全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
NtSKP1基因的反义载体构建及转基因烟草的产生
张付云1 李伟1 张瑛 1 孙秋颖 1 李研 1 杜昱光 2
( 1大连水产学院,大连 116023; 2中国科学院大连化学物理研究所辽宁省碳水化合物研究重点实验室,大连 116023 )
摘 要: 根据枯斑三生烟 SKP1基因 ( N tSKP1)的序列, 设计一对分别含有特定酶切位点的特异引物, 以重组质粒
pMD18SKP1为模板, 扩增目的基因 (约 473 bp)片段。将反向目的片段插入中间载体 pHANNIBAL的内含子右侧 ,再经 No t
酶切回收约 3 443 bp的目的片段, 插入到双元载体质粒 pART27中, 成功构建了含 NtSKP1基因片段反向序列的植物表达载体
pART27skp1a,其转录产物能减弱目的基因的表达。将 pART27skp1a质粒导人根癌农杆菌 LBA4404中并转化烟草叶片细
胞, 经选择分化培养,获得转基因烟草。
关键词: NtSKP1基因 反义表达载体的构建 转基因烟草
Construction the Antisense Expression Vector of NtSKP1
and Production of Transgenic Tobacco
Zhang Fuyun
1
L iW ei
1
Zhang Y ing
1
Sun Q iuying
1
L iYan
1
Du Yuguang
2
(
1
Dalian Fisheries University, Dalian 116023;
2
Dalian Institute of ChemicalPhy sics, Chinese Academy
of Sciences, L iaoning ProvincialK ey Laboratory of Carbohydrate, Dalian 116023)
Abstrac:t According to the sequence of SKP1 fromN ico tiana tabacum var. Sam sun NN ( N tSKP1), one pa ir o f spec ific prim ers
conta in ing spec ial restriction enzym e sites were des igned. The target reverse fragm ents( 473 bp) w ere am plified and inserted into right
side of intron in interm ed ia ted vector pHANNIBAL. Then the targe t fragm ent about 3 443 bp w as cut byNo t from recomb inant inte r
m ed ia ted vector, and then cloned into binary plasm id pART27. P lan t expression p lasm id pART27skp1a, w ith reverse DNA fragm ent
o f N tSKP1 was successfully constructed. And pART27skp1a w as introduced into Agrobacter ium tum efaciens LBA4404 and then trans
form ed tobacco leaves. The transcr iptional products of the foreign fragm ent probably decrease the expression o f ta rget gene. The trans
genic plan ts o f tobacco we re obta ined.
Key words: N tSKP1 gene Construction o f an tisense expression vector T ransgenic tobacco
收稿日期: 20091130
基金项目:国家高技术研究发展计划 ! 863∀项目 ( 2006AA10A213) , ( 2007AA091601 ) ,中国科学院知识创新工程重要方向项目 ( KSCX2YWG
041, KSCX2YWN007 ),辽宁省自然科学基金项目 ( 20082153 )
作者简介:张付云,女,博士,副教授,主要从事植物抗性相关基因的研究; Em ai:l zhangfuyun2002@ yahoo. com. cn
通讯作者:杜昱光, Em ai:l duyg@ d icp. ac. cn
壳寡糖作为一种激发子,可有效地诱导植物抗
病性, 增强植物对病虫害的防御能力 [ 1 - 3 ]。壳寡糖
可以诱导烟草抗烟草花叶病毒抗性 [ 4- 7 ] ,诱导水稻
植株对稻瘟病菌的抗性 [ 8] , 诱导胡萝卜对核盘霉菌
产生抗性 [ 9]。何培青等 [ 10]研究发现,经壳寡糖诱导
番茄对番茄枯萎病菌的抑制,壳寡糖拌种还可明显
抑制油菜菌核病的发生 [ 11] ,壳寡糖水剂对小麦纹枯
病的防效可达 88. 4% - 90. 6% [ 12 ]。壳寡糖是一种
良好的生物源农药, 但壳寡糖的诱导抗性机制尚不
清楚。本实验室在用 DDRTPCR方法筛选植物诱
抗剂壳寡糖激发子诱导表达的烟草基因时, 发现用
50mg /L的壳寡糖 (聚合度为 2- 8, 脱乙酰度 90%,
平均分子量 800)处理烟草幼苗后,可诱导枯斑三生
烟 S期激酶相关蛋白 1 ( Sphase k inaseassoc iated
prote in1, SKP1)基因 ( N tSKP1)表达, 因此推测壳寡
糖诱导的抗性可能与 SKP1基因有关 [ 13]。 SKP1是
真核生物中普遍存在的一类蛋白, 通常与 CDC53P /
Cu l1 Fbox形成 SCF复合体参与泛素蛋白降解途
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
径,能够调控细胞循环、生物节律、生物抗逆性以及
雄性不育等许多重要过程 [ 14] , 目前没有对 N tSKP1
基因功能的报道。
本研究拟利用载体 pHANN IBAL和双元载体
pART27来构建能表达出 SKP1基因的反向 mRNA
的重组质粒,并用农杆菌介导法转化烟草,以期获得
能够反义封闭 SKP1基因表达的转基因植株, 为进
一步研究该基因的功能及其与壳寡糖的关系奠定
基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 供试植物、菌种和质粒 枯斑三生烟草
(N icotiana tabacum var. Sam sun NN )无菌苗,种子消
毒后种植在 MS固体培养基。培养条件:温度 25# ,
光照 12 h,光照强度 1 500 lx,长出几片叶后即可用;
质粒 pMD18SKP1为本实验室构建, 具有氨苄青霉
素抗性,包含 N tSKP1基因的完整 cDNA序列;大肠
杆菌 (E scherichia coli) TOP10由上海复旦大学顾建
新教授惠赠; pHANN IBAL质粒和 pART27由 CSIRO
P lant Industry公司惠赠; 农杆菌 (Agrobacterium tume
faciens) LBA4404为中国农业大学张宁博士惠赠;
pMD18T载体购自宝生物工程 (大连 )有限公司。
1. 1. 2 试剂 限制性内切酶、LA Taq酶、DNA回
收纯化试剂盒和 T4 DNA连接酶购自宝生物工程
(大连 )有限公司; DNA M arker ∃购自北京天为时
代科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯;溴化乙
啶 ( ethidium brom ide, EB)购自 Inv itrogen公司;引物
均由宝生物工程 (大连 )有限公司合成。
1. 2 方法
1. 2. 1 目的片段的选取及引物设计 根据 SKP1基
因的序列 ( GenBank登录号: Y702087), 并参考载体
pHANN IBAL的多克隆位点, 设计 SKP1基因编码区
( 473 bp)在植物中表达形成反向 mRNA序列的的
引物, 分别在引物的 5%端引入了 C la 和 BamH 酶
切位点 (小写部分 )。
srias: 5% ggatcc CTACGATGTCCTCCTCAA3%
sriaa: 5% atcgat TCACTCAAATGCCCAAGC 3%
1. 2. 2 反向目的片段的扩增和克隆 以质粒
pMDSKP1为模板,用引物 srias和 sriaa扩增 SKP1
基因的反向插入片段。PCR扩增反应条件为 95# ,
2 m in; 94# , 15 s, 50# , 30 s, 72# , 2 m in, 4个循
环; 94# , 15 s, 68# , 30 s, 72# , 2 m in, 30个循环;
72# 延伸 10m in。将 PCR反应的产物在 1%琼脂糖
凝胶 (含 0. 5 g /mL 溴化乙锭 )中电泳, 以 DNA
M ark∃做为分子量标准,电泳结束后在 302 nm波长
的紫外灯下观察结果拍照并从胶中回收目的片段。
将回收纯化的目的片段连接到 pMD18T载体上转
化大肠杆菌 TOP10感受态细胞,挑取单克隆提取质
粒筛选重组子命名为 pMD18SKP1a。
1. 2. 3 含有反向目的片段中间载体的构建 分别
用 C la 和 BamH 限制性内切酶双酶切 pMD18
SKP1a和载体 pHANN IBAL, 经 T4DNA连接酶连后
转化大肠杆菌 TOP10, 筛选鉴定重组子命名为
pHANN IBALSKP1a。
1. 2. 4 植物表达载体 ( pART27SKP1a)的构建及
转化 用 N ot I分别单酶切 pHANN IBALSKP1 a、
pHANN IBAL和双元载体 pART27, 用 T4DNA连接
酶连接并转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞, 用菌
落 PCR初步筛选阳性重组质粒 pART27SKP1a和
pART27pHANN IBAL, 将 PCR鉴定为阳性的克隆
提取质粒并送宝生物工程 (大连 )有限公司进行测
序。 pART27SKP1a载体构建如图 1。将筛选到的
正确克隆采用冻融法转化根癌农杆菌 LBA4404,
阳性转化菌株检测采用菌落 PCR方法, 所用引物
如下:
srias: 5% ggatcc CTACGATGTCCTCCTCAA3%
sriaa: 5% atcgatTCACTCAAATGCCCAAGC3%
35S: 5%TAAGGATCTGAGCTACACAT3%
OcsT: 5%CACAATCCCACTATCCTTCG3%
1. 2. 5 烟草叶片外植体的遗传转化及转基因植株
的筛选鉴定 农杆菌培养 [ 15] : 接种单菌落于 5 mL
的 LB培养基 ( Spec 100 g /mL, R if 150 g /mL)培
养过夜后, 以 1&100比例接种于不含抗生素的 LB
液体培养基中继续培养 5 h用于侵染。采用根癌农
杆菌介导的叶盘法 [ 16]将外源基因导入烟草组织, 并
在含卡那的 MS分化培养基上筛选转基因苗。
用 CTAB法 [ 17]从烟草叶片中分离植物总 DNA。
以转化植株的总 DNA为模板, 未转化植株作阴性对
照,用 35S特异引物 ( 5%TCTCAGAGCAGAATCGGG
TAT3%和 5%AACCATCTGTGGGTCAGCATT3%)进行
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2010年第 4期 张付云等: N tSKP1基因的反义载体构建及转基因烟草的产生
PCR扩增反应,反应条件为 94# 预变性 10 m in后,
94# 变性 1 m in, 56# 退火 1m in, 72# 延伸 2 m in, 进
行 30个循环,最后 72# 延伸 10m in。
图 1 pART27SKP1a载体构建流程图
2 结果与分析
2. 1 反向目的片段的 PCR扩增
以质粒 pMD18SKP1为模板, 用引物 srias和
sriaa扩增枯斑三生烟草 SKP1基因 cDNA编码区的
81- 553核苷酸序列。电泳检测结果 (图 2)表明,
扩增产物约为 473 bp, 与预期结果相符。
1.分子量标准 DNA M arker ∃; 2. 引
物 srias和 sriaa扩增出的目的片段
图 2 PCR扩增 N tSKP1基因反向插入片段
2. 2 重组质粒 pHANN IBALSKP1a的筛选鉴定
将扩增到的反向插入片段 SKP1a连接到
pMD18T载体上形成 pMD18SKP1a; 转化大肠杆菌
经鉴定后用 C la 和 BamH 分别双酶切 pMD18
SKP1a和 pHANN IBAL,用 T4DNA连接酶将目的片
段连接形成 pHANN IBALSKP1a。转化大肠杆菌
TOP10后,随机挑取 7个单克隆用引物 sr ias和 sri
aa进行 PCR鉴定, PCR扩增结果阳性的 6个克隆用
C la 和 BamH 双酶切鉴定 (图 3)。结果表明, 6
个克隆均含有 pHANN IBALSKP1a重组质粒, 可用
于构建植物表达载体。
1. DNA Marker∃ ; 2 - 8.重组质粒 pHANN IBALSKP1a
图 3 pHANN IBALSKP1a质粒 PCR (左 )
及 Cla 和 BamH 双酶切 (右 )结果
2. 3 重组质粒 pART27SKP1a和 pART27pHANN I
BAL的构建和鉴定
用N o t I分别单酶切 pART27、pHANN IBAL和
pHANN IBALSKP1a, 用 T4DNA连接酶将 pHANN I
BALSKP1a的 3 443 bp酶切产物连接到 pART27
上, 转化大肠杆菌 TOP10用双酶切鉴定 (图 4)。因
载体 pART27在 N ot 酶切位点下游有一 BamH
酶切位点, 结合 pHANN IBAL载体序列 ( 35S: 2 685
- 4 210= 1 345; Intron: 4 254- 4 995= 741; term i
nator: 5 049- 5 814= 765)可知,克隆 5为空载, 克
隆 1, 2, 4为顺向连接 (酶切片段 SKP1约 473 bp和
SKP1term inator约 1 300 bp) , 3和 6为逆向连接 (酶
切片段 SKP1约 473 bp和 35SINTRON约 2 200
bp) ,这是由于 N ot 单酶切导致不定向连接所致。
将 SKP1apART274送宝生物测序。序列测定结果
表明插入片段与预期结果完全一致, 并且与载体形
成了一个完整的基因表达盒。用 BamH 酶切
pART27pHANN IBAL, 正向连接应切出 750 bp
( term inate+ pART27)部分, 反向连接 2 086 bp左
右 ( Itron+ 35S+ pART27)部分, 结果表明 1号克
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
隆为正向连接 (图 5)。
1- 6.重组质粒 pART27SKP1 a 16; M. DNA M ark er∃
图 4 Cla I和 BamH I双酶切 pART27SKP1a质粒结果
1. DNA M ark er∃ ; 2- 6.重组质粒 pART27pHANN IBAL 15
图 5 BamH I酶切 pART27pHANNIBAL重组质粒结果
2. 4 农杆菌的转化及鉴定
用冻 融法 将 pART27SKP1a4 和 pART27
pHANN IBAL质粒转化农杆菌 LBA 4404, 28# 培养 2
d后,挑取单菌落分别用反向插入片段扩增引物 sri
as和 sriaa及测序引物 35S和 O csT进行菌落 PCR,
均扩增出预期大小条带 (图 6,图 7)。
1.分子量标准 DNA M arker∃ ; 2 - 4.可能含重组质粒
pART27SKP1a的菌落 1- 3, 引物为 srias和 sriaa
图 6 菌落 PCR鉴定含 pART27SKP1a
的农杆菌 LBA4404阳性克隆
1.分子量标准 DNA M arker∃ ; 2- 5.可能含重组质粒
pART27 pHANN IBAL的菌落 1- 4;引物为 35S和 ocsT
图 7 菌落 PCR鉴定含 pART27pHANN IBAL
的农杆菌 LBA4404阳性克隆
2. 5 烟草的转化及筛选
分别用含 pART27SKP1a和 pART27pHANN I
BAL质粒的农杆菌转化枯斑三生烟, 在分化培养基
上获得抗性芽,转移到生根培养基上生根,然后移载
到花盆中在温室内培养。用 35S启动子的特异引
物, 以抗性组培烟草植株基因组 DNA为模版, PCR
结果阳性,初步证明其为转基因烟草 (图 8)。
1.分子量标准 DNA M arker∃; 2.含 pA
RT27SKP1 a烟草 DNA的 PCR结果
图 8 含 pART27SKP1a的转基因烟草 (左 )
及其 PCR检测 (右 )
3 讨论
目前, 转基因技术逐渐成为功能基因组学研究
的最为有效的方法。利用转基因手段,使植物体中
过量表达或抑制表达某种基因, 通过观察转基因植
物生长发育过程中的表型突变体或植株对各种刺激
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2010年第 4期 张付云等: N tSKP1基因的反义载体构建及转基因烟草的产生
信号反应性的变化,而确定基因的生物学功能。反
义 RNA是高度特异性的基因表达抑制因子, 反义
RNA技术已经渗透到植物学研究各个领域, 在植物
生长发育基因表达调控中应用广泛 [ 18 ]。
本研究利用载体 pHANN IBAL将 N tSKP1基因
编码区的 cDNA 片段以反义方向插入 C la I和
BamH I两个酶切位点之间,使该反向 cDNA片段位
于 35S强启动子下游, 可以在转基因植株高水平转
录,与 N tSKP1基因的正向 mRNA形成双连结构被
降解, 从而有效地抑制目的基因 N tSKP1的翻译。
在此基础上将基因表达盒连接到双元植物表达载体
pART27上, 构建成该基因的植物反义表达载体
pART27SKP1a,并用冻融法将重组质粒高效地转入
根癌农杆菌 LBA4404。叶盘法转化烟草叶片, 成功
地获得了该基因的反义封闭转基因烟草植株, 为进
一步研究该基因的功能奠定了基础。从该植株表型
来看, 有一片叶子发育不正常, 预示 N tSKKP1基因
可能与叶片发育有关, 对转基因烟草植株的其他表
型和生理特性研究正在进行中。
致谢: 感谢 CSIRO P lant Industry公司惠赠的 pHANNI
BAL质粒和 pART27质粒。
参 考 文 献
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