全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-28
基金项目:国家自然科学基金项目(30471075);扬州大学高层次人才科研启动基金项目(2005)
作者简介:黄洁(1981-),女,硕士,研究方向为作物分子细胞遗传学
通讯作者:陈建民,Tel:0514-87979286,Fax:0514-87991747,E-mail:jmchen@yzu.edu.cn
基因枪和农杆菌介导是当前植物遗传转化常用的 2种方法。不同的转化方法将产生大小不同、复杂程
度不同的转基因座位结构,目前有关转基因座位结构的初步认识有如下几点:(1)单拷贝和多联体
(concatemers)随机整合产生位点族,其间有短的基因组 DNA;(2)几个位点族由大的基因组 DNA片段分隔
而相邻存在,紧密连锁,遗传上仍为单位点分离;(3)单拷贝和多联体可以独立地在相同染色体或不同染色
体的一个以上位置进行整合,其遗传分离以独立位点进行[1]。基因枪法通常产生多拷贝的复合转基因座位,
整合位点中转基因的拷贝数有 1~20不等,多拷贝的转基因通常集中存在于单位点,座位中通常有基因组
片段穿插其间[2~4],将转基因分隔。而农杆菌介导的转基因座位一般为单拷贝,且具有比较明显的左右边界[5]。
研究转基因座位的结构对进一步认识转基因整合机制、了解转基因座位结构与基因表达的关系,转基因结
构与转化方法的选择,载体结构对转基因座位结构的影响具有重要的理论和实践意义。通过基因枪法获得
的 4种不同表达水平的转 gfp基因大麦材料,采用质粒营救法从基因组中回收转基因座位 DNA序列及其
旁侧片段,分析转基因座位结构,现将结果报道如下。
大麦转基因座位结构的研究
黄洁 1,2 赵梅香 1 肖宁 1 夏瑞祥 1 洪义欢 1 陈建民 1
(1扬州大学生物科学与技术学院,扬州 225009;2苏州市农业技术推广中心,苏州 215000)
摘 要: 利用质粒营救法获得基因枪法转化的4种转绿色荧光蛋白基因(greenfluorescentprotein,GFP)大麦的转
基因座位序列,序列分析显示4种材料的转基因座位中均有完整载体的串联重复现象,表明转基因整合是同源重组的结
果。同时转基因座位中也存在不完整载体片段、基因组片段的混杂排列,说明转基因整合时也发生异常重组。微粒轰击的
转基因整合是由异常重组和同源重组共同完成的。
关键词: 转基因座位 质粒营救 同源重组 异常重组
StructureofTransgenicLociinTransformedBarley
(HordeumvulgareL.)
HuangJie1,2 ZhaoMeixiang1 XiaoNing1 XiaRuixiang1 HongYihuan1 ChenJianmin1
(1ColegeofBioscienceandBiotechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009;2AgriculturalExtensionCenterof
Suzhou,Suzhou215000)
Abstract: Fourtransgenicbarleylines(A,C,D,F)withdiferentexpresionlevelofgreenfluorescentprotein(GFP)
wereresearchedfortransgeniclocibyplasmidrescue.Thesequencingresultsofpositiveclonesshownthattherewere
completevectorsequenceswithclusterrepeatintransgeniclociresultingfrom homologousrecombination.Inaddition,
transgeniclociwerecomposedofinterspersedfragmentsofincompletetransferDNA,genomicDNA.Thetransgenewas
integratedintochromosomethroughilegitimaterecombinationalso.Thehomologousrecombinationandilegitimate
recombinationplayedaroleintransgeneintegrationbyparticlebombardment.
Keywords: TransgeniclociPlasmidrescue Homologousrecombination Ilegitimaterecombination
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
图 1 pAct1IsGFP-1、pMON30049载体结构图
1 材料和方法
1.1 材料
通过基因枪转化获得的转绿色荧光蛋白基因(gfp)大麦
株系 A、C、D、F,由加拿大 Guelph大学 Dr.KenKasha提供。
A、C株系由包含 sgfp基因(~720bp)的载体 pAct1IsGFP-1转
化而来,D、F株系由包含pgfp基因(~930bp)的载体pMON30049
转化而来[6](图 1)。
1.2 PCR扩增
扩增 A、C株系的 sgfp所用的 PCR引物为(F)5′-GCGACGTAAACGGCCACAA-3′;(R)5′-CCAGCAGGAC
CATGTGTGATCG-3′,预期扩增片段大小为 606bp。扩增 D、F株系的 pgfp的 PCR引物为 (F)5′-GGTG-
GAACTGGATGGTGATGTG-3′;(R)5′-ACCTTGATGCCGTTCTTCTGC-3′,预期扩增片段大小为 600bp[6]。PCR反
应体积为 10μl,反应体系中包含 0.5μM引物,0.2mM的 dNTPs,1.5mMMgCl2,0.5UTaq酶和 100ng模板
DNA。反应程序为 94℃2min,1个循环;94℃30s,58℃30s,72℃45s,35个循环;72℃2min延伸。
1.3 点渍杂交鉴定
以地高辛标记的载体 pAct1IsGFP-1DNA为杂交探针,标记方法按 Roche公司 No.11745816910试剂盒
说明步骤操作。对质粒营救法获得的阳性克隆进行 PCR扩增,无预期扩增片段的阳性克隆提取质粒 DNA,
质粒 DNA于 100℃变性 10min,迅速冰置 5min,各取 1μl点膜,以载体 pAct1IsGFP-1作为对照。样本膜经
80℃烘烤固定 1h后进行杂交,杂交检测方法参照 Roche公司 No.11745832910试剂盒说明步骤进行,预杂
交 4~5h,杂交 16~20h,杂交后洗膜,显色。
1.4 Southern杂交检测
依 CTAB法分别提取不同大麦转化株系的基因组 DNA,以限制性内切酶 KpnI、NcoI和 HindII
(Takara)分别对 5μgA、C及 D、F株系基因组 DNA进行酶切,将完全酶切的产物电泳分离后进行 Southern
吸印和分子杂交。杂交信号检测的具体方法参照 Roche公司 No.11363514910试剂盒说明程序进行。
1.5 质粒营救法获取转基因座位序列
各转基因株系分别取 5μg基因组 DNA,在 50μl反应体积中用 20U内切酶,37℃消化过夜。以内切酶
KpnI、NcoI、XhoI对 A、C株系进行酶切,BamHI、EcoRI、HindII对 D、F株系进行酶切。酶切完全后用苯酚、
氯仿纯化,1/10体积的 3MNaAc和 2倍体积的无水乙醇沉淀回收酶切产物。以回收产物进行自连接,
200μl自连接反应体系中加 2μlT4DNA连接酶(Takara,350U/μl),15℃连接过夜。电击转化(200Ω,1.7KV,
25μF)E.coliDH5α。转化液涂布在含有不同抗生素(50mg/L)的培养基上,37℃培养 16h筛选阳性克隆(A、C
株系加氨苄青霉素,D、F株系加卡那霉素)。分别以扩增 sgfp和 pgfp的 PCR引物对提取的阳性克隆质粒进
行扩增,挑选有预期扩增片段的克隆进行测序。对无 PCR扩增片段的阳性克隆,则以转化载体为探针进行
点渍杂交鉴定,有阳性杂交信号的克隆也分别进行测序。
2 结果与分析
2.1 营救质粒
不同的内切酶单酶切之后,连接环化,进行质粒营救,A株系获得 95个阳性克隆,C株系获得 22个,D
株系获得 26个,F株系获得 7个(表 1)。在营救质粒所用基因组 DNA总量基本相同,操作条件一致的情况
下,A株系得到的阳性克隆比 C株系多,这一结果意味着 A株系基因组中转基因座位的结构一致性程度
比较高,有利于获得较多的阳性克隆。不同株系及不同的酶切所获阳性克隆数不同,某种程度上反映了株
系间转基因座位结构的差异性。
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2.2 PCR扩增
用相应的 gfp引物分别以 A、C、D、F株系基因组 DNA为模板进行 PCR扩增。结果显示 4株系中均有
600bp左右的预期条带扩增,进一步说明 gfp基因已经成功转化到大麦的基因组中(图 2A)。用相应的 gfp
引物对挑选的阳性克隆进行扩增,PCR结果显示大多数的阳性克隆均能扩增 gfp基因的相应片段(图 2B),
但也有少部分阳性克隆没有扩增产物,如 A株系 A-N1、A-N2、A-N3、A-X3,C株系的 C-K4、C-X3。而 D、F
株系中得到的所有阳性克隆均有预扩增片段。
表 1 质粒营救的阳性克隆分布
图 2 gfp基因的 PCR扩增结果
(A)M:DL2000marker;1~4:分别为 A、C、D、F株系;5:阳性
质粒对照 (B)M:DL2000marker;1:阳性对照;2:A-K1;3:
A-X1;4:C-K1;5:C-N1;6:D-B1;7:D-E3;8~10:依 次 为 F-
E1、F-E3、F-E6
对无 PCR扩增产物的 6个阳性克隆(A-N1、A-N2、A-N3、A-X3、C-K4、C-X3)进行点渍杂交,杂交结果
显示 6克隆均有染色较深的杂交信号(结果未给出)。表明这 6个营救的质粒存在与载体同源的片段,可能
丢失了 gfp基因部分,也可能 gfp基因序列发生了变化。
2.3 Southern杂交
A株系基因组 DNA以 KpnI酶切,C株系由 NcoI酶切,以载体 pAct1IsGFP-1为探针,Southern杂交结果
显示 (图 3),A株系具有 2条较为清晰的条带,大小分别为:
7kb、5kb左右,C株系则有 4条可分辨的条带,分别为 10kb以
上、10kb、4kb和 3kb。D、F株系基因组都以 HindII酶切,以载
体 pMON30049为探针进行 Southern杂交。D株系条带大小分
别为 8kb和 5kb左右;F株系条带分别为 5kb和 4kb。根据
Southern结果显示的杂交条带可以判断,A和 C株系中插入的
转基因拷贝数不同,杂交条带可以为完整的转基因片段(A株
系中 5kb的条带),也可以为不完整片段(C株系中的 4kb和 3kb的条带)。来自 C株系的阳性克隆 C-K6序
列(5341bp)分析显示转基因座位中有完整的载体片段(序列未给出),但是 Southern杂交结果未显示与载
体大小相似的条带,可能与 C株系基因组 DNA发生部分降解有关。D和 F株系中杂交条带都有完整的转
基因片段(5kb),也有非转基因片段(D株系中的 8kb、F株系中的 4kb条带)。从显示的杂交条带数目和大
小均表明转基因大麦中都有较复杂的转基因座位结构,转基因均为多拷贝插入。
2.4 部分阳性质粒序列
从选择的阳性克隆中提取质粒进行测序,A株系挑选了 4个阳性质粒(A-K2、A-K18、A-N1、A-X3)。序
列比对分析显示 A-K2和 A-K18序列与转化载体 pAct1IsGFP-1的线性序列同源(图 4b),A-N1、A-X3由于
GC含量高未获得序列结果。来自 C株系的 C-K6序列分析表明与载体也具有相同的线性结构。图 4b是 A
株系部分转基因座位结构,该片段全长 5341bp,线性序列与载体完全相同,因为酶切采用的是载体上的单
酶切位点的酶,却营救到完整载体序列,表明转基因是以同向相连的线性多拷贝形式插入到基因组中,转
基因座位中存在载体的串联重复现象。同样的转基因座位结构形式也存在于 C、D和 F株系中(图 4e),表
明基因枪法获得的转基因植株中载体序列及转基因在受体基因组中的整合存在方式常以串联重复而存
图 3 A、C、D、F株系的 Southern杂交结果
黄洁等:大麦转基因座位结构的研究 111
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
在,其整合过程与同源重组有关[7]。
C株系的 C-K4和 C-X3序列具有相似的线性结构,但
与载体的线性结构仅部分相同,其中出现了基因组 DNA
的插入(图 4c)。C-K4全长 6351bp,其中包括复制起始、氨
苄抗性基因、不完整的载体片段和未知序列(大麦基因组
DNA)。整个结构是由载体片段和大麦基因组片段相间混
杂排列而成。插入的载体片段是不完整、不连续的,长度各
不相等,分别为(J2-J3):1940bp,与载体上 700~2640bp处
同源;(J4-J5):224bp,与载体上 2644~2868bp处同源;
(J6-J7):158bp,与载体上 90~248bp处同源。插入的基因组
片段长度也各不等,(J1-J2):780bp;(J3-J4):1123bp;(J5-
J6):462bp;(J7-J8):1589bp。Svitashev等[5]认为直接 DNA
转移法通过转基因整合受体基因组产生转基因座位,是以
转基因片段和受体基因组片段共同作为碎片,一起修复受
体基因组内的双链断裂(double-strandbreak,DSB)而形成,
往往造成转基因的串联重复、不完整转基因片段、基因组
片段的相间排列。究其分子机制,前人认为是微粒轰击转
化植物细胞时会激发损伤反应,激活受体基因组的核酸酶
和 DNA修复酶,导致大部分外源 DNA被降解,小部分外源 DNA可能作为 DNA异常重组修复的底物,引
起大规模的受体基因组和外源 DNA的整合重排[8]。本研究结果中也发现了转基因座位序列混杂排列的现
象,因此认为这种现象也可能是由转基因整合时异常重组产生的[9,10]。
阳性克隆 D-H5(图 4f),全长 5019bp,比载体小 261bp,序列比对结果显示缺失发生在 HPS70intron内
部。
3 讨论
无论是农杆菌介导还是微粒轰击都会产生复杂的转基因座位结构,而且可以认为转基因座位的复杂
性依不同的座位而异。研究异源六倍体燕麦[5]和二倍体水稻[10]的转基因座位都发现了复杂的转基因座位结
构。本研究对 A、C、D、F株系的转基因座位序列分析结果显示都有完整载体的串联重复现象,该现象在小
麦中也存在[11],因此这可能是微粒轰击产生的转基因座位结构的 1个共同特征[5]。通过微粒轰击的方法获
得的转基因座位结构存在转基因片段和基因组片段的混杂排列现象,表明了转基因座位结构的复杂性,认
为这些都与转基因整合时的异常重组有关[9~11]。
完整转基因片段的存在是转基因正常表达的基本前提条件之一,分析营救的质粒结果表明 A、C和 F
株系都有完整的转基因片段插入,与 A、C、F株系转基因表达正常相一致。从 D株系营救的质粒载体片段
中发生了部分缺失,而 D株系转基因表现沉默。本研究的 D株系中片段缺失与转基因沉默相吻合,从现象
上可见转基因的表达与转基因片段的完整性有密切的关系,但从 D株系营救的质粒中也有结构完整的载
体,因此以缺失引起转基因沉默的理由还不够充分。gfp基因的物理定位结果表明 D株系插入的位置不同
于 A、C和 F株系,推测 D株系的转基因沉默存在位置效应的因素[12]。除了上述 2种影响基因沉默的可能
因素外,可能还有其它影响基因正常表达的因素存在。
以转基因载体为探针进行 Southern杂交,结果显示不同株系具有不同的杂交条带数,尽管条带数很难
说明 gfp基因的拷贝的准确数目,但可确定本研究所用转基因材料中转基因都是以多拷贝插入基因组。受
体遗传背景相同,不同转基因株系的差别其实就是 gfp基因的拷贝数不同,转基因座位结构不同,以及插
图 4 A、C、D、F株系转基因座位的线性结构分析
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入染色体的位置不同。Southern杂交结果显示 C株系的条带数比 A株系多,即 C株系中 gfp基因的拷贝数
比 A多,已有研究表明 C株系的 gfp基因的表达量高于 A株系[12],似乎表现了基因拷贝数和基因表达的正
向线性关系。D、F株系中的 Southern杂交条带数一致,物理定位却表明 F株系中 gfp基因是插入 2条不同
的染色体,F株系的 gfp基因表达强,D株系表现沉默[12],这似乎又否定了前一种推论,因此说明转基因拷
贝数与转基因表达具有复杂的关系。例如水稻中转基因拷贝数增加并不导致基因表达下降或基因沉默,4~
5个拷贝的表达水平与 1~2个拷贝相同[13]。微粒轰击和 PEG介导获得的转基因马铃薯,其转基因拷贝数与
GUS高水平表达没有关系[14]。但黄金稻胚乳中转基因高拷贝却对应于 β-胡萝卜素(β-carotene)高表达[15]。
水稻转基因稳定性明显和转基因结构有关,完整的转基因结构才能稳定表达,一个或多个重排的转基因拷
贝将严重导致基因沉默[16]。
质粒营救法是一种经典的获得转基因座位序列的方法,前人利用该法获得了多种转基因植物座位序
列[17~20],但这种方法也存在局限性。首先,通过抗性基因筛选的前提是抗性基因能正常表达,这就要求转入
受体基因组的抗性基因和复制起始点的序列完整存在。由于微粒轰击导致的转基因座位结构较复杂,对转
基因株系基因组酶切后产生的目的片段中,必须含有完整的抗性基因和复制起始点才有可能被营救到,因
此插入的目的基因片段可能因为抗性基因或复制起始序列的丢失或突变而不能通过质粒营救的方法得
到。其次,自连接片段的长度直接影响实验的结果。Behringer等[17]认为营救效率和营救质粒片段大小成反
比,片段愈大,营救效率就愈低,这就要求尽可能减小目的片段的长度。Southern杂交结果显示,4种材料中
存在多种不同的转基因座位,而营救到的可能是其中的一部分,还有一部分转基因座位片段未能获得,可
能与这些片段中没有抗性基因或复制起始点、片段太大等因素有关。
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