全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-06
基金项目:国家自然科学基金项目(3471214);重庆市科委自然基金重点项目(2007BA1005)
作者简介:马作江(1981-),男,硕士,研究方向:植物分子生物学
通讯作者:李正国,E-mail:zhengguoli@cqu.edu.cn,Tel:86-23-65120483
苏云金芽孢杆菌(Bacilusthuringiensis)在其营养生长期分泌的一种杀虫蛋白,称为营养期杀虫蛋白
(VegetativeInsecticidalProtein,vip)[1],因其对 δ内毒素(或 ICPs)产生抗性的昆虫有很强的毒杀效果而引起
了广泛关注。已有研究报道了一些 vip蛋白基因家族[2],被认为是第二代杀虫基因[3]。目前 vip基因的应用主
要是转基因植物,2006年,美国转 Vip3A基因抗虫棉花已投入商业生产,其它的报道也都已申请了专利,
国内迄今为止尚未见报道。Vips基因与 ICPs基因没有任何同源性,其杀虫作用机理与 ICPs也不相同,是一
种广谱性杀虫蛋白。其中以 Vip3A基因研究最为清楚,目前发现它对小地老虎有高杀虫活性,比 Cry1Ac毒
力高 260倍。对草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、烟芽夜蛾和美洲棉铃虫等有较好杀虫活性[4]。
用于植物转化的启动子大部分是组成型表达的 CaMV35S启动子。2005年,Ryutaro等[5]在烟草中获得
了 EF1α启动子(elongationfactor1αpromoter),且证明了 EF1α启动子是一种很好的花组织高效表达启动
子。因此,该启动子对基因的组织特异性表达具有重要价值。
为了研究 Vip3A基因在植物中的表达状况,分别将 Vip3A基因与 CaMV35S启动子和 EF1α启动子进
行构建,并通过农杆菌介导进行烟草转化,为研究 Vip3A基因在植物特定的易受害虫危害的部位高效表
达、提高抗性等方面提供参考。
Vip3A基因植物表达载体的构建及其对烟草的遗传转化
马作江 邓伟 杨迎伍 李正国
(重庆大学生物工程学院基因工程研究中心 重庆市高校功能基因与调控新技术重点实验室,重庆 400044)
摘 要: 为了研究Vip3A基因在转基因抗虫植物中的应用,利用PCR技术克隆了苏云金芽孢杆菌的Vip3A基因
和烟草的EF1α启动子,以pBI121质粒为基本载体,构建了分别由组成型CaMV35S启动子和花特异表达的EF1α 启动
子驱动Vip3A基因的植物表达载体pBIVip3A和pBIEFVip3A,并通过农杆菌介导的方法对烟草进行了遗传转化。经PCR
检测,外源基因已整合到烟草基因组中。
关键词: Vip3A基因 EF1α启动子 载体构建 苏云金芽孢杆菌 烟草
ConstructionofPlantExpressionVectorsofVip3AGeneand
TransformationinTobacco
MaZuojiang DengWeiYangYingwu LiZhengguo
(GeneticEngineeringResearchCenter,Bio-EngineeringColege,ChongqingUniversity,KeyLabofFunctionalGeneand
NewRegulationTechnologiesUnderChongqingMunicipalEducationCommission,Chongqing400044)
Abstract: InordertostudytheapplicationofVip3A geneintransgenicinsect-resistantplants,Vip3A geneof
BaciusthuringiensisandEF1α promoteroftobaccowereclonedbyPCR.TwoplantexpresionvectorspBIVip3Aand
pBIEFVip3Awereconstructed,inwhichtheVip3AgenewasdrivenbytheconstitutivepromoterCaMV35Sandpetal
tisue-specificpromoterEF1α respectively.TobaccosweretansformedbyAgrobacterium containingtheconstructed
vectors.ThetransgeniclineswereselectedbyPCRdetecstion.
Keywords: Vip3Agene EF1α promoter Constructionofexpresionvector Bacilusthuringiensis Tobacco
2008年第5期
1 材料与方法
1.1 植物材料及菌种
烟草(Nicotianatabacun)、苏云金芽孢杆菌菌株(Bacilusthuringiensis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109
菌株、农杆菌菌株(Agrobacterium)GV3101及植物表达载体 pBI121为本实验室保存。
1.2 工具酶及分子生物学试剂
限制性内切酶 HindII、BamHI、SacI、TaqDNA聚合酶、高保真 PrimeSTARHSDNA聚合酶均购自均购
自 TaKaRa公司;T4DNA连接酶购自 Promega公司;DNAmarker(DL2000、MD113)、DNA回收试剂盒、质粒
DNA提取试剂盒购自北京天为时代科技有限公司;其它生化试剂都为国产分析纯。
1.3 引物的设计及 PCR扩增
根据文献报道的 Vip3A基因序列(GenBank登录号为 BACVIP3AA)、EF1α启动子序列(GenBank登录
号为 BD438335),分别设计一对特异性全长引物,并引入合适的酶切位点,引物合成由上海英骏生物技术
公司完成。
Vip3A基因的上、下游引物分别为:P1:5-CGGGATCCATGAACAAGAATAATACTAAAT-3(划线部分为
引入 BamHI酶切位点);P2:5-CGGAGCTCTTACTTAATAGAGACATCGT-3(划线部分为引入 SacI酶切位
点)。通过热裂解的方法提取苏云金芽孢杆菌总 DNA,以苏云金芽孢杆菌总 DNA为模版,使用高保真
PrimeSTARHSDNA聚合酶,以 P1、P2为引物进行 PCR扩增,反应条件:95℃预变性 5min;95℃45s,52℃
45s,72℃2min;共 35个循环;最后 72℃延伸 10min。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用 DNA凝胶回
收试剂盒进行回收纯化目的片段。
EF1α启动子的上、下游引物分别为:F1:5-GGTTCGAAGGTACCAGCCTTAGTTAAAGTG-3(划线部分为
引入 HindII酶切位点);F2:5-TTGGATCCCGACTTTCCAGAGTCGACGT-3(划线部分为引入 BamHI酶切位
点)。用 CTAB法提取烟草总 DNA,以烟草基因组 DNA为模版,以 F1、F2为引物进行 EF1α启动子的 PCR
扩增,反应条件:95℃预变性 5min;95℃45s,52℃1min,72℃1.5min;共 35个循环;最后 72℃延伸 10min。扩
增产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用 DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化目的片段。
1.4 植物表达载体的构建
BamHI和 SacI双酶切 Vip3A基因的纯化 PCR产物,然后将其插入经同样酶切的 pBI121载体中,构建
成由 CaMV35S启动子驱动 Vip3A基因的植物表达载体 pBIVip3A(图 1A),再用 HindII和 BamHI双酶切
EF1α启动子的纯化 PCR产物,然后将其插入经相
同 酶 切 的 pBIVip3A载 体 中 ,EF1α启 动 子 替 换
CaMV35S启动子构建成植物花组织特异表达载体
pBIEFVip3A(图 1B)。构建载体分别经 BamHI和 SacI
双酶切 (pBIVip3A)、HindII和 BamHI及 BamHI和
SacI双酶切(pBIEFVip3A)鉴定正确后,送上海英骏
生物技术公司测序,用 DNAMAN序列分析软件进行
序列分析。
1.5 烟草的遗传转化与鉴定
分别将重组质粒 pBIVip3A、pBIEFVip3A通过冻融法导入农杆菌 GV3101,再利用叶盘法转化烟草[6],最
后将经过 50mg/L浓度卡那霉素筛选的抗性植株移入温室培养。
以具卡那霉素抗性的烟草转化苗幼嫩叶片为材料,用改良 CTAB法小量提取的烟草基因组 DNA。以
DNA为模版,非转基因烟草基因组 DNA为阴性对照,pBI121质粒 DNA(含 NPTI基因)为阳性对照,以
NPTI基因特异引物(扩增产物为 758bp)进行转基因植株的 PCR鉴定,PCR反应条件:95℃预变性 5min;
图 1 pBIVip3A(A)和 pBIEFVip3A(B)植物表达
载体的基本结构
马作江等:Vip3A基因植物表达载体的构建及其对烟草的遗传转化 109
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
95℃30s,52℃30s,72℃1min;共 35个循环;最后 72℃延伸 10min。
2 结果与分析
2.1 Vip3A基因、EF1α启动子的扩增及序列分析
以苏云金芽孢杆菌总 DNA为模版,以 P1、P2为引物进行 Vip3A基因的 PCR扩增,扩出一条大于 2
000bp的条带(图 2A),与预期目标片段大小一致(2370bp)。经测序确认及软件分析后表明,克隆片段 DNA
与 Vip3A基因原序列相同。
以烟草基因组 DNA为模版,以 F1、F2为引物进行 EF1α启动子的 PCR扩增,扩出一条大于 1000bp的
条带(图 2B),与预期目标片段大小一致(1178bp)。经测序及 PLANTCARE进行启动子元件分析表明,该启
动子序列正确,含有 EF1α基因的起始的 63个编码碱基序列,这 63个碱基序列可能对 EF1α启动子的有
效表达起重要作用[5]。除了启动子基本顺式作用元件 TATA-box、CAAT-box外,还含有高效转录作用元件
5UTR、Py-richstretch,抗逆反应作用元件 TC-richrepeats及其他调控元件。
2.2 植物表达载体的构建与鉴定
分别将 Vip3A基因与 CaMV35S启动子和 EF1α启动子进行构建,得到重组质粒 pBIVip3A和 pBIEFVip
3A,对重组质粒进行酶切鉴定,所得目标片段大小与预期相符(图 3A、B),证明这 2个植物表达载体构建
成功,经测序验证序列正确。
图 3 重组质粒 pBIVip3A(A)、pBIEFVip3A(B)的
酶切检测
图 2 Vip3A基因(A)和 EF1α启动子(B)的
PCR扩增
M:DL2000marker;1:Vip3A基因 PCR产物;
2:EF1α启动子 PCR产物
M:DL2000marker(A),MD113marker(B);1:BamHI和 SacⅠ双
酶切;2:BamHI和 SacⅠ双酶切;3:HindII和 BamHI双酶切
2.3 转基因烟草植株的 PCR鉴定
通过农杆菌转化获得的烟草抗性植株移栽成活后,以叶片为材料提取基因组 DNA,以 DNA为模版,以
pBI121质粒 DNA为阳性对照,以正常烟草 DNA为阴
性对照,以 NPTI基因特异引物进行 PCR扩增鉴定(目
标片段 758bp)。经检测,27株转 pBIVip3A烟草抗性苗
中有 24株是 PCR阳性植株;23株转 pBIEFVip3A的烟
草抗性苗中,19株 PCR阳性植株(图 4)。初步证明已
获得转基因烟草。
3 讨论
人们已发现并分离到了许多有用的抗虫基因,有
一批转基因抗虫作物已进行了商品化生产,并展现出了巨大的应用前景。研究最多且应用最普遍的是 Btδ
内毒素杀虫蛋白,但是一种 Bt蛋白只对一类或几类昆虫起作用,而且在实际应用中仍有许多重要农作物
图 4 转基因烟草植株中 NPTI基因的 PCR检测
M:DL2000marker;P:阳性对照;N:阴性对照;1～23:
转基因烟草植株
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2008年第5期
害虫对杀虫晶体蛋白毒素不敏感。另外,还有部分昆虫产生抗性的问题。因此,筛选新的杀虫菌株与鉴定新
的杀虫蛋白的研究受到高度重视[7]。营养期杀虫蛋白 Vip3A是一种新型抗虫蛋白,是一种广谱杀虫蛋白,
且 Vip3A蛋白比内毒素的生物毒力要强,进一步研究 Vip3A基因在转基因抗虫植物中的应用具有重要意
义。
目前用于植物转化的启动子大部分是 CaMV35S启动子,该启动子在植株的不同部位、不同时期、不同
生长环境都能表达,因而就降低了转基因植株中杀虫物质的浓度。近年来,有很多研究报道了一些在植物
组织特异高效表达的启动子。如马铃薯的 Lhca3.St.1启动子[8]、菊花的 UEP1启动子[9]、RbcS启动子[10]等。这
类启动子在转基因抗虫植物的应用有重大意义。如某些植物遭虫害时,表皮细胞最先受到昆虫的侵食,利
用表皮细胞特异启动子表达防御基因也许很有用;为防御侵食植物韧皮部的昆虫,就可以利用韧皮部特异
表达启动子,如 AAP3启动子[11]、南瓜的 PP2启动子[12]等。这样既可以减少无虫时抗虫基因大量表达而对营
养造成无谓的消耗,而且还可以减缓对害虫的选择压,起到提高抗性、生物生长量,延缓害虫产生耐受性的
目的。这类启动子在某些方面还不能满足于应用的需要,因而今后还应不断地寻找适于抗虫基因特异性表
达的启动子,以增强转外源抗虫基因植物的表达效果和抗虫能力。
成功克隆了苏云金芽孢杆菌的 Vip3A基因及烟草的 EF1α花特异表达的启动子,构建了 Vip3A基因 2
个植物表达载体,并分别转化烟草获得了一批转基因烟草植株。这些转基因材料的深入研究,将为进一步
培育转基因抗虫植物新品种提供参考。
参考 文献
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