全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-04-09
基金项目:本研究为国家质检总局科研项目(2006IK142)
作者简介:金永生(1981-),男,硕士,研究方向:植物生物化学
通讯作者:廖祥儒,男,教授,博士生导师,E-mail:liaoxiangru@163.com
可可粉是可可豆直接加工处理的可可制品。可可豆经过预处理去掉各种杂质,再经过焙炒去壳分离出
来的可可仁磨成酱体形成成可可液块(又称“可可料”或苦料)。可可液经压榨滤去部分可可脂形成可可饼,
可可饼块粉碎后经筛分所得的棕红色粉末即为可可粉[1]。可可粉具有浓烈芬芳的独特香味,含有类黄酮等
多种营养元素,营养价值很高,是制造巧克力的重要原料,也是当今世界 3大嗜好性饮料之一。目前我国的
可可粉市场制假售假现象严重,常常以次充好、以假代真,严重扰乱了市场秩序和正常的可可制品进出口
贸易。大豆粕、板栗壳、花生壳和芝麻粕等是最为常见的掺假物质[2]。现行的国内外可可粉检验标准与检测
方法只是对脂、灰份、蛋白质含量等的检测[3],不能确定可可粉中这些外源植物成分的掺假情况。
可可粉中几种外源植物源性成分的PCR检测
金永生 1 朱卫娟 2 廖祥儒 1
(1江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122;2无锡出入境检验检疫局,无锡 214101)
摘 要: 大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳是常见的几种可可粉外源掺假成分,根据它们所特有的基因片段设计引
物,以高等植物 18SrDNA基因为内参照基因,应用改良 CTAB法抽提材料 DNA,对分离的 DNA进行 PCR扩增并分
析,建立了可可粉中这几种外源植物成分的快速检测方法。用建立的PCR方法对可可基因组进行扩增,均无特异条带;
扩增出的PCR产物测序结果表明与目标片段一致;将各材料DNA倍比稀释,分别对各个稀释度的 DNA进行PCR扩
增。结果表明,该方法对大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳DNA检测的敏感度分别可达82.5pg/μl、32.5pg/μl、124pg/μl
和157pg/μl。模拟样品试验发现,该方法的最低检测限(w/w)分别达0.5%、0.5%、5%和5%,可作为可可粉及其制品中这几
种外源成分鉴别检测的有效方法。
关键词: 可可粉 植物源性成分 PCR检测
PCRDetectionofExogenousVegetativeComponents
inCocoaPowder
JinYongsheng1 ZhuWeijuan2 LiaoXiangru1
(1TheKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi
214122;2WuxiEntry-exitInspectionandQuarantineBureauoftheP.R.,Wuxi214101)
Abstract: A rapidPCR asayfordetection ofseveralcommon exogenousvegetativecomponents,including
soybeanmeal,sesamemeal,peanutshelandchestnutshelcontainedincocoapowderwasdescribed.Species-specificPCR
primersweredesignedandusedinthispurpose.DNAwasextractedbymodifiedCTABmethodandconfirmedbyusing
18SrDNAgeneasinternalcontrol.Thespecificsequencescouldbeamplifiedwiththetemplatesofthecoresponding
DNAsolutionsbutnotthecocoagenomeDNA.ThesequencesofampliconswereconsistentwithGenBanksequences
inahighdegree.ThismethodcandetectDNAextractedfromsoybeanmeal,sesamemeal,peanutshelandchestnutshel
eachinlesthan82.5pg/μl,32.5pg/μl,124pg/μland157pg/μl.Also,itcandetectcorespondingmaterialslesthan
0.5%(w/w),0.5%(w/w),5%(w/w)and5%(w/w) incocoapowder.Itcouldbeanefectivemethodfordetection
exogenousvegetativecomponentsincocoapowder.
Keywords: CocoaPowder ExogenousvegetativecomponentsPCRdetection
2008年第5期
PCR技术具有快速、灵敏、特异性高的特点,已广泛应用于食品、饲料中外源成分的检测[4~6],针对可可
粉掺假物种大豆、板栗、花生和芝麻设计的引物和对其 DNA提取方法等进行了优化,建立了一套切实可行
的 PCR检测可可粉中几种外源植物源性成分的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与主要试剂
可可粉及可可豆由江苏无锡鼎元可可制品厂提供;市售大豆、大豆粕、芝麻、芝麻粕、花生及板栗,花生
壳、板栗壳由市售炒熟带壳花生和板栗剥离得到。
TaKaRaExTaqTMDNA聚合酶,为大连宝生物生物技术有限公司产品;λDNA/EcoRⅠ +HindⅢ DNA
Marker,100bpDNALadder,琼脂糖(BBI进口分装),CTAB等主要试剂均购自于上海生物工程公司。
CTAB提取缓冲液Ⅰ:在 800ml去离子水中加入 46.75g氯化钠,搅拌溶解后加入 50mlTris-HCl溶液(1
mol/L,pH8.0)和 20mLEDTA溶液(0.5mol/L,pH8.0),用水定容到 1L,分装后高压灭菌。
CTAB提取缓冲液Ⅱ:在 800ml去离子水中加入 46.75g氯化钠,20gCTAB,搅拌溶解后加入 50mlTris-
HCl溶液(1mol/L,pH8.0)和 20mlEDTA溶液(0.5mol/L,pH8.0),用水定容到 1L,分装后高压灭菌。
1.2 引物
依据美国 NCBIGenBank数据库公布的大豆 kti-S(GI:510514)、芝麻 oleosin(GI:10834826)、花生 2S
protein(GI:52001226)和板栗 lfy-like(GI:85542678)基因序列,利用 Primer5.0软件设计出上、下游引物,引
物序列如表 1。同时,为确保抽提的 DNA溶液质量,设立一个内参照基因,目标为高等植物 18SrDNA基因[7],
引物序列如表 1。
表 1 用于检测的 PCR引物
引物由上海生物工程公司合成,PAGE纯化。上、下游引物分别用无菌超纯水稀释成 100μmol/L的贮
存液,并作 4倍稀释,制成引物浓度为 25μmol/L的工作液。
1.3 样品处理及 DNA的制备
改良 CTAB法,参照 Lipp等[6]的方法并稍作改动。
(1)称取 50mg试样,加 300μlCTAB提取缓冲液Ⅰ,混匀;(2)加入 500μl65℃预热的 CTAB提取缓冲
液Ⅱ,混匀,65℃保温 30～90min,其间不时轻轻颠倒混匀;(3)12000r/min离心 10min,转移上清液至新的洁
净离心管;(4)加入等体积的氯仿/异戊醇,轻轻颠倒混匀,12000r/min离心 10min,并重复一次;(5)转移上
清至新的洁净离心管内,依次加入等体积的异丙醇和 1/10体积的 3mol/L乙酸钠溶液,轻轻颠倒混匀,
12000r/min离心 10min;(6)弃上清,加入 800μl体积分数 75%乙醇洗涤沉淀,12000r/min离心 5min;(7)弃
上清,再加入 100μl75%乙醇洗涤,12000r/min离心 5min,弃上清;(8)除去残留的乙醇,待沉淀干燥后,
DNA沉淀溶解于 40μlddH2O中,待测或 4℃保存备用。
金永生等:可可粉中几种外源植物源性成分的PCR检测 119
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
1.4 PCR扩增
PCR反应体系:10×PCR缓冲液 5μl,dNTPs(5mmol/L)4μl,上下游引物(25μmol/L)各 2μl,Ex-Taq酶
(5U/μl)0.3μl,模板 DNA2.5μl,加灭菌双蒸水至 50μl。PCR扩增条件为:94℃预变性 3min;94℃45s→各引
物对退火温度 1min→72℃40s,40个循环;最后于 72℃延伸 5min。扩增产物用 2.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 特异性试验
用抽提的大豆、芝麻、花生及板栗的基因组 DNA作模板,以抽提的可可豆基因组 DNA作阴性对照,分
别进行 PCR反应,PCR体系同 1.4,以确定目标条带 DNA在可可中不能被扩增出。
1.6 敏感性试验
按 1.3方法提取的大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳的 DNA溶液,经核酸蛋白仪测得其质量浓度分别
为 825μg/ml、325μg/ml、124μg/ml和 157μg/ml,灭菌双蒸水调整浓度分别稀释为原来浓度的 10-1、10-2、10-3、
10-4与 10-5,然后取各梯度稀释液 2.5μl用作 PCR模板,分别进行 PCR扩增。
1.7 模拟样品试验
将各目标材料磨成粉末后加入到可可粉中,充分混匀,使这些材料的质量分数分别为 100%、10%、
5%、1%、0.5%和 0.1%。用 1.3方法分离 DNA,各取 2.5μl用作 PCR模板,分别进行 PCR扩增。
2 结果
2.1 所用外源植物成分的 PCR扩增
PCR扩增结束后,电泳结果显示,以大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳的 DNA溶液为模板,可分别特异
性地扩增出约 267bp、153bp、267bp及 167bp的片段,与
预期目标相符(图 1)。
2.2 PCR产物的序列鉴定以及分析
通过对 PCR扩增产物进行测序,结果表明,PCR产物
的核苷酸序列大小分别为 267bp、153bp、268bp及 167
bp,这些序列分别与 GenBank上相应基因比较,结果显示,
大豆的 PCR扩增产物与 kti-S基因 GenBank的 GI编号为
510514的核苷酸同源性达到 100.0%,可认为该 PCR产物
即是目的 DNA片段;芝麻的 PCR扩增产物与 oleosin基因 GenBank的 GI编号为 10834826的同源性达到
100.0%;花生的 PCR扩增产物与 2Sprotein基因 GenBank的 GI编号为 52001226的同源性达到 97.8%;芝
麻的 PCR扩增产物与 lfy-like基因 GenBank的 GI编号为 85542678的同源性达到 98.8%。
2.3 特异性试验
以大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳的
DNA溶液为模板,可分别特异性地扩增出约
267bp、153bp、267bp及 167bp的片段,而
以可可粉及可可豆的 DNA溶液为模板的
PCR均不能扩增出相应条带(图 2),说明该
方法具有较高的特异性。
2.4 敏感性试验
经 10×梯度稀释的大豆粕、芝麻粕、花生
壳和板栗壳材料 DNA溶液,在浓度分别为
82.5pg/μl、32.5pg/μl、124pg/μl和 157pg/μl时,
仍能扩增出相应可见的目的条带 (图 3),说
图 1 各外源植物材料特异 DNAPCR扩增
M:100bp DNA Ladder (100bp、200bp、300bp、400bp、
500bp和 500bp);1:大豆 DNA;2:芝麻 DNA;3:花生
DNA;4:板栗 DNA
图 2 PCR扩增的特异性
M:100bpDNALadder (100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和 500
bp);1~2:以各材料 DNA为模板的 PCR产物;3:以各材料 DNA为模板的
18Srdna内参照基因 PCR产物;4~5:以可可粉 DNA为模板的 PCR产物;
6:以可可粉 DNA为模板的 18SrDNA内参照基因 PCR产物
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明该方法的检测敏感性很高,极低量的目标材料 DNA存在时即可检出。
2.5 模拟样品的检测
当可可粉中大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳的质量分数分别达 0.5%、0.5%、5%和 5%时,用 1.3方法
分离的 DNA,PCR扩增可见目的条带(图 4),说明该检测方法的最低检测质量分数,大豆粕、芝麻粕、花生
壳和板栗壳质量分数分别达到 5%、5%、0.5%和 0.5%以下。
图 4 模拟样品的 PCR检测图 3 PCR扩增的敏感性
M:100bpDNALadder(100bp、200bp、300bp、400bp、500bp
和 500bp);1～7:原 DNA溶液依次 10-1×稀释
M:100bp DNA Ladder (100bp、200bp、300bp、400bp、500bp 和
500bp);1～7依次为目标材料质量分数 100%、10%、5%、1%、
0.5%、0.1%和 0%
3 讨论
可可粉是一种深加工食品,在加工过程中需要经过发酵、碱处理、煮、粉碎、研磨及加热等等一系列工
序,这些会使大部分的 DNA断裂降解成短小片段,提取出来的 DNA含量和质量都会大受影响。而且可可
粉含有大量的蛋白质、脂类、酚类和聚酮糖苷类色素等物质,外源添加的成分也是成分复杂,这些都可能影
响 DNA的后续操作,抑制 PCR反应的进行。因此在 DNA提取过程中,要尽可能去除这些杂质获得高质量
的 DNA,这是进行后续操作的先决条件。实际操作中,可能会出现可可粉 DNA提取质量不好造成假阴性的
结果,因此有必要对提取的 DNA质量进行控制,可以通过设立内参照基因进行 PCR对照。以高等植物共
有的叶绿体基因或 18SrDNA基因作 PCR检测内参照基因[7],可以很好的控制提取的材料 DNA质量。
可可粉中添加外源植物源性成分是目前可可粉市场主要的假冒伪劣现象之一,传统的可可粉检验检
测方法是不能检出的,PCR技术检测 DNA具有特异性强、灵敏度高、简便快速的特点,是当前分子生物学
的常用技术。针对 GenBank上公布的这几种植物部分基因序列设计引物,经试验验证,建立了一套切实可
行的从可可粉中检测大豆、芝麻、花生和板栗源性成分的方法,敏感性试验和模拟样品试验表明,该方法的
检测敏感性高,最低检测质量分数分别达 0.5%、0.5%、5%和 5%,能够满足实际检验检测的需要,具有很好
的实用价值和现实意义。
参考 文献
1 蔡文升,张文治.糖果巧克力生产工艺与配方.北京:中国轻工业出版社,1999,312~313.
2 余诗庆,杜传来.安徽技术师范学院院报,2005,19(4):24~30.
3 中华人民共和国国内贸易部.SB/T10209-94.可可豆及可可制品行业标准[S].北京:国内贸易部标准编辑出版委员会,1994.
4 陈文炳,邵碧英,江树勋,等.食品科学,2006,27(11):404~408.
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6 LippM,BrodmannP,PietschK,etal.JAOACInt,1999,82(4):923~928.
7 朱芷葳,董常生.生物技术通讯,2006,17(5):807~809.
金永生等:可可粉中几种外源植物源性成分的PCR检测 121