全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
蛋白质复合体非变性凝胶电泳技术及其应用新进展
孟庆石1，2 张光祥1 潘映红2
(1四川师范大学生命科学学院，成都 610101;2中国农业科学院作物科学研究所
国家农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程，北京 100081)
摘 要: 非变性凝胶电泳技术是研究蛋白质复合体的强有力工具。重点介绍了蓝绿温和非变性凝胶电泳(BN-PAGE)
技术的原理和特点，比较了由 BN-PAGE衍生的蓝色温和琼脂糖凝胶电泳、清澈温和非变性凝胶电泳(CN-PAGE)和高分辨清
澈温和非变性凝胶电泳(HrCN-PAGE)技术的差异和适用范围，并概括地介绍了这些技术在植物蛋白质复合体研究中应用的
新进展。
关键词: 蓝绿温和非变性凝胶电泳 蓝绿温和琼脂糖凝胶电泳 清澈温和非变性凝胶电泳 高分辨清澈温和非变性
凝胶电泳 植物蛋白质复合体
The Technology and the Application of Native Polyacrylamide
Gel Electrophoresis in Protein Complex Research
Meng Qingshi1，2 Zhang Guangxiang1 Pan Yinghong2
(1College of Life Sciences，Sichuan Normal University，Chengdu 610101;2The National Key Facility for Crop
Gene Resources and Genetic Improvement，Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural，Beijing 100081)
Abstract: The native polyacrlamide gel electrophoresis is a powerful technique for the study of protein complexes. In this paper，
we compared the technical features，advantages，disadvantages and the scope of application of four native electrophoresises which are
known as blue native polyacrlamide gel electrophoresis(BN-PAGE) ，blue native agarose-acrylamide composite gel electrophoresis，clean
native polyacrlamide gel electrophoresis(CN-PAGE)and high resolution clean native polyacrlamide gel electrophoresis(HrCN-PAGE).
Then we listed the application of this methods in protein complexes research and looked forward to the applications in the plant proteome
research.
Key words: BN-PAGE Blue native agarose-acrylamide composite gel electrophoresis CN-PAGE HrCN-PAGE Plant protein
complex
收稿日期:2010-02-03
基金项目:国家自然科学基金(30971874) ，国家“863”计划项目(2008AA10Z115) ，转基因生物新品种培育科技重大专项(2009ZX08012-011B)
作者简介:孟庆石，男，硕士研究生，从事植物蛋白质组学研究;E-mail:mengas84@ gmail. com
通讯作者:潘映红，男，硕士，研究员，从事植物蛋白质组学研究;E-mail:pyh51@ yahoo. com. cn
张光祥，男，博士，副教授，从事分子生物学研究;E-mail:zhgx-163@ 163. com
在生命过程中多数生理功能并不是由单一蛋
白质独立完成的，而是由一系列的蛋白质以复合
体的形式通过蛋白质与蛋白质之间，或者蛋白质
与基因的相互作用共同完成［1］，如光合作用［2］、细
胞壁生成［3］、激素信号传导［4］和氧化还原反应
等［5］。蛋白质复合体主要分布于细胞膜、胞浆、线
粒体、溶酶体、过氧化物酶体、内质网、细胞核和高
尔基体等不同细胞器或细胞区域中，常以核基质、
剪接体、纺锤体、核孔结构、以及核糖体等功能单
位的形式存在［6］，如线粒体中与呼吸作用相关的
氧化磷酸化复合体［18］。同样，在植物体亚细胞结
构内也存在大量的具有特殊功能的蛋白质复合
体，如在叶绿体内类囊体中的 NAD(P)H 脱氢酶
复合体［7］，与细胞壁合成有关的多糖蛋白质复合
体［8］等。利用非变性技术开展深入研究，可以更
好地了解这些细胞内蛋白质复合体的组成及功
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
能，对研究植物发育、分化、衰老以及抗病、抗逆机
制有着重要的意义。
尽管当前蛋白质分离纯化新技术层出不穷，
但是在非变性条件下分离完整蛋白质复合体依然
面临巨大的挑战［9］。基因组分析结果显示，膜蛋
白约占细胞蛋白质种类的 20% － 30% ［10］，具有强
疏水性和丰度低等特点［11］，而蛋白质复合体主要
由膜蛋白组成，其大小形状、表面电荷、等电点、疏
水性和丰度等各不相同，因此无法建立可适用于
所有的蛋白质复合体分离纯化的通用技术方法。
目前以胶体为介质的基于蛋白质分子电荷和分子
量大小等属性的双向电泳技术(2-DE)在可溶性蛋
白质研究中被广泛使用，但不适用于蛋白质复合
体和膜蛋白分离分析［12］。值得庆兴的是，近几年
逐渐发展起来的蓝绿温和非变性凝胶电泳(blue
native polyacrylamide gel electrophoresis，BN-PAGE)
技术已被成功用于蛋白质复合体分离和纯化，成
为当前研究蛋白质复合体的强有力工具。利用
BN-PAGE 技术，可以得知蛋白质复合体的大小，数
量，复合体组成，相对丰度等理化参数。例如，如
果蛋白质Ⅰ和蛋白质Ⅱ都与蛋白质 A 互作，利用
BN-PAGE 技术可以将蛋白质复合体Ⅰ-A-Ⅱ从蛋
白质复合体Ⅰ-A 和蛋白质复合体Ⅱ-A 中分辨
出来［13，14］。
本研究拟综合评述 BN-PAGE 和由其衍生的清
澈温和非变性凝胶电泳(clean native polyacrylamide
gel electrophoresis，CN-PAGE)与高分辨率清澈温和
非变性凝胶电泳(high-resolution clear native electro-
phoresis，HrCN-PAGE)等非变性电泳技术的原理、特
点和适用范围，并列举上述技术在线粒体、类囊体、
细胞膜、液泡膜等膜系统蛋白质复合体研究中的应
用实例，同时着重介绍该技术在植物蛋白质复合体
研究中应用的新进展。
1 BN-PAGE技术的原理和特点
以常规的非变性凝胶电泳为基础发展起来的
BN-PAGE技术最主要特点是在阴极缓冲液中引入
了考 马 斯 亮 蓝 染 料 (coomassie brilliant blue，
CBB)［13］，在能保持复合体完整性的中性缓冲体系
中分离 100 kD －10 mD大小的蛋白质复合体［13 － 15］。
一般认为自身带负电的考马斯亮蓝染料以约 1∶ 1 的
比率结合在蛋白质复合体的表面使其带上负电［16］。
这样既防止了电泳过程中因缺少去污剂导致的蛋白
质复合体之间的聚集，又因屏蔽了蛋白质复合体的
电荷使复合体在胶体内的迁移率只由分子量决定，
进而提高了非变性凝胶电泳分离的分辨率［14］。同
时考马斯亮蓝可以覆盖蛋白质表面的疏水基团，大
大增加了疏水蛋白质的溶解性［17］。由于考马斯亮
蓝染料能够结合到酸性氨基酸上，使一些碱性蛋白
质如 pI = 10 7 的细胞色素 C 也同样可以在中性缓
冲体系中向阳极迁移［18］。BN-PAGE 电泳体系中
除了引入考马斯亮蓝染料外，还常使用一些其它
试剂来溶解复合体和维持复合体的完整性，如使
用中性去污剂和两性离子 6-氨基己酸增加膜蛋白
复合体的溶解性，使用 2，2-双二羟甲基苯胺(Bis-
Tris)或者咪唑用来维持胶内 pH值在 7 0 － 7 5 之
间等［19］。
BN-PAGE技术的关键在于低盐样品制备、合理
的选择溶解蛋白质复合体的去污剂和电泳操作。综
合相关文献［13，14，20 － 23］以及本实验室的经验，现以小
麦叶片细胞膜蛋白质复合体分析为例，从样品制备，
凝胶制备，上样，染色分析等方面对 BN-PAGE 技术
的关键步骤进行简要描述。
1 1 膜蛋白质复合体的制备
将小麦叶片置液氮充分研磨后用裂解液(Bis-
tris 20 mmol /L，ε-aminocaproic acid 500 mmol /L，
NaCl 20 mmol /L，EDTA 2 mmol /L，Glycerol 10%，
pH7 0)4℃浸泡 5 min，2 000 × g 离心去细胞核和残
渣，10 000 × g离心去叶绿体、线粒体等，100 000 × g
超速离心得细胞膜碎片，预冷裂解液重悬细胞膜后
进行不连续蔗糖密度梯度离心，收集蔗糖浓度
36% －45%间细胞膜碎片并 100 000 × g 超速离心
后得较纯膜碎片，用含 0 5%非离子去污剂 TritonX-
100 的预冷裂解液重悬细胞膜碎片，置 4℃孵育 1 h，
每隔 15 min震荡一次;然后 100 000 × g超速离心除
去膜碎片，取上清于新的预冷离心管中，样品可直接
用于电泳。
1 2 非变性梯度凝胶制备及电泳
用梯度混合仪灌制 4% － 15%的分离胶，上层
再灌 3 5%的浓缩胶，配方见表 1。灌制后在 30℃
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2010 年第 6 期 孟庆石等:蛋白质复合体非变性凝胶电泳技术及其应用新进展
表 1 非变性梯度 BN-PAGE胶的配方
分离胶(4%)分离胶(15%)浓缩胶(3 5%)
3 × BN缓冲液(mL)* 5 5 3
40%丙烯酰胺(mL) 1 5 5 63 0 72
70%甘油(mL) — 4 38 —
水(mL) 8 5 — 5 28
10%APS(μL) 54 42 100
TEMED(μL) 5 4 4 3 10
* 3 × BN缓冲液的组成为 2，2-双二羟甲基苯胺 150 mmol /L，6-氨基
己酸 200 mmol /L，pH7 0
放置 5 h使凝胶充分交联。由于样品不含有甘油
或蔗糖，若先加阴极缓冲液后再上样则不易将样
品加到梳孔中，可用微型注射器缓缓地将样品加
到梳孔底部或者先将样品加到梳孔中再慢慢将阴
极缓冲液(配方见表 2)加入到电泳仪的上槽中，
随后在电泳仪的下槽中加入阳极缓冲液(Bis-tris
50 mmol /L，pH7 0)。电泳条件为浓缩胶分离 150
V，分离胶分离 300 V，4℃。电泳完毕未染色即
可观察到部分高含量蛋白质复合体，经固定后用
银染或考染可进一步分析低含量的蛋白质复
合体。
2 BN-PAGE技术的延伸
自从 BN-PAGE 技术成功应用于线粒体蛋白质
复合体研究后，在其它各种亚细胞蛋白质复合体研
究中也已取得骄人的成绩，然而随着研究工作的进
一步深入，BN-PAGE 也显现出某些弊端，如超大分
子蛋白质复合体无法进入到胶内，CBB 干扰某些标
志酶的活性和荧光标记蛋白质的检测［18，24］等。为
了解决这些问题，在 BN-PAGE 技术的基础上，发展
了蓝色温和琼脂糖-丙烯酰胺混合凝胶电泳(blue n-
ative agarose-acrylamide composite gel electrophore-
sis)、CN-PAGE 及 HrCN-PAGE 等电泳技术，并通过
与等点聚焦或各种变性电泳技术联用，形成了二维
或三维的电泳联合分析技术。当前使用最广泛的是
BN-PAGE，CN-PAGE 和 HrCN-PAGE，这三种非变性
电泳技术的主要区别在于阴极缓冲液的组成不同
(表 2)。
表 2 不同非变性凝胶电泳的阴极缓冲液的组成
BN-PAGE CN-PAGE
HrCN-PAGE
HrCN-PAGE-1 HrCN-PAGE-2 HrCN-PAGE-3
三(羟甲基)甲基甘氨酸(mmol /L) 50 50 50 50 50
2，2-双二羟甲基苯胺(mmol /L) 15 15 15 15 15
十二烷基-β-D-麦芽糖苷(%) — — 0 02 — 0 01
脱氧胆酸钠(%) — — 0 05 0 05 0 05
毛地黄皂苷(%) — — — 0 05 —
考马斯亮蓝(%) 0 02 — — — —
pH 7 0 7 0 7 0 7 0 7 0
2 1 蓝色温和琼脂糖凝胶电泳技术
传统电泳方法分离蛋白质的上限是 1 mD，而
BN-PAGE 可成功分离 1 mD 以上的蛋白质复合
体［25］。Schagger等［20］利用起始浓度为 3%梯度丙
烯酰胺凝胶分离出了线粒体中的丙酮酸脱氢酶
大复合体，并结合 SDS-PAGE 对其组分进行了进
一步的研究。理论上，继续降低丙烯酰胺的浓
度，可以进一步分离研究更大的复合体，但是丙
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
烯酰胺浓度低于 3% 时，很难形成凝胶［26］，因此
发展了蓝色温和琼脂糖凝胶电泳技术［27］。利用
该技术可对分子量大于 10 mD 的信号蛋白质复
合体进行分离，但是在分离丙酮酸脱氢酶大复合
体时 效 果 并 不 很 理 想，产 生 的 条 带 比 较 弥
撒［20，28，29］。另有研究者称，将琼脂糖与丙烯酰胺
按一定比例混合形成混合凝胶后可弥补琼脂糖
凝胶分离效果差的短处，进而可用于蛋白质超复
合体的分离分析［26］。
2 2 CN-PAGE技术
CN-PAGE 技术是一种被公认的用于研究超蛋
白质复合体的电泳技术，已经成功地用于 ATP 合
成酶［30］和叶绿体的寡聚基质蛋白质组［31］的分析。
CN-PAGE 与 BN-PAGE 惟一区别就是在阴极缓冲
液中不含考马斯亮蓝染料，因而蛋白质复合体在
胶体的迁移速率与自身大小和固有电荷有关。由
于 CN-PAGE 不使用考马斯亮蓝染料，只能分离 pI
值小于胶内 pH 值的蛋白质复合体［18］，在电泳过
程中还常出现蛋白质间的聚集拖尾和碱性蛋白
质的丢失现象，但是其优点在于电泳条件更加温
和，可以更好地保持蛋白质复合体的生理状态，
实现胶内催化活性检测［24］和荧光标记蛋白质
检测［18］。
2 3 HrCN-PAGE技术
与 CN-PAGE 相比，HrCN-PAGE 技术原理更接
近 BN-PAGE，即通过在蛋白质复合体表面包裹无色
的中性离子和阴离子去污剂屏蔽蛋白质复合体自身
的电荷，以增大疏水蛋白质的溶解性和减少电泳过
程中蛋白质复合体电荷的影响及蛋白质聚合作
用［15，18，32］。进行 HrCN-PAGE 分离时，一般在阴极
电泳缓冲液中添加阴离子去污剂脱氧胆酸钠(sodi-
um deoxycholate，DOC)和不同的非离子去污剂，根
据非离子去污剂的不同，可以将 HrCN-PAGE 分为
HrCN-PAGE-1、HrCN-PAGE-2、HrCN-PAGE-3 三种
类型(表 1)。十二烷基-β-D-麦芽糖苷(dodecyl-β-
D-maltoside，DDM)可以溶解线粒体 5 种氧化磷酸化
的蛋白质复合体(复合体Ⅰ-V) ，包括 NADH-泛醌
还原酶(复合体Ⅰ)、琥珀酸-泛醌还原酶(复合体
Ⅱ)、泛醇 －细胞色素 C 还原酶(复合体Ⅲ)、细胞
色素 C 氧化酶(复合体Ⅳ)、ATP 合成酶(复合体
Ⅴ)。但是 DDM不能维持一些不太稳定、附着在
呼吸作用超复合体上的疏水性蛋白质间相互作
用［18］。毛地黄皂苷是一种比 DDM 温和的非离子
去污剂，它可以代替 DDM 溶解不稳定的膜蛋白质
复合体，还可以用于一些多聚复合体间的蛋白质-
蛋白质相互作用研究而不要添加任何化学交
联剂［26，33，34］。
2 4 非变性凝胶电泳与其他电泳技术的联用
用非变性电泳技术分离出蛋白质复合体后，
可以直接在胶体内检测某些标志酶的催化活性。
为了进一步研究复合体的组成，往往需要将蛋白
质复合体变性，在变性凝胶电泳中将蛋白质复合
体解离成蛋白质单体，进而产生了很多有别于传
统的双向电泳的二维或三维电泳技术，如 BN-
PAGE /SDS-PAGE［22］，BN-PAGE /BN-PAGE［33］，CN-
PAGE /SDS-PAGE［33］，HrCN-PAGE /SDS-PAGE［34］，
BN-PAGE /Tricine-PAGE［35，36］，BN-PAGE /IEF /SDS-
PAGE［33，37］等。
3 非变性电泳技术在蛋白质复合体研究中
应用的进展
迄今为止，利用 BN-PAGE、CN-PAGE 和 HrCN-
PAGE 非变性电泳技术已成功地用于鉴定蛋白质
间相互作用的稳定性、不同生理状态下蛋白质相
互作用和超分子的组装、分析蛋白质复合体大小
及寡聚状态、标志酶的胶内催化活性、荧光标记蛋
白质胶内检测、蛋白质复合体的纯化等研究［19］。
本用于研究电子传递链和线粒体的呼吸作用蛋白
质复合体的 BN-PAGE 技术现在已经发展到用于
研究水溶性蛋白质［38，39］和其它一些膜系统蛋白质
复合体的试验中。表 3 分类列举了 BN-PAGE、CN-
PAGE 和 HrCN-PAGE3 种非变性凝胶电泳技术在
线粒体、叶绿体、质膜及胞内蛋白质复合体分析中
的一些应用实例。
植物蛋白质组学是蛋白质组学的一个重要分
支，但其发展远落后于医学蛋白质组学的发展。植
物蛋白质组学研究的重点之一是分析与亚细胞结构
和功能相关的蛋白质复合体，目前对叶绿体、线粒体
等细胞器的研究已有一些重要发现，确定了与某些
生物功能相关联的蛋白质复合体［56］。
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2010 年第 6 期 孟庆石等:蛋白质复合体非变性凝胶电泳技术及其应用新进展
表 3 BN-PAGE、CN-PAGE和 HrCN-PAGE电泳技术在蛋白质复合体研究中的应用
物种 细胞器 分析蛋白质 参考文献
BN-PAGE 黄瓜，向日葵，拟南芥，豌豆，小
鼠，水稻
线粒体 O XPHOS Complex Ⅰ-Ⅴsupercomplex Ⅰ +
Ⅲ HSP60 Nucleic acid-binding proteins
［40 － 46］
豌豆，玉米 叶绿体 Tic /Toc supercomplex Ndh complex ［36，43，47］
菠菜
质膜 H + -ATPase Aquaporin V-ATPase syntaxin，
synapsin I Na + /K + ATPase alpha-1
［48］
烟草，小鼠，变铅青链霉菌，大肠
杆菌，酿酒酵母
细胞液 F1F0 ATPase complex NADH dehydrogenase
HSP，20S Proteasome Sucrose synthase
［49 － 51］
CN-PAGE 牛心脏，酵母
线粒体 OXPHOS complexes dehydrogenases ATP syn-
thase dimeric ATP synthase
［13，30，52，53］
玉米
拟南芥
莱茵衣藻
叶绿体 Ndh complex
Oligomeric stromal proteome，Chloroplast-
localized protease complex ClpP
［31，36，54］
希拉细胞 细胞核 nuclear protein complexes ［55］
HrCN-PAGE 牛心脏，人类 线粒体 OXPHOS complexes water-soluble proteins ［18，32］
目前利用非变性电泳技术研究较多的植物蛋白
质复合体来源于不同生理状态下的线粒体，其中一
些工作值得特别重视(表 3)。Juszczuk 等［40］用一维
BN-PAGE技术结合光密度测量技术，研究了在黄瓜
MSC16 突变体和野生型线粒体中蛋白质复合体变
化差异，发现在 MSC16 突变体的根和叶中复合体Ⅰ
的含量低于野生型;超复合体Ⅰ +Ⅲ2含量在 MSC16
突变体叶中低于野生型，但在根中高于野生型。
Sabar等［41］利用 BN-PAGE 技术分离出拟南芥悬浮
细胞线粒体蛋白质复合体，并对其进行胶内组织化
学染色测定其活性，鉴定了一种独特的包含复合体
Ⅳ的超蛋白质复合体。Jansch 等［42］利用 BN-PAGE
技术成功的在拟南芥和马铃薯线粒体中分离到复合
体Ⅰ-Ⅴ、复合体 HSP60、甲酸脱氢酶复合体及其他
酶类复合体。Singh 等［43］利用 BN-PAGE 技术分析
了马铃薯叶片的线粒体内呼吸作用复合体、叶绿体
内的 F1-ATP合成酶、细胞色素 b6f 复合体、光合作
用复合体等。Heazlewood［44］利用 BN-PAGE 技术结
合等点聚焦和 LC-MS 技术分离分析了水稻线粒体
的亲水蛋白质、疏水蛋白质、强酸强碱蛋白质及大分
子蛋白质。由于线粒体含有一系列重要的蛋白质复
合体，遗传或环境因素引起的线粒体蛋白质复合体
变化可导致机体生理功能失调和发育混乱等病理现
象，如营养生长受阻、雄性不育等［57，58］，通过蛋白质
复合体研究，可以进一步了解与线粒体相关的病理
过程。
叶绿体蛋白质复合体是利用非变性电泳技术研
究较多的另一类植物蛋白质复合体，已获得一些较
重要发现(表 3)。Darie 等［36］综合利用 BN-PAGE /
Tricine-PAGE 技术和 CN-PAGE /Tricine-PAGE 技术
研究了玉米叶绿体的 NADH 脱氢酶复合体，在叶肉
和维管鞘内发现一种新的 NADH 的基因(ndh E) ，
并发现 NADH 脱氢酶复合体至少含有 14 个不同的
亚基。Peltier 等［31］利用 CN-PAGE 技术，对拟南芥
叶绿体内的低聚基质蛋白质复合体进行了旁系同源
比对，寻找并鉴定了 241 个差异蛋白质。Chen
等［47］利用蔗糖密度梯度离心技术和 BN-PAGE 技
术，研究了在外源蛋白质进入叶绿体内的过程中位
于叶绿体内膜和外膜移位元件(translocon compo-
nents)蛋白质复合体的变化，并对复合体的组成做
了大致分析。一些位于其他膜系统和非膜植物蛋白
质复合体的研究也已取得了一些可喜的进展，Kjell
16
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
等［48］利用 BN-PAGE技术从菠菜叶片中分离到水通
道蛋白质复合体(约 230 kD) ，H + -ATPase 四聚体和
分子量在 750 kD左右的复合体。Remmerie等［49］利
用 BN-PAGE /SDS-PAGE技术完成了烟草叶片胞内
的 F1F0 三磷酸腺苷酶复合体，NADH 脱氢酶，HSP
复合体，20S蛋白酶体和蔗糖合成酶复合体的分析。
4 结语
BN-PAGE、CN-PAGE 和 HrCN-PAGE 非变性凝
胶电泳技术在蛋白质复合体分离分析中具有不可替
代的作用，越来越受到医学蛋白质复合体研究工作
者的青睐。将这些非变性电泳技术应用于植物蛋白
质复合体研究，尤其是应用于膜系统疏水蛋白质复
合体研究，是植物蛋白质组学工作的一个重要方向。
迄今为止，尽管 BN-PAGE 技术在植物蛋白质复合
体的研究中已发挥了重要作用，但改进的 CN-PAGE
和 HrCN-PAGE技术的应用实例还不多，同时由于
植物材料的一些特殊性，现有的技术方法尚无法完
全满足植物蛋白质复合体研究的需求，有待在样品
的提取制备及电泳分离条件等方面进行进一步完善
优化。
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