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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
广西巴马小型猪血清淀粉样 P物质基因真核
载体构建及细胞转染
杨柳 潘斌 蒋钦杨 覃庆飞 梁家充 兰干球 蒋和生 郭亚芬
(广西大学动物科学技术学院，南宁 530004)
摘 要: 血清淀粉样 P物质(Serum Amyloid Pcomponent，SAP)是一种在进化上高度保守的血清糖蛋白，它可与各种类型
的原纤维结合，在免疫应答和炎症反应等多种免疫疾病中发挥作用。以广西巴马小型猪肝组织总 RNA为模板，利用 RT-PCR
技术扩增出相应 cDNA片段，连接到克隆载体 pMD18-T上进行检测，测序结果为 675 bp，与 GenBank 所提供相关序列同源性
为 100%，并成功构建 pEGFP-N1-SAP重组真核表达载体，利用脂质体(Lipofectamine 2000)介导法将重组质粒导入到 NIH-3T3
细胞中培养，经转染 24 h后，置于倒置荧光显微镜下观察，发现含有重组质粒的 NIH-3T3 细胞中表达出绿色荧光，为进一步研
究 SAP基因的功能特点及在试验动物相关疾病模型的应用提供条件。
关键词: 巴马小型猪 血清淀粉样 P物质 pEGFP-N1 细胞转染
Eukaryotic Vector Construction and Cell Transfection in Bama
Mini-pig Serum Amyloid P Component Gene
Yang Liu Pan Bin Jiang Qinyang Qin Qingfei Liang Jiachong
Lan Ganqiu Jiang Hesheng Guo Yafen
(College of Animal Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530004)
Abstract: Serum Amyloid Pcomponent (SAP)is a kind of seroglycoid which has conserved translation in evolution． SAP link
with various kinds of fibril in order to play effect on immune response，inflammatory reaction and related immune diseases． In our test，
RT-PCR was performed to gene amplification，that cDNA fragment was using the total RNA of Bama Mini-pig liver tissue as a template．
The amplified fragment connected to pMD18-T vector and checked． The sequence result showed 675 bp． The homology was 100%
compared with the sequence GenBank reported about the cloned pig SAP gene． And then successfully constructed the pEGFP-N1-SAP
recombined eukaryotic plasmid． To test its perfect，pEGFP-N1-SAP transfected to NIH-3T3 cells culture by the Lipofectamine 2000．
After 24 hours，the expression of the exogenous gene in cells was analyzed by inverted microscope． The results showed that the NIH-
3T3 cells containing the recombined plasmid presented a green fluorescent． It could be used in next step，research SAP gene function
and set up experimental animal related diseases model operations．
Key words: Bama Mini-pig SAP pEGFP-N1 Cell transfection
收稿日期:2011-09-03
基金项目:广西科技基础条件平台建设项目(09-090-09)
作者简介:杨柳，女，硕士研究生，研究方向:动物遗传育种;E-mail:yangliu321@ 126． com
通讯作者:郭亚芬，女，教授，研究方向:动物遗传育种;E-mail:guoyafen@ 163． com
血清淀粉样 P 物质(Serum Amyloid Pcompo-
nent，SAP)是一种在动物肝脏中大量表达的血清糖
蛋白，与 C 反应蛋白(C-reactive protein，CRP)构成
Ca2 +依赖性配体结合的血清正五聚蛋白家族［1］，在
配体结合、细胞分泌和蛋白折叠等方面均发挥重要
作用，其系统发生学高度保守。
研究表明，SAP可与细胞外淀粉样纤维结合，防
止因蛋白酶作用而使淀粉样纤维被降解。它在免疫
应答和炎症反应、非特异防御、组织结构的维持、与
体内淀粉样沉淀的持续存在以及在阿尔茨海默病
(Alzhemer’s disease，AD)、心血管梗塞、Ⅱ型糖尿
病、获得性和遗传性自身免疫系统缺陷病中起到重
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要作用［2 － 5］。Mahddad等［6］在研究细菌病原和宿主
的免疫应答中发现，SAP 发挥着极其重要的作用;
Bickerstaff等［7］对小鼠的研究也提示 SAP 可以通过
促进 DNA 等自身抗原的有效清除干预系统红斑狼
疮(systemic lupus erythematosus，SLE)疾病的发生。
本研究通过提取 RNA，RT-PCR 克隆出带有酶切位
点的广西巴马小型猪 SAP 基因编码区，旨在构建
pEGFP-N1-SAP真核表达载体，为下一步做基因相
关体外试验或生产转 SAP 基因广西巴马小型猪，构
建广西巴马小型猪 SAP 基因相关疾病模型奠定
基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 材料来源 试验材料来自广西大学巴马小
型猪场的封闭猪群，8 月 － 24 月龄之间，健康生长的
巴马小型猪肝脏组织。
1． 1． 2 载体、质粒及细胞 pMD18-T Vector 选用大连
宝生物(TaKaRa)工程有限公司产品，pEGFP-N1 真核
表达载体、大肠杆菌 DH5α 菌株、培养在 3. 5 cm 的皿
(康宁公司)的汇合度为70% －80%的NIH-3T3细胞株
均为广西大学动物遗传育种实验室保存。
1． 1． 3 酶及主要试剂 M-MLV 反转录酶(Pro-
mega) ;PCR Ex Taq 酶、T4 DNA 连接酶及限制性内
切酶(TaKaRa) ;DEPC、氨苄青霉素、卡那霉素、无水
乙醇、异丙醇均由上海华舜生物工程有限公司生产;
快速 RNA(小量)提取试剂盒与 DNA Marker DS2000
(北京天根) ;微量质粒抽提试剂盒(BioFlux) ;无内
毒素质粒大抽提试剂盒(Omega) ;琼脂糖粉、酵母浸
出物(OXOID) ;Lipofectamine 2000(Invitrogen)。
1． 2 方法
1． 2． 1 样品采集 解剖一头健康仔猪，从其肝组织
处切块取样，用锡箔纸包好放入液氮中保存，待处理。
1． 2． 2 引物设计与合成 参考 GenBank 报道，根
据猪血清淀粉样 P物质基因 mRNA 序列，分析 SAP
编码区序列和 pEGFP-N1质粒多克隆位点上含有的
酶切位点，用软件 Oligo 6 在上、下游分别加入 Hind
Ш和 BamHⅠ 两个酶切位点，设计引物，由上海捷
瑞生物科技有限公司合成引物序列如下:上游引物:
5-AAGCTTATGGATAGGCTGCTGCTTTG-3;下游引
物: 5-GGATCCCGGCTCCACACCCGGGGCTTGA-3
(下划线为酶切位点)。
1． 2． 3 肝组织总 RNA 的提取 总 RNA 的提取按
照上海华舜生物工程有限公司提供的细胞、组织总
RNA提取试剂盒方法进行。
1． 2． 4 SAP基因 RT-PCR 取总 RNA 5 μL，加入 5
× Buffer 5 μL，dNTPs(10 mmol /L)3 μL，RNA 酶抑
制剂(40 U /μL)1 μL，Oligo(dT)18(25 μmol /L)
1 μL，M-MLV 酶(200 U /μL)1 μL、DEPC 处理的
ddH2O 9 μL。反转录(RT)程序:25℃ 10 min，37℃
60 min，95℃ 5 min，取反转录得到的 cDNA 3 μL 为
模板，Primers(25 μmol /L)各 1 μL，Ex Taq 12. 5 μL，
ddH2O 8. 5 μL，进行 PCR反应，反应程序:94℃预变
性 5 min;94℃ 45 s，57. 8℃ 45 s，72℃ 1 mim，35 个
循环;再延伸 72℃ 7 min。将 PCR 产物进行 1%的
琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1． 2． 5 基因克隆与测序 将 PCR产物按照杭州博
日(BioFlux)胶回收试剂盒提供的说明书进行 PCR
产物的回收纯化，纯化后的目的片段的 DNA 与
pMD18-T载体的连接，4℃过夜，转化感受态细菌
DH5α，涂板，过夜培养，挑菌落进行菌液 PCR 鉴定
并抽提阳性菌质粒。送上海生物工程有限公司和北
京捷瑞生物科技有限公司进行测序，－ 20℃保存
样品。
1． 2． 6 目的片段与 pEGFP-N1 载体的连接 用
Hind III 和 BamHⅠ两个限制性内切酶分别对纯化
的 pMD18-SAP 克隆重组质粒和 pEGFP-N1 空载质
粒进行大体系双酶切，回收双酶切产物后纯化，按比
例加入纯化产物和 T4连接酶，4℃过夜，重组连接构
建 pEGFP-N1-SAP真核表达载体。对所得的重组质
粒做转化、筛选及重组质粒的鉴定。将阳性菌送上
海生物工程有限公司和北京捷瑞生物科技有限公司
进行测序，最终确认为 pEGFP-N1-SAP 的重组质粒
用 BamHⅠ酶切，电泳，回收线性化片段，溶于灭菌
的去离子双蒸水中，测定 DNA 浓度(1 ng /μL) ，
－ 20℃保存备用。
1． 2． 7 重组质粒在 NIH-3T3 细胞中的表达 利用
脂质体介导法转染 NIH-3T3 细胞，参照 Lipo-
fectamine 2000 说明书进行操作。具体步骤为将 10
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μL Lipofectamine 2000 与 100 μL 培养液 DMEM 混
匀，室温放置 5 min，随后将 5 μL 重组质粒与 100
μL培养液 DMEM混匀、室温放置孵育 30 min 后加
入洗好的细胞，使混合物均匀覆盖细胞，并置于 5%
CO2培养箱，37℃培养 8 － 24 h，以检测目的基因的
表达量情况。
2 结果
2． 1 巴马小型猪肝组织总 RNA提取
所得 RNA产物经 1%琼脂糖凝胶(DEPC处理)
电泳检测，结果(图 1)显示，含有明显的 28S、18S 及
5S三条带，说明 RNA质量较好，几乎无降解。
图 1 巴马小型猪肝组织总 RNA提取
2． 2 SAP基因编码区 RT-PCR扩增
经 PCR扩增，得到产物长度在 500 － 750 bp 之
间，与预期产物大小 675 bp 较为接近，结果如图 2
所示。
M． Marker DL2000;1，2． SAP PCR产物
图 2 SAP基因编码区 PCR
2． 3 重组质粒 pMD18-SAP PCR及双酶切鉴定
用挑选克隆摇菌，菌液 PCR 鉴定，结果如图 3
所示。
M． Marker DL2000;1，2． pMD18-SAP PCR产物
图 3 pMD18-SAP重组质粒菌液 PCR 鉴定
pMD18-SAP重组质粒用 BamHⅠ和 Hind III 双
酶切，在 1%琼脂糖凝胶电泳后可观察到 3 000 bp
与 600 bp 左右两条带，说明 SAP 基因已插入到
pMD18-T中(图 4)。
M． Marker DL3000;1，2．重组质粒 BamH Ⅰ和 Hind III双酶切电泳
图 4 pMD18-SAP 重组质粒酶切
2． 4 pEGFP-N1-SAP重组质粒的 PCR及双酶切鉴定
以 pEGFP-N1-SAP 重组质粒的菌液为模板，
进行 PCR 扩增，反应产物经 1%琼脂糖凝胶电泳
后，观察到一条长度在 500 － 750 bp 的特异性条
带(图 5)。
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2． 5 pEGFP-N1-SAP重组质粒双酶切鉴定
pEGFP-N1-SAP重组质粒用限制性内切酶 BamH
Ⅰ和 Hind III 消化，在 1%琼脂糖凝胶电泳后可观察到
一条长约 670 bp 和 4 700 bp 的片段，说明 SAP基因
已插入到载体质粒中(图 6)。
M． Marker DL2000;1，2． pEGFP-N1-SAP
质粒的菌液产物
图 5 pEGFP-N1-SAP质粒的菌液 PCR扩增
M． Marker DL5000;1，2． pEGFP-N1-SAP重组质粒
Hind III /BamHⅠ双酶切电泳
图 6 pEGFP-N1-SAP重组质粒双酶切鉴定
2． 6 测序结果
测序结果表明，SAP已经成功插入到 pEGFP-N1
载体中，阅读框正确，序列与 NCBI 上发表的猪的
SAP基因(序列号为 AB005546)对比，未发现碱基
的突变或缺失。比对结果如图 7 所示。将测序结果
与 GenBank 报道的普通猪(Sus crofa)、牛(Bos tar-
urs)、人类(Homo sapiens)的 SAP基因编码序列核苷
酸进行 BLAST 比较，广西巴马小型猪与它们的同
源性分别为100%、83. 9%、80. 5%，证实它们确有较
高的同源性，也说明了 SAP 基因在哺乳动物中具有
较高的保守性，与相关文献报道一致。
2． 7 pEGFP-N1-SAP重组真核表达载体在 NIH-3T3
细胞中的表达
经 NIH-3T3 小鼠胚胎细胞转染筛选，24 h 后在
倒置显微镜下观察，未转染上的细胞细长，呈堆叠性
生长，而转染后的细胞生长较好，细胞质丰富，细胞
明显较大(图 8)。
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Sus，Bama-mini，Bos，Home分别代表普通猪、小型猪、牛和人 SAP基因;·表示相同核苷酸
图 7 SAP基因编码比对图
A．自然光(× 100) ;B．荧光(× 100)
图 8 转染过的 NIH-3T3 细胞
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3 讨论
西北农林科技大学郭云云等［8］，建立了可表达
血清淀粉样 P成分(SAP)转基因小鼠模型。广西巴
马小型猪是广西大学遗传育种实验室经长期封闭选
育而行成的优良试验小型猪品种，由于高度近交繁
育，其遗传学上基因纯合度高，是进行遗传育种研究
和医药生物试验的良好试验动物。本试验从巴马小
型猪肝脏中顺利提取到 SAP基因，表明 SAP基因确
实在脊椎动物的肝组织中大量表达。所得基因序列
与阮志华等［9］所克隆出的编码区比较未再次发现
其中碱基的突变也许是由于所应用的 Ex Taq 酶具
有较高的保真性，也再次说明了巴马小型猪与普通
猪的高度亲缘关系。
4 结论
本试验成功获得广西巴马小型猪 SAP 基因编
码序列的真核表达重组子 pEGFP-N1-SAP，并验证能
在 NIH-3T3 小鼠胚胎细胞中成功表达。为将来进
行基因相关体外试验或生产转 SAP 基因广西巴马
小型猪，构建广西巴马小型猪 SAP 基因相关疾病模
型奠定基础。
参 考 文 献
［1］ Emsley J，White HE，OHara BP，et al． Structure of pentameric
human serum amyloid P component． Nature，1994，367(6461) :
338-345．
［2］吴瑾，熊思东，吴厚生．血清淀粉样 P物质的结构、表达调控及功
能．生命的化学，2001(4) :283-285．
［3］ Urbanyi Z． The role of serum amyloid P (SAP) component in
Alzheimers disease． Neurobiology (Bp) ，1996，4(3) :283-284．
［4］Pepys MB，Dyck RF，de Beer FC，et al． Binding of serum amyloid
P-component (SAP)by amyloid fibrils． Clin Exp Immunol，1979，
38(2) :284-293．
［5］Pepys MB，Baltz ML，de Beer FC，et al． Biology of serum amyloid
P component． Ann N Y Acad Sci，1982，389:286-298．
［6］Malm J，Sonesson A，Hellman J，et al． The pentraxin serum amy-
loid P component is found in the male genital tract and attached to
spermatozoa． Int J Androl，2008，31(5) :508-517．
［7］Bickerstaff MC，Botto M，Hutchinson WL，et al． Serum anyloid P
component controls chromatindegradation and prevents antinuclear
autoimmunity． Nat Med，1999，5(6) :694-697．
［8］郭云云． mSAP 转基因小鼠模型的建立［D］． 杨凌:西北农林科
技大学，2006．
［9］阮志华，兰干球，范晶，等．广西巴马小型猪血清淀粉样 P物质基
因 cDNA的克隆及序列分析．黑龙江畜牧兽医，2011(1) :4-6．
(责任编辑 马鑫)
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