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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 8期
拟南芥 ERECTA基因的克隆及其对番茄转化
朱锦程
沈海涛
祝建波
(石河子大学农业生物技术重点实验室 石河子大学生命科学院,石河子 832003 )


摘
要:
全球每年因干旱而造成的作物减产和农业产量损失不可计量,因此从分子生物学上探索植物潜在的耐旱机理
对于提高作物抗旱能力具有非凡意义。拟南芥 ( L er型 ) ERECTA基因编码的蛋白存在两个不同的跨膜受体蛋白激酶。通过
RT
PCR的方法从拟南芥基因中克隆出 ERECTA基因, 构建真核表达载体 pB in438
ERECTA, 转化到番茄中,为后续研究其对
植物水分的利用效率奠定基础。
关键词:
拟南芥
番茄
ERECTA基因
转录因子
Arabidopsis ERECTA Gene Cloning and Transferring to Tomato
Zhu Jincheng
Shen H aitao
Zhu J ianbo
(K ey Laboratory of Agriculture B io technology of Shihez i Univer sity, Co llege of Life Science, Shihezi University, Shihez i 832003)


Abstrac:t
D rought is one o f them ost important env ironm ental constra ints lim iting plan t g row th and agr icu ltura l productiv ity, so it
is importan t to unde rstand the underly ing m echan ism of drought to lerance and to identify genes for im prov ing this important tra it. EREC

TA gene encodes a prote in conta in ing 976aa. The fragm ent of ERECTA genew as c loned from A rabidop sis byRT
PCR. A plant express

ing vec to r pB in438
ERECTA w as construc ted. Lea f segm ents o f tom ato we re inoculated byAgrobacter ium tum efaciens GV3101 w ith plas

m id pB in438
ERECTA, and PCR analysis of kanam yc in resistant plants show ed that the gene had been integrated into the genom e o f the
tom ato. Th is study cou ld prov ide the foundation for the utilization o f plant w ater.
Key words:
A rabidop sis
Tom ato
ERECTA gene
T ranscr iption factor
收稿日期: 2010
03
23
基金项目:国家转基因重大专项 ( 2008ZX08005
004) ,兵团博士基金项目 ( 2006 jc07)
作者简介:朱锦程,男,硕士生,研究方向:植物基因工程; E
m ai:l b luerain2068@ s ina. com
通讯作者:祝建波,博士, E
m ai:l zjb sh z@ 126. com
农业作为国民经济的支柱, 其发展状况和水平
备受关注。而干旱对世界农业所造成的危害日益加
剧和突出。研究表明, 干旱对植物的主要影响是生
理脱水,当植物受到外界干旱胁迫诱导的时候,植物
体内与之相关的信号因子含量会发生改变, 信号被
放大, 引起级联效应, 导致植物的组织和细胞的水势
降低, 进而影响植物的各种生理进程 [ 1]。
目前国内外通过转基因提高植物的抗干旱能力
的研究较多,但对于其具体的机制却还有待于进一
步探索。在植物体内与抗旱相关的信号途径繁多,
彼此之间的作用也非常复杂,在我们取得一定抗旱
效果的同时,也应当看到植物本身的变化,这包括各
个器官形态的改变和农作物产量的降低等 [ 2]。其
实植物的抗旱性是一种综合表现结果, 在生态进化
的长河中,各个物种的性能已相对成熟。植物适应
环境,所表现单一性状的突出,是在以消耗其他物质
代谢的基础上产生的,这本身也是植物自我保护的
一种机能。所以在我们强调单个性状的同时, 是否
会影响其自身其它性状的发育, 已成为当前分子育
种抗旱领域的一个重要课题。
ERECTA基因存在于拟南芥 Ler类型当中,
ERECTA基因的开放读码框预计表达 976个氨基
酸, 其编码的蛋白含有亮氨酸富集受体 ( LRR )。分
析 ERECTA氨基酸序列发现, 存在两个不同的跨膜
受体蛋白激酶。这两个疏水区域一个位于 N
末端,
一个介于第 580和第 602的氨基酸之间。现有的研
究表明, ERECTA基因在植物中的过量表达可调节
花序结构并改变其它器官的形态, 表现为果实比较
2010年第 8期 朱锦程等 :拟南芥 ERECTA基因的克隆及其对番茄转化
圆钝, 叶柄较小。同时在分子水平上, LRR的存在
对于细胞与细胞间的信号传导具有重要的作用 [ 3 ]。
但是到目前为止,国内外对于 ERECTA基因编码的
蛋白在植物抗旱节水的功能研究还仅限于拟南芥,
所以 ERECTA基因的表达调控是否也能提高其它
作物的抗旱节水性能,还需要进一步的研究。
1
材料与方法
1. 1
材料
1. 1. 1
拟南芥和番茄
拟南芥 ( Ler型 )种子由石
河子大学农业生物技术重点实验室保存。番茄种子
亚心 87
5,由新疆石河子亚心种业惠赠。
1. 1. 2
菌种和试剂
大肠杆菌 DH5
、农杆菌
GV3101和质粒载体 pB I121, 由本实验室保存。逆
转录酶试剂盒 (M
MLV )、限制性内切酶、T4 DNA连
接酶和 PCR试剂盒, 购自 Fermentas公司; 试剂盒、
W izard DNA C lean
up K it凝胶回收试剂盒购自 Pro

mega公司; M S培养基各成分购自上海生工; T rizol
试剂购自 Inv itrogen公司;其它试剂是国产分析纯。
1. 2
方法
1. 2. 1
拟南芥 RNA的提取及 cDNA的合成
取
0. 2 g拟南芥 ( Ler型 )叶子放入液氮中研磨后, 加入
1 mL Trizo l试剂混匀, 再加入 200
L氯仿,剧烈振
荡混匀 30 s, 离心后提取上清加入等体积异丙醇,离
心后 70%乙醇洗涤两次, 吹干后加入 30
L DEPC

H2O溶解。然后用逆转录酶试剂盒 (M
MLV )合成
cDNA,具体操作参照产品说明书。
1. 2. 2
ERECTA基因的克隆
根据 NCBI数据库
中 A t2g26330基因序列, 利用 Prim er 5. 0软件设计
一对引物。上游引物 5

GGATCCTAAGACTGTGT

GTGAGAAATGG
3
和下游引物 5

GTCGACAACG

CAACGAAAAGATACC
3
。划 线 部 分为 引 入 的
BamH I和 Sa l I酶切位点。以合成的 cDNA为模板
进行 PCR反应, 反应程序: 94
预变性 5 m in, 94

30 s, 55
40 s, 72
3 m in, 共 30个循环, 最后在
72
下延伸 8 m in。 PCR产物经 10 g /L琼脂糖电泳
后用W izard DNA C lean
up K it试剂盒回收,并将回
收的目的条带用 T4 DNA连接酶连到 T
Easy Vector
上,然后用热激法将克隆载体导入大肠杆菌 DH5

中,经蓝白斑筛选、PCR检测、Sca I、X ba I和 Sac I三
酶切鉴定后,再将阳性克隆送到上海生工公司测序,
序列分析结果由分子生物学软件包 V ectorNT辅助
完成。
1. 2. 3
真核表达载体的构建
经测序鉴定正确的
含有 ERECTA基因的 pGM
T
ERECTA重组子, 用
Xba I、Sac I和 Sca I三酶切, 回收目的基因片段。再
将植物表达载体 pB in438用 BamH I和 Sal I双酶
切, 回收大片段。将两者回收的片段进行连接、碱裂
解提取质粒后, 进行 PCR 及酶切鉴定, 构建出
pB in438
ERECTA载体。
1. 2. 4
番茄转化及 PCR检测
大量提取 pB in438

ERECTA质粒并纯化, 用电激转化方法导入农杆菌
GV3101中, 并用菌落 PCR方法鉴定出阳性克隆。
采用叶盘法通过农杆菌介导将 pB in438
ERECTA整
合到番茄基因组中,受侵染的番茄暗培养 (M S+ 0. 1
mg /L IAA (生长素 ) + 2. 0 mg /L 6
BA ( 6
苄氨基嘌
呤 + 100
mo l/L AS) 2 d后, 直接转移到高选择压的
分化培养基 [ M S + 0. 1 mg /L IAA + 2. 0 mg /L 6

BA + 300mg /L C ar(羧苄霉素 ) + 50 mg /L Kana(卡
那霉素 ) ] ,出芽后转到生根培养基 ( 1 /2 M S + 0. 1
mg /L IAA + 300mg /L C ar+ 50mg /L K ana)中,培养
条件是 28
、光照 16 h /d。
剪取约 0. 1 g番茄的叶片, 液氮研磨成粉末状,加
0. 5 mL提取缓冲液 ( T ris
C l 0. 1 mol/L、EDTA
2Na
0
1mo l/L、NaC l 0. 25mo l/L、pH8. 0)和 0. 5 mL 10%
的 SDS, 65
放置 30 m in后离心收集上清液, 然后
用无水乙醇沉淀和 75% (体积分数 )乙醇洗涤 2次,
晾干后再加 0. 3 mL水溶解,静止放置到 4
冰箱内
过夜,使番茄基因缓慢释放到水中,然后取 2
L溶
液为模板进行 PCR检测抗性番茄植株。
2
结果
2. 1
拟南芥 RNA的提取及 ERECTA基因的克隆
利用 RT
PCR技术从拟南芥 cDNA中扩增出约
2 997 bp大小的目标条带 (图 1), 回收目标带并将
它连接到 T
Easy V ector中, 构建出克隆载体。用
Sca I、Xba I和 Sac I三酶切鉴定 (图 2) , PCR鉴定后
将样品送到上海生工公司测序。测序结果经比对,
克隆的 ERECTA基因与 NCB I公布的该基因有很高
的相似度,达到 98. 6%。
103
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 8期
2. 2
pB in438
ERECTA载体的构建
将从 T载体上 S ca I、Sac I和 X ba I三酶切得到
的目的基因 ERECTA连接到经 Xba I /Sac I双酶切
除去 stuff (外源基因插入部位 )的 pB in438上 (图
3)。经 PCR鉴定 (图 4)和 BamH I和 Sal I双酶切
检测 (图 5)后, 成功构建植物表达载体 pB in438

ERECTA。
图 1
ERECTA基因 RT
PCR扩增产物
图 2
pGM
T
ERECTA质粒
Sca I、Xba I和 Sac I酶切
图 3
pB in438质粒简图

+
为阳性对照;


为阴性对照
图 4
pB in438
ERECTA质粒 PCR检测
图 5
pB in438
ERECTA质粒
BamH I和 Sal I双酶切
2. 3
番茄的转化及 RT
PCR检测
用电激转化方法将 pB in438
ERECTA质粒导入
农杆菌 GV3101中, 菌落 PCR鉴定出阳性克隆 (图
6),利用农杆菌通过叶盘法将质粒导入番茄基因组
中,得到 9株番茄再生苗。提取 9株生根番茄植株
叶片 RNA进行 RT
PCR检测 (图 7) ,获得 1个转基
因番茄株系,表明基因已经成功地整合到番茄基因
组中。
104
2010年第 8期 朱锦程等 :拟南芥 ERECTA基因的克隆及其对番茄转化
1- 9.转化农杆菌;
+
为阳性对照;
-
为阴性对照
图 6
GV3101 /pB in438
ERECTA菌落 PCR鉴定
6.转基因植株;
+
为阳性对照;
-
为阴性对照; 10.酶切对照
图 7
转基因番茄植株的 RT
PCR检测
3
讨论
全球正面临着水资源日益短缺的境况, 由干旱
而造成的农作物减产和因此带来的经济损失逐渐加
剧。与传统的抗旱育种工作相比, 基因工程以其特
有的优势,例如不受种属间的限制, 周期短, 效率高
等特点,正得到越来越广泛的研究并起到了积极的
作用。目前对胁迫响应的转录因子的研究已成为植
物耐旱性研究领域的焦点。
植物本身具有保护功能,以往研究表明通过基
因工程技术改良作物而获得个别突出性状是以牺牲
其它性状为代价的。但是最近研究发现拟南芥
NFYB家族转录因子能够提高拟南芥和玉米的耐旱
性 [ 4] ;水稻 NAC型基因在水稻中的过量表达可以提
高其耐旱性 [ 5] ,却不会因为这些基因表达方式的改
变而造成减产,这就为我们从商业角度改良作物耐
旱性提供了可行性前景,因此甑别鉴定新的优秀种子
抗旱基因已成为抗旱育种的瓶颈。番茄是新疆重要的
经济农作物,而新疆的水资源比较匮乏,因此培育出具
有耐旱性的番茄对于新疆的番茄产业具有重大现实
意义。
本研究成功克隆出 ERECTA基因, 并连接到带
有强启动子的 PB in438真核表达载体上,进而将其
整合到番茄的基因组中,获得了转基因植株,为后续
的生理检测奠定了坚实的基础。M asle等 [ 6 ]已经证
实 ERECTA基因可以有效调控拟南芥的蒸腾效率,因
此利用 ERECTA转录因子来改良农作物的抗旱节水性
能,有望获得较为理想的综合效果。
参 考 文 献
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Evolu tionary relat ion sh ips and funct ion s of knox hom eobox genes.
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166.
[ 2] Byrne ME, B arley R, Cu rt isM, et a.l A symm etric leaves 1 m ed iates
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971.
[ 3] Torii KU, M itsukaw a N, Oosum iT, et a.l The A rabid op sis ERECTA
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866
870.
105