）
=ox18 /x16 +sx34 /x32 （6）
其中 ，xi2/xi0 为元素 i 的质量+2 的重同位素原
子与普通同位素原子的摩尔数之比。采用简化表达
式有
M2 /M0 =m
2
1 /（2!0!+m2 /（0!1!）
=m
2
1 [1/（2!0!）+m2 /m
2
1 /（0!1!）] （7）
同样，若取近似
n-1
i
仪（k-i）≈kn ，则有
M3 /M0 =m
3
1 [1/（3!0!）+m2 /m
2
1 （1!1!）] （8）
和
M4 /M0
=m
4
1 [1/（4!0!）+m2 /m
2
1 （2!1!）+m
2
2 /m
4
1 （0!2!）] （9）
更一般的表达式有
Mn /M0 =m
n
1
n /2
i=0，1，2
Σ（m2 ） i /m2i1 （n-2i）!1! （10）
由公式可见 ，在该近似计算中 ，分子同位素峰
的归一化强度 Mn/M0 只是 m1 和 m2 的函数，计算过
程得以极大的简化。
3 相对比较之肽和蛋白质的定量
在 18O 内标胰蛋白酶解蛋白质的肽谱分析中 ，
特定肽分子的质谱是由未标记品种（16O）和标记品
种，即 1 个 18O 原子（18O1）及 2 个 18O 原子（18O2）肽的
同位素峰簇部分重叠而形成的 1 个更大的同位素
峰簇，其理论分布模式见图 1。 依据其质谱的构成
特点，现有的定量质谱数学解析算法，一般可分为
特征峰标定法和回归分析法两种。
3.1 特征峰标定法 [6]
该方法选择未标记品种、1 个 18O 和 2 个 18O 标
记品种相应的单同位素分子峰作为特征峰，经对其
它非本品种对此特征峰的贡献进行扣除校正，以得
到实际品种（
16
O，
18
O1和
18
O2 ）的强度，即：
16O=[M]-（a×18O1） （11）
18O1=[M+2]-16O·（A2/A0）16 O +（a×
18O1） （12）
18
O2 =[M+4]-
18
O1·（A2 /A0 ）18O1-
16
O（A4 /A0 ）16O （13）
式中，（Ai/A0） 是相应品种离子同位素质量+i 的分
子数与单同位素分子数的比值，可由 2.2 的理论公
式计算求得；a 是标记品种因 H218O 含有 a%H216O 未
能完全标记所引起的修正，因标记效率在肽与肽之
间是变化的，一般以平均估计值给出。 实际计量过
程由测得的混合谱 [M+i]的数据逐次替代可解出各
品种含量，肽或蛋白质的相对定量最终由相应品种
的比值 16O/（18O1+18O2）确定。
3.2 回归分析法 [7，8]
如图 1 所示，混合样品中某肽段的同位素质量
谱是各个品种同一肽段离子同位素峰簇的线性迭
加，假设相互比较品种的含量分别为 C1 和 C2，各自
单独存在时肽段的前 6 个同位素质量峰（累积分布
近似为 100%）的相对强度分别为（a1i）和（a2i），混合
样品肽段的前 6 个同位素峰的相对强度为
（Mi）（Σa1i =1，Σa2i =1 和ΣMi =1），则有：
C1a11+C2a21=（C1+C2）M1
C1a12+C2a22=（C1+C2）M2
…… （14）
C1a16+C2a26=（C1+C2）M6
在上式中，用相对含量 X1=C1/（C1+C2）和 X2=C2/（C1+
C2）作替换，并用矩阵表示：
ATX=M （15）
其中，A=（aij）（2×6）为转换矩阵，可由理论计算或
由实验对各品种单独测定得到，X （２×1）为解矢量和 M
（6×1）为为谱强度矢量。 方程的最小二乘回归解为
X=（AAT）-1AM （16）
转换矩阵可由实验测定或由概率理论计算确
定，一但确定了转换矩阵，由所测定的样品肽段的
同位素峰簇矢量，就可由回归方程解出差异比较肽
的相对含量，进而由各标识肽的统计平均求解差异
比较蛋白的相对含量，确定其相对丰度变化。
图 1 18O 内标质谱法肽的同位素峰簇理论构成
M M+2 M+4 M+6
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4 结语
18O 内标质谱差异分析法是一种极具发展前景
的定量比较蛋白质组学方法，方法学上具有许多无
可比拟的优势， 但是由于 18O 标记分子相对于未标
记分子其质量只有 2 或 4 个 Du 的移动， 而任何分
子的质谱峰实际上都是由同位素峰簇构成的，因此
实际测定的肽段的质谱峰是由两差异比较比较品
种肽段的同位素峰簇按其相对含量的比例线性叠
加而构成的，定量比较结果只有通过对混合谱进行
解析才能得到， 而解析的前提是确定转换矩阵，即
确定各叠加成分分子同位素峰簇的分布及其贡献，
然后才是确定解析的代数方法。该文介绍了计算分
子同位素峰簇分布的简化算法（Benlian Wang，2007），
在该方法中，分子同位素质量峰的归一化强度只是
两个基本参量 m1 和 m2 的函数，而这 2 个参量可由
品种分子的同位素构成方便地求得。该方法的引入
将极大简化分子同位素峰簇分布的计算，且采用的
方法对计算精度几乎没有影响。 此外，介绍了按线
性叠加原理进行混合质谱解析的两种常用的代数
方法。 所述的方法将能为发展 18O 内标质谱法比较
定量蛋白质组学提供理论指导。
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