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技术与方法

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 5期
狂犬病毒作为神经示踪剂的研究进展
宋艳 1, 2 李宁 1 黄飞 1 单晶辉 1 张茂林1 段铭1 关振宏 1
( 1吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病研究教育部重点实验室,长春 130062; 2北华大学护理学院,吉林 132011)


摘
要:
狂犬病毒是仅有的完全特异的示踪剂, 因为它能逆向通过化学突触进行神经示踪且不改变神经细胞的代谢,
可以逐级的, 时间依赖的方式感染大量的突触联系的神经网络。根据狂犬病毒的特性解释该病毒作为神经示踪剂的优势,总
结狂犬病毒跨神经进行示踪的方法,并对基因修饰的狂犬病毒的新兴技术进行讨论和展望。
关键词:
狂犬病毒 跨神经示踪 逆向运输
Advances in Rabies Virus Transneuronal Tracing
Song Yan
1, 2
L iN ing
1
Huang Fe i
1
Shan Jinghui
1
ZhangM ao lin
1
Duan M ing
1
Guan Zhenhong
1
(
1
K ey Laboratory of Zoonosis,M inistry of Education, Institute of Zoonosis, J ilin University, Changchun 130062;
2
College of N ursing, Beihua University, Jilin 132011)


Abstrac:t
Rabies v irus is the on ly v ira l tracer that is entirely specific, as itm oves exclusive ly across chem ica l synapses by strictly
unid irec tiona l( retrograde) transneurona l transfer w ithout a lter ing neuronalm e tabolism, a llow ing for the stepw ise, tim e
dependen t, identi

fication o f neuronal ne tw orks across an unlim ited num be r o f synapses. This rev iew w ill h igh light and contrast the d iffe rent properties of
these v ira l tracers, and summ arize the me thodo log ical issues that a re critical for the appropr ia te execution and interpreta tion of trac ing
stud ies. Com binations of v ira l trac ing w ith otherm ethodo log ies w ill be eva luated. Em erg ing techno log ies, based on genetica lly mod ified
rab ies tracers, w ill be also d iscussed and put in perspec tive.
Key words:
Rabies v irus T ransneuronal transfer Retrog rade
收稿日期: 2010
12
14
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30800823)
作者简介:宋艳,女,博士研究生,讲师,主要从事病理和神经方面的研究; E
m ai:l songyanrrr@ 163. com
通讯作者:张茂林,男,博士,副教授,主要从事狂犬病毒和神经方面的研究; E
m ai:l zh rei98@ 163. com
神经示踪剂有两种类型,即常规示踪剂和嗜神
经病毒。常规示踪剂跨神经示踪的能力较弱, 仅能
在部分二级神经元检测到, 不能在三级神经元检测
到。病毒具有自我扩增的能力,能产生较强的神经
示踪能力,很容易被检测到。目前应用较多的示踪
剂是 A lpha疱疹病毒和狂犬病毒, 前者能诱导快速
的神经细胞变性并且能在细胞和细胞间进行传播引
起假阳性的结果,狂犬病毒仅能在连接神经元间进
行传播,无论注射剂量和接种后的时间均不引发神
经变性和假阳性的传播 [ 1]。
利用狂犬病毒, 通过肌肉注射和中枢神经系统
注射研究跨神经示踪技术。当通过肌肉注射接种
时,狂犬病毒仅能通过运动神经元传播到中枢神经
系统是研究运动神经支配的理想的示踪剂 [ 2]。
狂犬病毒有一个较长的无症状期 (潜伏期 ), 人
狂犬病的潜伏期通常是 3周到 3个月之间, 少数能
达到 7年 [ 3 ]。固定的狂犬病毒株, 无症状期可能达
到 1年左右,取决于接种的部位和剂量,病毒至少能
跨 7个突触,这完全满足神经示踪的研究。动物在
试验过程中行为正常,这是狂犬病毒在神经示踪中
的特征之一。
1
狂犬病毒作为神经示踪剂的优势
1
1
狂犬病毒的结构特征
狂犬病毒是一种单股负链的 RNA病毒, 属于弹
性病毒科,狂犬病毒属。电镜下为子弹头样的病毒
颗粒。基因组较小, 编码 5种蛋白, 即核蛋白 ( N )、
基质蛋白 (M )、RNA依赖的 RNA多聚酶 ( L )、磷蛋
白 ( P )和外部的糖蛋白 ( G )。病毒颗粒包含螺旋
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 5期
RNA和 N、L、P蛋白, M蛋白和脂质包膜, 在包膜上
镶嵌成刺突样的糖蛋白。包膜糖蛋白介导狂犬病毒
的黏附和内化, 糖蛋白的 333位基因发生点突变大
大地降低了狂犬病毒的嗜神经性 [ 4]。去除病毒基
因组编码糖蛋白的基因, 病毒不能进行跨神经传
播 [ 5] ,而且减毒株可以通过基因置换或者获得源于
强毒株的糖蛋白恢复嗜神经性。病毒糖蛋白促进病
毒和细胞膜融合,使病毒粒子获得胞内运输的能力。
在成神经瘤细胞,通过应用表达荧光标记的重组病
毒进行示踪,可见狂犬病毒的胞内运输。研究表明,
狂犬病毒的逆向轴浆运输涉及囊泡运输, 携带有包
膜的病毒运输。病毒一到达细胞体, 就在胞浆复
制 [ 6] ,能产生较强的示踪能力。
1
2
狂犬病毒感染不影响神经元细胞的代谢
研究表明, 即使经过较长时间的感染, CVS致
病株也没有引起导致神经损害的形态学的变化:感
染神经元尼氏染色正常, 没有发生细胞凋亡 [ 7 ]。实
际上, 狂犬病毒的毒力与它们诱导细胞凋亡的能力
呈反比。感染的神经元能传递示踪剂, 分泌神经递
质。狂犬病毒的强毒株 (包括用于跨神经示踪的固
定毒株 ) ,感染中枢系统神经元通常引起轻微的细
胞病变 [ 8]。它们运用多种策略避免神经元功能损
伤。首先,狂犬病毒的复制不参与宿主关闭机制 [ 9] ,
病毒基因在宿主中的表达是下调的, 大部分基因表
达上调的时间与出现症状同时发生 (小鼠 6- 7 d)。
其次, 狂犬病毒强毒株通过干扰凋亡前因子能防止
感染神经元的凋亡 (程序性的细胞死亡 )。它们也
能影响免疫系统,阻断感染的神经元干扰素的信号
转导 [ 10] ,通过过度表达破坏免疫的因子防止保护性
的 T淋巴细胞进入中枢神经系统发挥作用 [ 11 ]。因
此,狂犬病毒强毒株的干扰作用解释了感染较长时
间也没有出现神经损害的原因。
1
3
狂犬病毒逆向跨神经示踪
狂犬病毒传播只通过逆向跨神经转移。脑内注
射是一个极好的例子, 它们给顺向和逆向轴浆运输
提供了平等的机会 (事实上, 通过脑内注射, 大部分
示踪剂是通过双向运输的 )。值得注意的是, 狂犬
病毒从注射的皮质区逆向跨神经示踪已经进展到三
级神经元, 没有发现顺向跨神经转移的证据 (例如
脑桥区和基底神经节 )狂犬病毒作为示踪剂严格单
向转移有明显的优势,它能明确的鉴别注射靶位多
突触的输入。
1
4
狂犬病毒感染缺乏局部传播或者缺乏过路纤
维的摄入
即使在狂犬病毒长期感染的情况下, 狂犬病毒
也不能引起假阳性的传播或者被过路纤维摄入。而
且, 不能发生电突触的传播: 尽管球海绵体肌运动神
经元通过缝隙连接相互连接, 但是感染的球海绵体
肌运动神经元的数量不随时间而增加,表明缝隙连
接不能传播狂犬病毒 [ 20]。
2
狂犬病毒作为神经示踪剂的研究方法和研究
现状
2
1
狂犬病毒和神经递质或细胞标记的结合
当使用识别狂犬病毒磷蛋白的单克隆抗体作为
一抗的免疫化学试验表明, 狂犬病毒跨神经示踪呈
现高尔基样的,揭示标记神经元的最纤细的结构,包
括树突。将同一个切片常规结合狂犬病毒免疫过氧
化物酶标记和结晶紫复染,没有背景染色。
狂犬病毒免疫标记结合神经递质的免疫化学标
记是可行的,因为感染的神经元在一段时间保持代
谢活力。联合应用狂犬病毒跨神经示踪剂和神经递
质或者细胞标记进行双重免疫荧光试验已经被验
证, 包括联合狂犬病毒和胆碱乙酰转移酶 (用来作
为运动神经元和自主节前神经元的标志 ), 催产素,
钙结合蛋白,鼠骨肌钙蛋白, 多效蛋白和一氧化氮合
成酶的神经元的形式。另一个可能性是结合狂犬病
毒逆向跨神经示踪和顺向示踪技术 [ 21]。
2
2
混合狂犬病毒和霍乱毒素 B片段: 能精确界
定注射区,同时鉴别一级神经元和高级神经元
当肌肉注射狂犬病毒后, 狂犬病毒免疫标记能
容易鉴别注射区。相反, 将狂犬病毒注射到中枢神
经系统,狂犬病毒进行跨神经示踪,精确地界定注射
区是不容易的。因为狂犬病毒不引起组织损伤, 不
标记胶质细胞,不能积累在注射位点,不像某些常规
的示踪剂和疱疹病毒。这样, 仅能通过标记神经元
的密度梯度估计注射位点。
通过结合狂犬病毒和常规的示踪剂能够界定注
射位点,这个示踪剂不能影响病毒的摄入和传播。
传统的荧光示踪剂是不适合的, 因为它改变病毒的
复制, WGA能与狂犬病毒竞争地结合 [ 22]。WGA能
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2011年第 5期 宋艳等 :狂犬病毒作为神经示踪剂的研究进展
结合病毒包膜上的糖蛋白干扰病毒与宿主细胞的相
互作用,从而影响病毒的传播。
已经证明了霍乱毒素 B片段能与狂犬病毒混
合而不改变狂犬病毒的摄入。注射狂犬病毒和 CTB
的混合物对于界定注射区的研究是一个主要的改
进,因为 CTB免疫标记揭示了注射位点的精确范
围。CTB比狂犬病毒更容易弥散, 所以它是界定狂
犬病毒注射范围的安全的方法,其狂犬病毒注射区
可被高估但不能被低估。另一个优势是在同一个试
验中, 狂犬病毒和 CTB的混合物能鉴别一级神经元
和高级神经元。我们有意使用较低浓度的 CTB
( 0
03% )为了不干扰狂犬病毒的摄入, CTB免疫标
记仅仅是逆向的,不是很强, 但是能容易地检测到。
当混合 0
03%的 CTB, 狂犬病毒不改变 CTB摄入,
因为 CTB标记所有已知对于靶向中枢神经系统注
射区的直接投射,尽管由于较低的 CTB的浓度可能
低估神经元的总的数量。重要的是该浓度不改变狂
犬病毒的摄入,因为当单独注射狂犬病毒后,狂犬病
毒以相同的效率和速度进行跨神经示踪 [ 23 ]。
2
3
基因修饰的狂犬病毒示踪剂
反向遗传学的发展使基因修饰狂犬病毒基因组
成为可能, 为研究病毒机制和设计新型疫苗提供
了契机,根据不同的目的基因修饰狂犬病毒示踪
剂。尽管这些技术在神经科学的应用还仍旧处于
起始阶段,但是初步的成果已经展示了这种方法的
潜力 [ 24]。
2
3
1
基因修饰的单突触限制的狂犬病毒的示踪
剂
利用反向遗传学的方法设计一个能够像常规的
逆向示踪剂一样,仅标记干预注射位点一级神经元
的狂犬病毒示踪剂。这个狂犬病毒的重组体源于减
毒株 SAD
B19,编码狂犬病毒糖蛋白的基因被削减,
这个重组体又被通过遗传学技术装配缺失的 G蛋
白 [ 25]。G蛋白对于狂犬病毒跨突触传播是非常重
要的, 当注射该病毒到中枢神经系统,该病毒被转移
到一级神经元的细胞体,开始复制。可是,病毒缺乏
G蛋白,它不能跨突触转移。另一个成就是 Meba

sion等构建带有标记基因的狂犬病毒载体,表明了
该外源基因能稳定的表达。近来, W icketshan等 [ 26]
结合这两种方法,插入编码荧光标记的 GFP基因到
SAD
dG重组体,合成的 SAD
dG
GFP然后装配缺失
的 G。当注射液进入中枢神经系统时, 这个病毒载
体又像一个常规的示踪剂, 与 SAD
dG突变体一样
不能跨突触传递。与常规的示踪剂比较,单突触限
制的狂犬病毒示踪剂能被末端摄取, 并且由于病毒
的复制和 GFP的表达能更好地标记神经元。
进一步发展涉及限制细胞摄入单突触限制的狂
犬病毒示踪剂,获得鉴别细胞型或单个神经元的方
法。在最初的尝试中, SAD
dG
GFP重组体被装配
禽类的反转录病毒糖蛋白 ( EnvA ) [ 27]。由此获得的
伪膜的 EnvA
SAD
dG
GFP, 在它的胞膜上仅表达
EnvA不能感染哺乳动物的神经元,因为哺乳动物脑
内没有 EnvA的受体。因此, 基因枪技术应用到脑
切片将编码恰当的禽类受体 ( TVA )和狂犬病毒 G
质粒转染到神经元目的是使神经元表达 TVA, 能被
病毒感染。在神经元 A复制,病毒在原位装配 G,由
于胞膜上 G的存在, 病毒能够逆向转移到一级神经
元 B, B单突触限制到 A, 但是病毒不能进一步传
播, 因为子代病毒在 B神经元复制缺少 G。尽管这
种方法很新颖,但是还不能令人完全满意,因为基因
枪技术在切片上不能限制转染到单个神经元。因
此, 标记的神经元不能准确地联系到一个特定的、假
定的突触后的配对体。最近尝试利用电转和其他的
方法,利用相似的狂犬病毒重组体在切片和体内改
进单个神经元的靶向 [ 28]。
2
3
2
利用同源狂犬病毒重组体进行二元示踪

发展可信赖的二元跨神经示踪方法在同一试验鉴别
两种不同的神经环路,仅有二元的跨神经示踪能阐
明神经环路的会聚和辐散。因为狂犬病传播具有特
异性,使用同源的狂犬病毒株发展二元跨神经示踪
方法是可行的。Ohara等 [ 29]通过在 HEP
Flury插入
不同的报告基因 ( gal、V enus或 EGFP)产生 3种同
源狂犬病毒的重组体, 减毒的 HEP
Flury株的 G基
因被强毒的 CVS株取代目的是模拟 CVS的性质。
通过试验体外和体内的双重感染, 这些作者表明了
病毒干扰复制的现象,同源的 Prv株和同源狂犬病
毒重组体都存在此种现象。换言之, 当两种病毒在
不同时间感染相同的神经元时, 第二个病毒感染的
效率以时间依赖的方式指数幂的降低。这样, 要想
达到有效的双标, 两种病毒必须在几个小时内感染
相同的神经元。而且, P rv株插入外源基因的长度
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 5期
能改变狂犬病毒重组体的复制和传播速度。这些结
果强调了使用具有相同传播特性的同源病毒株的重
要性, 或者需要调整各自病毒的相对量达到最适的
二元跨示踪标记,这两种狂犬病毒同源突变体在体
内和体外成功的共定位表明了基因修饰的狂犬病毒
在二元跨神经示踪的潜力。
理论上使用这些策略设计狂犬病毒的重组体表
达活性的示踪剂和感光的离子通道, 可以在体内监
测或操纵神经活性, 这是一个主要的技术进展。
狂犬病毒在复制过程中不改变神经元的代谢是最
有前景的病毒工具, 唯一的缺点是狂犬病毒的基
因组相对疱疹病毒的基因组小, 这样在插入的范
围受限。
3
结语
中枢神经系统有大量的神经元相互联系。鉴别
特异的神经环路对于理解中枢神经系统的结构和功
能是必不可少的。利用狂犬病毒作为神经示踪剂具
有较强的示踪能力,能跨多个突触进行示踪,并且不
影响神经细胞的正常功能, 是一个具有前景的神经
示踪剂。
目前研究使用细胞型特异的启动子在多巴胺神
经元表达示踪分子有利于神经示踪。研究者使用了
腺病毒和腺病毒相关病毒携带 2
5 kb的酪氨酸羟
化酶启动子特异地在多巴胺神经元表达示踪剂,可
是其能引起黑质多巴胺神经元的毒性, 狂犬病毒能
否携带酪氨酸羟化酶启动子特异地在多巴胺神经元
表达示踪剂,并且对多巴胺神经元没有毒性是值得
探讨的问题。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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