全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-03-13
作者简介:孙鏖(1982-),男,硕士,湖南人,主要从事转基因抗旱草坪草研究工作;E-mail:kkkkanty@163.com
通讯作者:易自力,E-mail:yizili889@163.com
干旱对植物组织是一种重要的胁迫因子,它能使细胞膜脂受伤害,从而使丙二醛含量发生改变,也能
干扰植物细胞中活性氧产生与清除之间的平衡,导致植物细胞遭受氧化胁迫[1]。活性氧包括超氧自由基(O2-)、
H202和羟基自由基(-OH)。羟基自由基是最活跃的一种自由基,它会引起膜脂过氧化、蛋白质变性和 DNA
的突变[2]。在正常条件下,植物细胞中产生的活性氧与其清除系统保持平衡,而当环境胁迫长期作用于植
株,产生的活性氧超出了清除系统的能力时,就会引起活性氧累积产生氧化伤害。在活性氧清除酶促反应
系统中,超氧化物歧化酶(SOD酶)活性是决定 02和 H202浓度的唯一酶,是 Habei-weiss反应的底物酶,因此
是保护酶系中的关键酶。环境胁迫下,质膜过氧化程度的改变可反应植物细胞受损伤的程度,丙二醛
(MDA)含量可以作为膜脂过氧化的主要指标。另外,游离脯氨酸(Pro)的积累与否与环境胁迫密切相关[3]。
冷季型草坪草匍匐剪股颖(Agrostisstolonifera)能够产生最美丽、最细致的草坪,但是其抗逆性能在冷
季型草坪草中并不是最好的。因此,利用现代生物技术手段培育出新的抗旱性能好的品种已成为目前植物
遗传资源与品种改良研究的热点。目前,利用转基因技术创建新的抗旱育种材料的研究进展很快,已有一
些抗旱基因在草坪草上转化成功,但由于缺乏对转基因草坪草抗旱性的科学评价,抗旱转基因草坪草尚未
在草坪草抗旱育种工作中得到应用。为此,深入开展转基因草坪草抗旱指标的筛选和评定研究,为开展抗
旱育种提供科学、适用、简便、灵敏的抗旱指标和综合评价方法,尽快把抗旱转基因草坪草应用到生产中去
转NAS基因冷季型草坪草的生长及抗旱性研究
孙鏖 易自力 蒋建雄 陈智勇
(湖南农业大学细胞工程实验室,长沙 410128)
摘 要: 采用盆栽法,在干旱胁迫下,测定转基因草坪草与对照株在不同水分胁迫下的根系活力、脯胺酸含量、叶
绿素含量和SOD酶活性等抗旱生理指标。以期综合评价该转基因草坪草的抗旱性能和所选指标作为筛选抗旱性指标的
可行性。结果表明,转基因草坪草在抗旱性能上普遍优于对照株。同时,SOD酶活性和脯胺酸含量可以作为转基因草坪草
抗旱性鉴定指标;根系活力和叶绿素含量为参考指标。
关键词: 转基因草坪草 抗旱性指标 综合评价
ResearchonGrowthandDroughtResistanceofNAS
TransgenosisOld-SeasonTurfgrass
SunAo YiZiliJiangJianxiong ChenZhiyong
(CelEngineerlabofHunanAgricultureUniversity,Changsha410128)
Abstract: ThepotexperimentwasconductedtostudyonRootsystem activity,Procontent,chlorophylcontent,
SOD activitytoevaluatecomprehensivelythedroughtresistanceoftransgenosisNASgeneturfgrasindiferentstres
andfeasibilityoftheseindexes.Theresultshowedthetransgenosisturfgraswasobviouslybeterthanthecomparedone.
SOD activityandProcontentcouldberegardedasscreeningindex.Rootsystem activityandchlorophylcontentwere
referenceindexes.
Keywords: Transgenosisturfgras Droughtresistance Comprehensiveevaluation
2008年第4期
显得更为重要。
1 材料和方法
1.1 材料来源
试验于 2006年 9月~2007年 4月在湖南省长沙市湖南农业大学生物技术系教学试验基地进行,土质
为红壤土。湖南长沙处于北纬 24°39~30°08,东经 108°47~114°15之间,属大陆型中亚热带季风湿润气
候。年平均气温在 16℃~18℃之间,一年之中,1月最冷,月平均气温一般为 4℃~7℃;7月最热,月平均气温
为 27℃~38℃。无霜期为 261~313d。年平均降水量 1200~1700ml。4%9月降水量约占全年的 65%~70%左
右。相对湿度 82%~84%,日照时数在 1300~1900h之间,年太阳总辐射为 384928~481160J/cm2。冬春盛行
偏北风,夏季多偏南风。试验地表层 15cm经过土壤改良(按体积含细沙 20%、泥炭土 10%、加华草坪专用
复合肥 3%),充分耙松整平,除去杂质,灌水经自然沉降后再精细整平表土作试验用地。
材料由湖南农业大学细胞工程实验室提供。均为转NAS基因匍匐翦股颖21个株系以及2个对照株系。
转基因株系:k.12.16.jk.12.11.ik.10.12.ek.10.12.b
对照株系:ck.11.3
1.2 材料的处理
在每盆中随机采集 3份样品。用水洗净。每个平行做 3次重复。
1.3 测定方法
1.3.1 SOD酶的测定 a.待测液的制备:准确称取 1g样品,加入磷酸缓冲液(PBS,pH7.8),冰浴研磨至匀
浆。4℃,1000r/min离心 15min,取上清备用。b.SOD活性测定:测定方法参见张治安等[5]方法。
1.3.2 游离 Pro提取及含量测定 参见张宪政等[4]的方法。准确称取 0.5g样品,剪碎后放入具塞试管中,
加 5ml3%磺基水杨酸溶液,加塞后在沸水浴中加热 10min,提取清液测定。取清夜 2ml于具塞试管中,加入
2ml水、2ml冰醋酸和 4ml酸性茚三铜试剂,摇匀后在沸水浴中加热显色 60min,取出后冷却至室温,加入
4ml甲苯,充分振荡或摇匀,以萃取红色产物。萃取后再静置使其分层,待完全分层后,吸取甲苯层于分光
光度计 520nm波长处测定吸光度。
1.3.3 根系活力测定 参见李合生等[6]的方法。称取根尖样品 0.5g,放入小烧杯中,加入 0.4%TTC溶液和
磷酸缓冲液(pH7.0)各 5ml,使根充分浸没在溶液内,在 37℃下暗保温 1～2h,此后立即加入 1mol/L硫酸
2ml,以停止反应。称取根尖样品 0.5g,放入小烧杯中,加入 0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液(pH7.0)各 5ml,使
根充分浸没在溶液内,在 37℃下暗保温 1～2h,此后立即加入 1mol/L硫酸 2ml,以停止反应。(与此同时做一
对照实验,先加硫酸,再加根样品,37℃下暗保温后不加硫酸,其溶液浓度、操作步骤同上)。把根取出,用滤
纸吸干水分,放入研钵中,加乙酸乙酯 3～4ml,充分研磨,以提取 TTF。把红色提取液移入刻度试管,并用少
量乙酸乙酯把残渣洗涤 2～3次,皆移入刻度试管,最后加乙酸乙酯使总量为 10ml,用分光光度计在波长
485nm下比色,以空白试验作参比测出吸光度,查标准曲线,即求出 TTC还原量。
1.3.4 叶绿素含量测定 取新鲜叶片样品 0.2g放入研钵中加入 2~3ml95%乙醇研成匀浆再加 10ml乙醇
研磨至组织发白,过滤到 25ml棕色容量瓶并用乙醇冲洗研钵及残渣,定容到 25ml摇匀。将过滤后的叶绿
提色素提取液倒入光径 1cm的比色杯内,以 95%乙醇为空白,再波长 655nm、649nm和 470nm下测定吸光
度,最后按照公式得到叶绿素含量。
1.4 分析方法
用 DPS数据分析系统对生理指标数据进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 SOD酶活性测定
实验同时对转基因株的 5个不同株系和 1个对照株系进行抗旱性检测,在干旱的 1~6d时间内取每天
孙鏖等:转NAS基因冷季型草坪草的生长及抗旱性研究 123
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
(下转第129页)
下午 2点进行 SOD酶检测(图 1)。
通过实验比较发现,转基因株 5个株系所含 SOD酶普遍高与对照株,其中 k.10.12.b号株系所含 SOD
酶最多。其它 4个株系 SOD酶含量相差不大。
2.2 游离 Pro含量测定
实验同时对转基因株的 5个不同株系和 1个对照株系进行抗旱性检测,干旱的 1~6d时间内取每天下
午 2点进行脯氨酸含量测定(图 2)。
图 1 SOD酶含量变化 图 2 脯氨酸含量变化
通过实验比较发现,转基因株系普遍高与对照株,其中转基因株 k.12.16.j号株系所含游离 Pro最多。
2.3 根系活力的测定
对根系活力的测定同样采用干旱 1~6d,取每天下午 2点对其进行测定(图 3)。
由图表可以看出,转基因株系同样普遍高与对照株。所有转基因株系的根系活力没有明显的差别。
2.4 叶绿素含量的测定
在叶绿素含量的测定中同样采用干旱 1~6d,取每天下午 2点对其进行含量测定(图 4)。
图 3 根系活力变化 图 4 叶绿素含量变化
由图可以看出,转基因株系的脯氨酸含量明显高与对照株,而且转基因株系间 k.12.16.j号和 k.10.12.b
号比较接近,k.12.11.i号和 k.10.12.e比较接近。
3 结果与讨论
植物在逆境胁迫下的生理代谢变化一直是逆境生理的研究热点。SOD和 POD活性、MDA和 Pro含量
相互协调,共同反映植物对干旱胁迫的适应能力,是评价植物抗逆性的指标。草坪草抗旱需水研究已经取
得了很大的进展,人们掌握了包括细胞膜透性、蒸散率、过氧化物酶活性、脯氨酸含量变化等抗旱指标的干
旱胁迫变化规律及内源激素对干旱胁迫的生理响应[11]。草坪草为了适应干旱胁迫,通过扩展根系和调节气
孔以御旱,通过渗透调节以耐旱,也可以整体性地具有高水分利用效率[12]。通过其根、茎、叶在形态,生理上
发生适应性变化以达到水分的最大获得与保持[13]。草坪草在不同的生长发育阶段、不同的生理状况、干旱
胁迫作用的不同程度或不同的环境因子的共同作用下可能具有不同的抗旱形式和抗旱途径以及不同的需
水量,总的说来有避旱和抗旱 2种适应性机理[13]。草坪草需水、抗旱机制是多种生理生化综合作用的结果[11]。
目前用植物基因工程技术改良草坪草抗非生物胁迫(干旱、盐胁迫、高温)的研究还很有限。储成才等
124
2008年第4期
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将 NAS基因导入黑麦草,发现转基因植株对干旱和盐胁迫的抗性均显著增强。本实验室也已经将该 NAS
基因导入到匍匐翦股颖,获得了转化植株,并从开展的抗旱性鉴定工作结果看来,转基因植株与对照株并
没有显著性差异,但是转基因植株的抗旱性生理指标数普遍高与对照株,因此说明 NAS基因对于改善植
株的抗旱能力有一定的改善作用。
参考 文献
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争性抑制实验发现一个约 30kD蛋白可能是 HV的又一候选受体。
GSTpul-down技术是在体外检测蛋白之间相互作用的方法之一,生物素-链亲和素系统又为标记和检
测细胞膜蛋白提供了有效的手段。因此,结合这 2种技术可以鉴定与 HV有着直接相互作用的宿主细胞膜
蛋白。汉坦病毒的包膜蛋白为糖蛋白,由 M基因编码、转录并翻译成一个蛋白前体,经过细胞器的转运和
进一步修饰切割后最终以 G1和 G2两个蛋白组分的形式存在,两者均有可能作为病毒入侵细胞的靶蛋白
与宿主细胞膜上的相应受体结合。对 G2蛋白的膜外区完整片段进行了原核表达,结果表明此膜蛋白基本
以包涵体形式存在,上清中含量极少,其原因有待进一步探讨。对该片段进行了不同的截短表达,结果显示
只有 N端 81~140位氨基酸片段在上清中表达量较高。将此片段的融合蛋白作为诱饵,与生物素标记的细
胞膜蛋白进行 GSTpul-down研究,并与对照组相比较,结果表明一个约 30kD的膜蛋白可以特异性与 G2
N端 81~140位氨基酸相结合。该蛋白分子量与 Tae-YeonKim等的研究结果相近,两者是否是同一种蛋白,
还需从氨基酸的序列、结构及功能上加以证实。为 HV可能通过多种途径、多个受体或受体辅助分子入侵
其宿主细胞进一步提供了证据。鉴于病毒包膜糖蛋白在原核细胞中的结构和功能与生理环境下可能存在
差别,GSTpul-down技术本身也存在不足,该蛋白作为病毒的候选受体还需要更直接的证据,并且对该蛋
白的结构性质及功能都需要进一步探讨。
参考 文献
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李青岭等:一个约30kD膜蛋白作为汉坦病毒候选受体的筛选 129