全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
BenA3基因双元载体的初步构建及
转化绿僵菌 189的初步研究
姚洪平 1, 2 王广君 2 张泽华2 农向群2 魏松红 1
( 1 沈阳农业大学植物保护学院,沈阳 110161;
2中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)
摘 要: 用 X ho l 和 Sal 分别双酶切植物表达载体 pCAMBIA1300和含有目的基因的 pMD19TBenA3,定向连接得到
重组质粒 pCAMB IA1300BenA3, 将其导入农杆菌 AGL1。经 PCR鉴定后, 得到可用于绿僵菌转化的农杆菌双元载体。采用的
预培养时间、菌液浓度、共培养时间、乙酰丁香酮浓度的条件下, 进行农杆菌介导绿僵菌的遗传转化, 得到可以稳定性遗传的
绿僵菌转化子, 随机挑选转化子进行苯菌灵抗性基因的 PCR扩增表明, 绿僵菌转化子含有了苯菌灵抗性基因。该转化体系的
建立, 将有利于绿僵菌生防功能基因的克隆和作用机制的研究。
关键词: BenA3基因 pCAMB IA1300BenA3 农杆菌 双元载体 绿僵菌 转化
Construction of BenA3 Gene in Binary Vector andAgrobacterium
mediated Genetic Transformation ofMetarhizium anisop liae 189
YaoH ongp ing
1, 2 W ang Guang jun2 Zhang Zehua2 Nong X iangqun2 W ei Songhong1
(
1
Co llege of PlantP ro tection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161;
2
State K ey Laboratory forB iology of P lantD iseases and Insect Pests, Institute of PlantP rotection, CAAS, B eijing 100193)
Abstrac:t The pCAM BIA1300B enA3 w as d irectiona lly connec ted by the plant expression vector pCAM BIA1300 and vec to r
pMD19TBenA3, bo th o fwh ich w ere trea ted byX ho l and Sal , respective ly. Then it was transfo rm ed intoAGL1 by therm a l stimu la
tion m ethod . Tested by PCR, the bina ry vector was constructed successfully. Under the conditions o f precu lture tim e, bacte rial concen
tration, coculture tim e and the concentration of acetosy ringone in th is study, stable transform ants can be obta ined. The integration o f the
BenA3 gene intoM etarhiz ium anisop liae genom e w as de term ined by PCR on random ly se lected transformants, and the results showed that
TDNA w as inserted into a ll the transfo rm ants. These suggest that A. tum efaciens m ediated transforma tion is a potentia lly pow erfu l too l
tow ards tagged mu tagenesis and gene c lone forM etarhizium anisop liae.
Key words: BenA3 gene pCAMB IA1300BenA3 Agrobacter ium tum efaciens Bina ry vector M etarhiz ium anisop liae Genet
ic transfo rma tion
收稿日期: 20100506
基金项目:国家科技支撑计划课题 ( 2006BAD08A18) ,现代农业产业技术体系建设项目 ( nycytx37)
作者简介:姚洪平,男,在读硕士,研究方向:农药学; Em ai:l hpyao@ 163. com
通讯作者:张泽华,男,研究员,研究方向:生物防治研究; Em ai:l lgbcc@ 263. n et
近年来, 昆虫病原真菌致病机理和分子生物学
方面的研究有了较快的进展。相关研究主要集中在
利用基因工程手段对昆虫病原真菌进行改造, 提高
菌株的杀虫毒力、杀虫速度以及抗逆能力等方面。
在虫生真菌的基因工程中, 重组子的筛选通常需要
基因标记, 基因标记是指将具有标记功能的外源
DNA引入受体菌株,从而使受体菌株细胞能够在环
境中与其他微生物相区别的一种标记方法 [ 1]。抗
性标记是昆虫病原真菌基因工程常用的一种选择性
标记,目前用于昆虫病原真菌基因工程中的抗性标
记基因主要有抗杀菌剂和抗除草剂基因两大类。苯
菌灵抗性基因 (粗糙脉孢霉 tubu lin基因 ) BenA3
2010年第 8期 姚洪平等 : BenA3基因双元载体的初步构建及转化绿僵菌 189的初步研究
是比较常用的真菌转化的选择性标记 [ 2, 3]。自从
Bundock等成功使用根癌农杆菌介导酵母菌遗传转
化后, 农杆菌介导虫生真菌的遗传转化也得到了突
破性的进展 [ 4 ]。绿僵菌是一种重要的昆虫病原真
菌,其毒性基因也在近几年得到了大量的分离和验
证。在此基础上,本研究构建 BenA3基因插入质粒
载体 TDNA区域的农杆菌双元载体,并对绿僵菌的
遗传转化进行初步的研究, 以期为后续的试验奠定
基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
大肠杆菌 JM 110和植物表达载体 pCAMBIA1300
及农杆菌 AGL1由本实验室保存。克隆载体
pMD19T购自大连宝生物有限公司。DNA限制性内
切酶和 Taq酶购自大连宝生物有限公司。
1. 2 质粒 DNA的提取
质粒 DNA的提取及大肠杆菌 JM 110感受态的
制备参考文献 [ 5]进行。
1. 3 PCR扩增、克隆和测序
以已经得到的苯菌灵抗性基因 BenA3为模板,
进行 PCR扩增,引入 Sal 酶切位点。扩增引物序
列分别为: 正义引物 P1: ACGCGTCGACAGGGGGC
CTTCCA, 反义引物 P2: ACGCGTCGACAAGCTTG
GCCAGC(下划线为 Sal 酶切位点 )。PCR反应程
序: 94! 预变性 4 m in, 94! 变性 30 s, 56! 退火
1 m in, 72! 延伸 90 s, 返回至第二步循环 30次;
72! 延伸 10 m in, 4! 保温。扩增体系为 20 L,内
含 1. 5 mmol /L M g2 + , 2 mmol /L dNTP, 0. 1 mmo l /L
引物, 0. 2 U Taq酶。 PCR产物扩增得到的片段,电
泳,照相,并切下目的条带回收,于 - 20! 保存备用。
1. 4 BenA3T载体的构建
回收的 PCR产物直接克隆于 pMD19T载体,
并转化 E. coli JM 110感受态细胞, 随机挑取白色菌
落进行重组子鉴定。
1. 4. 1 PCR扩增鉴定 以菌液为模板进行 PCR扩
增鉴定。其反应体系及条件同 1. 3。
1. 4. 2 重组质粒的酶切鉴定 采用碱法提取质粒
DNA,进行酶切鉴定分析。经上述鉴定均呈阳性的
克隆菌落送交上海生工生物工程技术服务有限公司
进行测序鉴定。
1. 5 BenA3表达载体的构建
将重组质粒 pMD19TBenA 3用 Sal + S ca
进行双酶切,酶切完全后切胶回收大小为 2. 6 kb大
小的片段 (含 BenA3基因 ) , pCAMB IA1300用Xho l
进行双酶切,电泳后切胶回收大片段。将回收后的
两个片段进行连接反应, 连接反应温度为 16! , 反
应体系: 1 L的 10 ∀ T4连接酶缓冲液, 1 L的 T4
DNA连接酶, 5 L的 pBenA 3, 1 L pCAMBIA 1300,
2 L的双蒸水,连接产物转化大肠杆菌 JM 110感受
态细胞后,涂板,挑取单菌落,然后进行 PCR和酶切
鉴定。
1. 6 双元载体系统的构建
提取表达载体 pCAMB IA1300BenA3质粒 DNA,
经液氮冻融法转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌
AGL1中,应用 YEB (K an+和 Strep+ )选择培养基筛
选抗性菌落,提取表现抗性的农杆菌质粒 DNA, 经
PCR验证特异条带存在,菌液经液氮速冻 - 70 ! 保
存备用,完成双元载体系统的构建。
1. 7 农杆菌的活化与培养
取- 76! 保存的农杆菌 AGL1, YEB培养基 ( Strep
30 g /mL, Kan 10 g /mL)上划线, 28! 培养 36 h。挑
取单菌落于液体 YEB培养基 ( Strep 30 g /mL, Kan 10
g /mL)中 28! 、200 r/m in震荡培养过夜。离心收
集菌体, 用 IM [ 6] 液体培养基调节 OD600至 015 -
03,然后 28! 、200 r /m in震荡培养 6 h, OD600达到
06- 08。
1. 8 绿僵菌 189的转化
用 5mL无菌水从培养 7 d的 PDA平板上洗下
绿僵菌 189的孢子, 血球计数板计数,然后用无菌水
调节孢子浓度约为 5 ∀ 106个 /mL。取 200 L活化
的农杆菌 AGL1菌液和 200 L稀释的绿僵菌孢子
悬液混合, 涂布在共培养平板 [ 6] 上的滤纸片上,
24! 共培养 60 h。将滤纸揭下,反铺到含 20 g /mL
苯菌灵和 200 g /mL头孢霉素的选择性 PDA平板
上, 28! 培养 48 h。揭下滤纸, 28! 继续培养 1- 2
d,可看到选择性平板上出现抗性菌落。挑取抗性
菌落到新的选择性 PDA平板上,产生分生孢子后进
行单孢分离,挑取单孢分离菌进行进一步筛选验证
并编号保存菌种。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
1. 9 抗性菌落的 PCR检测
抗性菌落总 DNA的提取按照 Pentt ila[ 7 ]的方法
进行, 用外源基因 BenA3的引物 P1、P2对选择性培
养基上获得的转化子进行检测。 PCR反应条件:
94! 预变性 4 m in; 94! 变性 30 s, 56! 退火 1 m in,
72! 延伸 90 s,循环 30次; 72! 延伸 10 m in, 4! 保
温。扩增体系为 20 L,内含 1. 5 mmo l/L的 Mg2+ ,
2 mmo l/L的 dNTP, 0. 1 mmo l/L的引物, 0. 2 U Taq
酶。利用 08%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR结果,
并对扩增的特异条带进行回收测序。
2 结果与分析
2. 1 载体和 BenA3基因的酶切验证
经 PCR扩增获得的 BenA3基因靶序列,连接到
pMD19T Vector后,提取重组子 pMD19TBenA3质
粒 DNA经特异引物 PCR后, 产物用 08%琼脂糖
凝胶进行电泳检测后, 用 Sal 酶切 pMD19TBe
nA 3, 由于切下的 BenA3片段与 T载体片段大小相
近, 无法获得目的片段,用 Sca + Sal 双酶切将
T载体片段切开 (图 1A ), 最大片段就是需要回收
的 BenA3 片段。用 Xho l 酶切 pCAMB IA1300
(图 1B) ,回收大片段。由于 Sal 与Xho l 为同尾
酶,所以经过二者酶切后的片段可以直接进行 DNA
连接。
A: 1. pMD19TBenA3 / Sca / Sa l ; M. Tran s2K P lus DNA
M arker
B: 1. CAMB IA1300 /X ho l ;M. T rans2K PlusDNA Marker
图 1 pMD19TBenA3(A)与 pCAMBIA1300(B )酶切电泳
2. 2 质粒 pCAMB IA1300BenA 3阳性克隆的 PCR
检验及酶切鉴定
将回收的 pCAMB IA1300大片段去磷酸化后,
与 BenA 3连接转化,转化子的菌液经 PCR扩增。
提取多个 PCR阳性克隆的质粒, 经过BamH
酶切鉴定连接产物的正反方向。若为正向连接,
双酶切产物应为 30 kb和 74 kb两个片段 (图
2A ); 反向连接的片段分别为 9 kb和 16 kb(图
2B )。
M. Trans2K P lus DNA M arker; 1.正向连接片段;
2.反向连接片段
图 2 连接产物的 PCR及酶切电泳
2. 3 双元载体的构建验证
经含有 Kan和 Strep抗生素的 YEB固体选择培
养基筛选,随机选取 2个抗性菌落提取质粒,利用 Be
nA3引物 P1和 P2对农杆菌质粒进行 PCR扩增,产物
经 08%琼脂糖凝胶电泳分离进行验证 (图 3)。
图 3 转化后农杆菌外源目的序列的 PCR后电泳
2. 4绿僵菌转化子的 PCR检测
随机选取 6株转化子, 离心收集培养好的菌
体,提取基因组 DNA并以苯菌灵抗性引物 P1和
P2进行 PCR扩增,由 PCR电泳结果 (图 4)可以看
出,都可以扩增出 26 kb左右的特异性条带, 说明
绿僵菌基因组 DNA中已经插入了苯菌灵抗性基因
BenA 3,对转化子 PCR产物回收进行测序, 测序结
果比对表明扩增出的条带与 BenA 3基因序列
一致。
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2010年第 8期 姚洪平等 : BenA3基因双元载体的初步构建及转化绿僵菌 189的初步研究
16.转化子; M. Tran s2K Plus DNA M ark er
图 4 转化子苯菌灵抗性基因的 PCR扩增结果
3讨论
本试验的目的是将植物表达载体 pCAMBIA1300
LB与 RB之间的潮霉素抗性基因 ( hph)用苯菌灵抗
性基因 ( BenA3)取代, 构建 BenA3插入载体 TDNA
区域的双元载体。本试验的难点在于启动子正向上
的潮霉素抗性基因 ( hph)左右两侧均含有 Xho l 的
酶切位点,而在外源 BenA3基因中也含有 Xho l 的
酶切位点, 无法将 BenA3基因直接克隆至载体
pCAMB IA1300, 在试验过程中, 曾尝试用 K lenow
fragment对载体片段进行末端的平齐化,与 pfu保真
酶扩增出来的 BenA3(平齐末端 )连接。但是由于
平齐末端不容易连接 [ 8] , 导致试验不能成功。在此
基础上,在外源片段中引入 Xho l 的同尾酶 Sal
酶切位点,利用同尾酶产生同样的粘性末端的原理,
保证了 BenA3的顺利插入,随之成功构建农杆菌双
元载体。
由于虫生真菌存在着对苯菌灵敏感的现象,所
以 BenA 3可以作为虫生真菌遗传转化的选择性标
记,随着农杆菌介导丝状真菌技术的不断进步,农杆
菌介导虫生真菌的遗传转化也得到了深入的发展。
选择高效的转化方法与合适的选择性标记为进一步
分离与研究虫生真菌的功能基因奠定了基础。
选择合适的农杆菌菌株对于丝状真菌的遗传转
化也有非常关键的作用, M inna Kemppainen比较了
利用 LBA1100和 AGL1转化 ectomycorrhizl symbiont
Laccarua vucolor时转化效率的差别,结果表明 AGL1
的转化效率比 LBA 1100高 4倍, 高兴喜等 [ 9 ]进行了
AGL1和 LBA4404对木霉的遗传转化试验。其中
农杆碱型菌株 AGL1能够转化木霉, 而章鱼碱型的
LBA4404转化失败。本实验室选择 AGL1进行农
杆菌双元载体的构建,并成功转化绿僵菌 189菌株,
转化子中 TDNA插入的情况对以后功能基因的研
究具有重要的意义, 研究表明, 利用农杆菌转化
L. maculans所得到的转化子 93%以上的为单拷贝插
入 [ 10] , 而本次试验中的 TDNA插入情况还有待下
一步的试验验证。
农杆菌介导真菌转化为人们从基因水平研究真
菌的遗传背景提供条件, 随着对真菌遗传转化各个
因素的深入研究,将会成为研究虫生真菌功能基因、
分离标记基因更有效的手段。
参 考 文 献
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