全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
PQR转运体基因赋予大肠杆菌 BL21百草枯抗性
郭书巧　郑卿　倪万潮
(江苏省农业科学院农业生物技术研究所 农业部华东作物遗传改良与育种重点开放实验室 江苏省农业生物学重点实验室 ,南京 210014)
　　摘 　要 : 　前期研究中成功地分离了 2个对百草枯具有高度抗性的土壤细菌 SPQ03和 SPQ14。本研究从这两个菌分别克
隆了基因 PnPQR和 O aPQR ,二者 ORF全长均为 1 233 bp,编码 410个氨基酸残基 ,含有 11个跨膜区 ( TMS) ,属于非典型的主
要易化超家族 (major facilitator superfam ily, MFS)。立体结构分析表明 ,蛋白的 N端和 C端分别由 5个和 6个由α2螺旋组成的
跨膜区。只有 P151L和 P154V两个氨基酸不同。将两个基因在大肠杆菌 BL21菌株中异源表达 ,能提高大肠杆菌对百草枯的
抗性 ,但不能提高其对过氧化氢的抗性。
关键词 : 　硝化还原假单胞菌 　PQR　转座子 　百草枯 　氧化胁迫
PQR Gene Conferr ing Paraquat Resistance to the
Heterologous Host Escherich ia coli
Guo Shuqiao　Zheng Q ing　N i W anchao
( Institute of B iotechnology, J iangsu Academ y of Agricultural Sciences, Key Laboratory
of Crop Genetic Im provem ent and B reeding in East China, M inistry of Agriculture,
Key Laboratory of J iangsu P rovince for Agrobiology, N anjing 210014)
　　Abs trac t: 　Paraquat is one of the most widely used herbicides in the world. There are 4 strains resistant to PQ. In this research,
transporters PnPQR and O aPQR were cloned from SPQ03 and SPQ14. They respectively encode a 42. 76 kD p rotein with 410 am ino
acids, containing 11 putative transmembrane domains, belongs to no typ ical major facilitator superfam ily. Three2dimensional structure
analysis showed that the p rotein N2term inal and C2term inal, respectively, were constituted 5 and 6 transmembrane domains consisted of
α2helix, but two am ino acids were different in local P151L and P154V. The engineering strain carried PnPQR or O aPQR gene was
transformed into E. coli BL 21, and result showed that PnPQR or O aPQR engineering strains can increase resistance to paraquat, but
it can not imp rove its resistance to hydrogen peroxide.
Key wo rds: 　Pseudom onas n itroreducens　PQR　Transportor　Paraquat　Oxidative stress
收稿日期 : 2009203220
基金项目 :江苏省博士后科研资助计划 ( 0701021B ) ,江苏省农业科学院博士后科研资助计划 ( 005036510701 ) ,国家转基因专项 ( 2008ZX
20080052001)
作者简介 :郭书巧 (19722) ,博士 ,研究方向 :农业生物技术 ; E2mail: guoshuqiao@yahoo. cn, Tel: 025284390618
通讯作者 :倪万潮 (19622) ,硕士 ,研究员 ,研究方向 :植物生物技术 ; E2mail: niwc@ yahoo. cn, Tel: 025284390618　　百草枯 ( 1 , 12二甲基 - 4 , 4′2二氯联吡啶化合物 , PQ )是一种高效非选择性除草剂 ,其主要通过影响绿色植物叶绿体和动物细胞线粒体的电子传递 ,阻断能量转换 ,引起死亡 [ 1 ] 。土壤中含有丰富的微生物资源 ,为了获得对百草枯具有抗性的遗传资源 ,本实验室从 PQ污染的土壤中成功分离了2株高抗 PQ的菌株 SPQ03和 SPQ14,通过一系列鉴定它们分别与硝化还原假单胞菌 ( Pseudom onas n itroreducens)和人苍白杆菌 (O ch robactrum anthropi)最相似 (16S rDNA GenBank登录号分别为 EU500825和 EU622535)。它们能在含强氧化剂 PQ (20 mmol·L21 )或者硝普钠 ( SNP, 200μmol·L21 )的培养基上生长 ,二者都是革兰氏阴性菌 ,好氧 ,非发酵 ,并对多种抗生素具有抗性。本研究从 SPQ03和 SPQ14菌株中分别克隆一个基因 PnPQR和 O aPQR。并对其在大肠杆菌中的表达进行了研究。
2009年第 7期 郭书巧等 : PQR转运体基因赋予大肠杆菌 BL21百草枯抗性
1　材料和方法
111　菌株的培养
菌株 SPQ03和 SPQ14从百草枯污染的土壤中分
离获得 ,保存于江苏省农业科学院生物技术所。将菌
株划线于 LB平板上 , 30℃,培养 48 h后 ,挑单克隆于
牛肉膏蛋白胨培养基中 , 30℃, 200 r/m in,振荡培养至
对数生长期 ,收集菌体 ,用于总 gDNA的提取。E. coli
JM109和 BL21 (DE3)购于 Novagen公司。
112　细菌菌株与质粒
大肠杆菌 ( Escherich ia coli)菌株 JM109和 BL21
由本实验室保存。克隆载体 pMD182T载体购于
TaKaRa公司。原核表达载体 pET32 ( + )由本实验
室保存。
113　目的基因的克隆
以已报道人苍白杆菌 (O chrobactrum anthropi)
PqrA基因 ( GenBank登录号 : AY004224 ) [ 2 ]的核苷
酸序列来预测 SPQ03和 SPQ14中基因序列。根据
预测的基因序列设计一对特异性引物 P1 ( 5′2
CCACTCCGATGTCCAATC23′) 和 P2 ( 5′2TTACCC
GCTCGTCCCTAT23′) ( Invitrogen) ,通过如下 PCR程
序从 SPQ03和 SPQ14中分离目标基因 : 94 ℃预变
性 5 m in; 94 ℃变性 40 s, 56 ℃退火 40 s, 72℃延伸 1
m in,共 30个循环 ;最后 72℃延伸 10 m in。目的条
带经胶回收纯化后 (上海华舜 )连接到 pMD182T载
体中 ,构成 pMD2PnPQR和 pMD2OaPQR载体 ,转化
E. coli JM109,由 Invitrogen公司完成测序。
114　PnPQR和 O aPQR重组菌的获得和抗性分析
利用 DNAMAN 6. 0软件 ,设计特异性引物 R1:
5′2GAAGGATCCTCCACTCCGATGTCCAATC23′和 R2:
5′2CTAGAGCTCTTACCCGCTCGTCCCTAT23′( 5′端含
B am HⅠ酶切位点 , 3′端含 S ac I酶切位点 ) ,分别用
于扩增 PnPQR和 O aPQR的开放阅读框 ORF。PCR
产物经 B am H Ⅰ和 S acⅠ分别双酶切后 ,插入 pET
32a载体中 ,使其与 T7启动子融合。重组载体热击
转化 E. coli BL21 (DE3) ,阳性克隆经酶切和测序验
证 ,获得原核表达载体 pET32a2PnPQR和 pET 32a2
OaPQR。
将含质粒 pET32a、pET32a2PnPQR 和 pET32a2
OaPQR的 E. Coli BL21分别划线于 LB平板上 ,待
长出单克隆后 ,再接种于 LB中震荡培养至 OD600到
0. 4,培养物按照 1% ( v / v)的量接种于含不同浓度
PQ和 H2O2 (0, 0. 5, 1, 2, 3 mmol·L21 )的 LB培养基
后 , 37℃, 200 r/m in震荡培养 2 h,再在培养物中添
加 IPTG(终浓度 1. 0 mmol·L21 )继续培养 ,取接种
后培养的 18 h菌液利用分光光度计 (Beckman DU2
600型 )测量 OD600值。进行统计分析。
115　生物信息学分析
cDNA序列分析采用 DNAMAN 6. 0软件 ;氨基
酸的多序列比对和系统发生树的分析采用 ClustalX
软件 (版本 1. 81)和 Mega (版本 3. 1)程序实现 ;跨膜
区预测采用 TMPRED 程序 ( http: / /www. ch. emb2
net. org / software / TMPRED _ form. htm l)完成 ;蛋白
质的晶体结构信息来源于 B rookhaven p rotein data
bank ( RCSB ) ( http: / / www. rcsb. org) ;利用 ESPri2
p t2. 2 ( http: / / esp rip t. ibcp. fr/ESPrip t/ cgi2bin / ESPri2
p t. cgi)进行二级结构的预测 ;蛋白质的立体结构预
测和观看采用 SW ISS2MODEL ( http: / / swissmodel. ex2
pasy. org/SW ISS2MODEL. htm l ) 和 raswin ( http: / /
www. bbioo. com /Soft/2007 / 710. htm)软件。
图 1　PnPQ R核苷酸及推断的氨基酸序列
2　结果分析
211　PnPQR和 O aPQR基因的克隆与序列分析
根据预测的 DNA 序列设计特异性引物 ,从
SPQ03和 SPQ14 菌株基因组中分离了目标基因
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
PnPQR 和 O aPQR ( GenBank登录号分别为 FJ857934
和 FJ857935)。
两个基因 ORF全长 1 233 bp,编码 410个氨基
酸残基多肽 (图 1) ,分子量为 42. 76 kD ,等电点为
4. 7。ScanProsite程序分析表明 , PnPQR蛋白的 C端
(214～410)含有 11个跨膜区 ( TMS) (图 2) ,属于非
典型的主要易化超家族 (major facilitator superfam i2
ly,MFS) [ 3, 4 ]。除 TMS23和 TMS28由 20个氨基酸组
成外 ,其余 9个 TMS都是由 23个氨基酸组成。
氨基酸的序列对比结果显示 , SPQ03中 PnPQR
和 SPQ14中 OaPQR的一致性为 99% ,二者与来源
于人苍白杆菌的一个百草枯抗性蛋白 PqrA一致为
98%。PnPQR与农杆菌中的两个 ABC型膜转运蛋
白的一致性分别为 98% ( NP _ 356338 ) 和 79%
(AAK89123) ,与根瘤菌中的两个转运体的一致性
分别为 75% (CAC48724)和 73% ( YP_764805)。与
假单胞菌的其它转运体的一致性分别为 46% (NP_
250959和 YP _002086721)、45% ( YP _261195)、43%
( ZP _ 00743972 )、41% ( YP _ 049916 和 YP _
001267198)、39% ( YP _ 001828349 ) 和 37% ( NP _
629981)。进化分析 (图 3)也表明 , PnPQR和 OaPQR
与 PqrA和农杆菌中的两个 ABC型膜转运蛋白的亲
缘关系较近。
图 2　PnPQR推断的氨基酸序列的跨膜区预测
图 3　PnPQR和 OaPQR与其同源蛋白的系统发生分析
212　目的基因编码蛋白的次级结构和立体结构
分析
以大肠杆菌的乳糖透酶 (LacY) ,半乳糖 /H +共
转运体的次级结构和立体结构 ( 2AFQ )为模板 [ 5 ] ,
对 PnPQR 和 OaPQR 进行结构预测发现 ,它们与
LacY的一致性为 11. 8% , PnPQR的立体结构能分
成两个类似的结构域 , N端含有 5个跨膜结构都是
由α2螺旋组成的 ; C端含 6个跨膜结构也由 α2螺
旋 ,二者由 32个氨基酸 (187～218)组成的 Loop环
连接在一起 (图 4)。OaPQR的立体结构与 PnPQR
基本相同。次级结构分析 (图 5)表明 ,这两个蛋白
都是由α2螺旋的跨膜区组成 ,只有 2个氨基酸不
001
2009年第 7期 郭书巧等 : PQR转运体基因赋予大肠杆菌 BL21百草枯抗性
同 , P151V和 P154L,推测其具有转运体的功能。
黑色表示 C端 ,灰色表示 N端
图 4　PnPQR的三维结构图
213　重组菌 pET32a2PnPQR 和 pET32a2OaPQR 的
PQ抗性分析
将 PnPQR和 O aPQR 成功插入到 pET32a载体
中后 , 获得重组菌株 pET32a2PnSoxR 和 pET32a2
OaPQR,将二者与对照菌株 (只含 pET32a空载体 )
一起接种到含有 PQ和 H2 O2 (0、0. 5、1、2、3 mmol·
L21 )的 LB 培养基中 ,并经 IPTG诱导 ,进行统计分
析 ,发现在没有 PQ的培养基上 , 3个菌株的生长没
有明显差异。与 pET32a相比 ,含 pET32a2PnPQR和
pET32a2PnPQR的菌株对不同浓度的 PQ都有抗性
(图 62A ) , 3个菌株对 H2O2 的抗性没有明显差异
(图 62B )。说明 PnPQR 和 OaPQR 能提高 E. coli
BL21对 PQ 的抗性 ,但对 H2O2 的抗性没有明显
影响。
图 6　重组菌 BL21 /pET32a2PnPQR和 BL21 /pET32a2OaPQR在不同浓度的 PQ和 H2O2 培养基上的生长
3　讨论
在原核和真核细胞中 ,都存在着大量转运体 ,如
PrqA、PotE、Em rE、CAT4等 ,它们以能量转运的方式
主动转运并除去 PQ及大多数的其他毒性分子以减
少作用于靶标的药物浓度 [ 6, 7 ]。
大肠杆菌有一个定位于液泡中的膜转运体
PotE,它含有 12个跨膜区 ,其中位于细胞质基质一
侧的 3个谷氨酸直接参与腐胺与鸟氨酸的吸收和转
运 [ 8, 9 ] ;大肠杆菌的另一个多药物转运体 Em rE,只
含 110个氨基酸 ,分子量为 12 kD,具有 4个推断的
跨膜区 ,能赋予大肠杆菌细胞对 PQ和溴化乙锭抗
性 , Em rE蛋白在排出有毒化合物时需要阳离子电
化学梯度的存在而不是 ATP的存在 [ 6 ]。来源于人
苍白杆菌的膜蛋白 PqrA是典型的 Na+ / drug反转运
体家族成员 ,负责多种毒物的转运 ,确保耐性细胞对
有毒化合物的抑制作用 [ 2 ]。Won等 [ 2 ]将来源于人
苍白杆菌染色体 DNA文库的 pqrA基因转化大肠杆
菌提高了大肠杆菌对百草枯的抗性 ,但不能提高对
过氧化氢的性。将人苍白杆菌的 PqrA在烟草中的
过量表达能增强其对百草枯的抗性 [ 10 ] ,说明在原核
生物和真核生物中存在着相似的抗性机制。
由于 PQ能通过腐胺、氨基酸阳离子转运体转
运 ,多胺转运体 PotE在大肠杆菌和酵母等低等生物
中对 PQ的抗性起一定作用。Szigeti[ 11 ]使用数据库
分析 ,在拟南芥基因组中分离到一个类似大肠杆菌
PotE转运体的同源基因 ( EMBOSS程序 ) A tPotE ,它
能被 PQ诱导 ,同时其表达丰度在抗性植株中比敏
感植物中高得多。Su等 [ 12 ]在 PQ抗性植物中还检
测到一个与大肠杆菌 Em rE类似的转运体 CAT4,它
与定位于膜的 H + 2ATP酶亚基同源。选择性转运体
抑制 /恢复试验发现 ,拟南芥氨基酸转运体 CAT4和
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
类似 Em rE蛋白 ,参与百草枯和其它毒性化合物的
胁迫应答 [ 6 ]。就其结构和功能来讲 ,都能参与 PQ
的转运、隔离 ,并在抗性机制中起着重要作用。另外
在玉米幼苗中 ,腐胺能竞争性的抑制 PQ 的吸收。
这暗示多胺转运体对 PQ的吸收起着重要的作用。
使用不同的转运体抑制剂处理 PQ抗性莴苣也观察
到了同样的现象 [ 11 ]。这些研究表明在植物中也存
在类似于细菌的 PQ抗性机制。
本研究从 SPQ03和 SPQ14中都分离到了一个
MFS家族的转运体基因 PQR ,二者氨基酸一致性达
99% ,只有第 4个和第 5个转膜区中间两个氨基酸
的差异 ,而 OaPQR与Won等 [ 2 ]从人苍白杆菌中克
加框部分表示跨膜区 , ▲表示多态
图 5　PnPQR, OaPQR, pqrA及大肠杆菌 LacY ( 2CFQ和 2CFQa)的二级结构比较
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2009年第 7期 郭书巧等 : PQR转运体基因赋予大肠杆菌 BL21百草枯抗性
隆的 pqrA基因的一致性只有 98%。从苍白杆菌属
中分离到的两个基因 pqrA 和 O aPQR 的氨基酸一
致性反而比同一个环境中分离到的不同菌中的这
两个基因的氨基酸一致性要低 ,这暗示不同菌株
对百草枯的抗性形成可能与环境的选择关系比较
大。为了进一步了解这两个基因的功能 ,成功地
构建植物表达载体 ,并进行了烟草和棉花的农杆
菌介导转化。该基因在真核中的表达情况 ,正在
进一步的研究中。
参 考 文 献
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(上接第 97页 )
0. 4∶1,温度 60℃、pH5. 0,酶解 90 m in,蛋白脱除率
可达 91. 8% ; AB 28树脂脱色 ,脱色率为 73. 64% ,多
糖得率为 94. 4% ; 732型阳离子交换树脂和 717型
阴离子交换树脂脱盐 ,脱盐率为 93. 7% ,同时脱色率
50%。红外光谱显示 ,采用该方法提取的多糖与常
规方法提取的多糖成分相同。近年来 ,随着分析水
平的提高 , X2射线纤维衍射、高效凝胶色谱法、圆二
色谱法等在多糖构型分析中应用 ,希望能使用这些
方法对本试验提取的大枣多糖的结构和生理活性进
一步分析 ,以利于指导工业化生产。
与传统的有机溶剂 Sevag、三氯乙酸有机溶剂脱
蛋白工艺有机溶剂回收工作量大 ,易造成环境污染 ,
且多糖的损失率较高相比 ,酶法脱蛋白工艺 ,蛋白脱
除率可达 91. 8% ,反应条件温和 ,多糖损失低 ,无有
机溶剂污染问题 ,易于推广。AB 28树脂脱色结合树
脂脱盐处理 ,弥补了传统双氧水法对多糖稳定性的
显著影响 ,适合大规模工业化生产。
参 考 文 献
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