全 文 ：生物杖术通报
· 研究报告 · 刀了口
百
付
口乙口



 


  年增干


禽网状内皮组织增生症病毒
 , 基因的原核表达及检测
牛星 韦平

厂一西大学动物科技学院 ,南宁
 盼

摘 要
根据禽网状 内皮组织增生症病毒





 株的前病毒基 因组

 序列 , 设计并合成
时引物 ,
以

 株前病毒


 全基因组克隆为模板 , 通过


技术扩增 出该病毒囊膜糖蛋白 。二 基因部分片段 。 将


产物按正确 的阅读框架定向克隆进


 石
一
载体中谷胧甘肤一
一转移酶



 的下游 , 将重组质粒转化进宿主菌



中,在







盯


 ℃
诱导下 , 。二基 因部分片段 以 融合蛋白的形式获得 了良好的表达 。 表达产物经
聚丙烯酞胺凝胶电泳鉴定 , 确定其表达的融合蛋白相对分子质量为


, 并经



一

 检测 , 发现在

 目标
条带处呈现一棕红色印迹。
关键词
禽网状 内皮组织增生症病毒 。二基因 融合蛋白 表达 间接 荧光























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邵

 动



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ore scre nce assay/ IF A
禽网状内皮组织增生症病毒(re tieu一oend othe一10-
si vi ru s , R E V ) 主要侵害火鸡 , 也能感染鸡 、鸭等禽
类 , 引起以淋巴一网状细胞增生为特征的肿瘤性病理
综合征 。 目前已分离到的 R EV 有 30 多株 , 虽然不
同毒株的致病力不同 , 但均具有相似的抗原特性 。
R E V 感染后 , 禽生长迟缓 , 淘汰率和死亡率升高;引
起感染禽的免疫抑制 , 干扰其他禽病疫苗的免疫效
应 , 导致免疫失败 。 因此 , R E V 是继 马立克氏病病
毒(M D V ) 、禽白血病病毒(A LV )之后又一重要的禽
致瘤病毒 。
在我国 , 由 R EV 造成的鸡群免疫抑制越来越显
得重要 。 该病毒的 e二 基因与产生中和抗体有关 。
由于不同的毒株具有相似的抗原性 , 并且针对某一
毒株的抗体也可对其他毒株产生交叉反应 。 因此 ,
可以设想体外表达 R EV 某一毒株的 e二 基因产物 ,
免疫机体产生的抗体可 以保护鸡群对其他 R EV 毒
株的感染 。 。二 基因编码 R EV 的表面蛋白和穿膜蛋
白 , 该蛋白的 C 一末端表位位于感染细胞的表面 , 含
有顺序和构象表位 , 是病毒的免疫显性蛋白 , 能够激
发感染宿主产生中和抗体 。 如果将 REV 某一毒株
作者简介:牛星 (1981 一 ) , 女 , 山东安丘 , 在职硕士研究生 , 主要从事禽类病毒分子生物学研究
通讯作者:韦平 , 男 , 教授 , 博士生导师 , E 一 m al : p in gw ei s @ e y ou . c o m
年增干IJ 牛星等:禽网状内皮组织增生症病毒 e二基因的原核表达及检测 297
含有 gP 90 的 e二 基因在大肠杆菌中进行表达 , 制备
多抗血清或单抗 , 即可用于 RE V 感染的诊断或流行
病学调查 。
1 材料与方法
1.1 质粒和菌株
含有 R EV SN v 株前病毒基因组 cD NA 的质粒
和表达性载体 pG EX石P 一 1 以及宿主菌BI2 1 , 为本实
验室保存 。
1
.
2 试剂
Ta q 酶 、T4 D N A 连接酶 、限制性内切酶等 , 均购
自大连宝生物工程有限公司;酶标羊抗鼠 IgG 二抗 ,
购自Si gm a公司 。 小质粒提取试剂盒和回收试剂盒
均购买自大连宝生物工程有限公司 。
1
.
3 P C R 扩增
1.3.1 引物的设计 参照已发表的 e二 序列 ,设计
1对引物 。 上游引物为 5气C C G G A A T C G C C A T C -
c TA c A G A A A A c A A A
一
3
‘ , 下 游 引 物 为 5 ‘-
C G A C T C G A G G A A C A
AT
A T G A G C C C A A A C A
一
3
’ , 并
在引物中分别添加了 Ec 0R I 和 Xh ol l位点 , 引物由
博尚展新生物技术有限公司合成 。
1
.
3
.
2 P c R 及产物回收 按常规方法进行 。 反应
体系:模板 l林l 、上游引物0 .5林l 、下游引物 0.5 林l、
M g C 1 2 1
.
5 林l、 1 0 x 肠ading Bufe r2 .5卜l 、 d N T PZ 林l 、T a q
酶 0.5闪 、补水至总体积 25 闪;反应参数 :95 ℃s m in
后 , 按照 95℃ lm in 、5 6 ℃ lm in 、 7 2 ℃ 905 进行 30 个循
环 , 最后在 72 ℃ 延伸 10 m in 。 P C R 产物经 0.8% 琼
脂糖凝胶电泳 , 确定其大小后回收 。
1
.
4 重组质粒的克隆与鉴定
1.4 .1 将回收的 PC R 产物与载体 pGE X石P 一 1 分别
经 Ec oR I和 Xh ol l双酶切后 回收 , 按常规方法进行
连接 、转化宿主菌 BIZ I , 通过氨节青霉素抗性和限
制性内切酶筛选 , 将所得到的阳性克隆经测序验证
其阅读框架 。
1
.
4
.
2 用已设计的引物对含有 R EV 前病毒全基因
的克隆进行 PCR 扩增 , 反应体系:模板 1闪 、上游引
物 0 .5林l 、下游引物 0 .5林l 、 M g C 论1. 5 林l 、 1 0 x L o a d -
i n g B u
fe 己.5 林l、 d N T 咫林l 、 T a q 酶 0 .5 林l、补水至总体
积 25林l ;反应参数 :95℃ s m in 后 , 按照 95℃ lm in 、
5 6 ℃ lm in 、7 2 ℃ 9 0 5进行 30 个循环 , 最后在 72℃ 延
伸 ro m in 。 P C R 产物进行 0.8% 琼脂糖凝胶电泳 。
1
.
4
.
3 将上述提取到的重组质粒 10 闪用 X H OI 、
E e o R I 双酶切 , 采用 40卜l反应体系 。
侃耐恻3ml骊质粒 DN AK B ufe r
ddH 20
X H O I
E C O R I
酶切时间 :37 ℃ 3 h 。 终止剂:1/10 体积的 10 x
B诚r。 取 5闪反应产物在 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 。
1
.
5 重组质粒的诱导表达
将重组质粒转化宿主菌 BI2 1 , 挑取单个菌落接
种于含氨节青霉素的 LB 培养基中 , 37 ℃过夜摇振培
养 。 次日按 1:10 转接种于含氨节青霉素(lo m岁
L) 的 LB 培养基 中 , 37 ℃ 培养 sh 后 , 取 出加 人
100m m oF LIPT G 至终浓度为 lm m oF L , 3 7 ℃ 继续诱
导培养4h , 取出备用 。
1
.
6 重组菌菌体的裂解及凝胶电泳
1.6 .1 重组菌菌体的裂解 将重组菌诱导产物离
心后 , 将沉淀菌泥用 PBS (pH7.4) 悬浮 , 加人等体积
的 2 x SD S裂解液 , 煮沸 ro m in , 置于 一 20 ℃备用 。
1
.
6
.
2 菌体裂解物的凝胶电泳 按常规方法制备
ro % 的分离胶和 5% 的浓缩胶 。 将处理好的样品
(包括作为对照的非重组的 pG Ex石P 一 1 菌体裂解物
及未经 I件G 诱导的重组载体质粒转化菌裂解物) ,
各取 20 闪上样 , 进行 120 V 电泳 Zh 。 电泳结束后 ,
置于考马斯亮蓝染色液中染色 Zh , 转移到脱色液中
脱色 。
1
.
7 重组菌表达产物抗血清的制备
1. 7. 1 重组菌表达产物的回收 将大量制备的
重组菌裂解物进行 SD S 一P A G E 电泳 , 考马斯亮蓝染
色液染色后 , 脱色液脱色 , 参照 M ark er 的大小 , 切
下相对分子质量约 72 00 的条带 , 冻干并碾成粉
末 。
1
.
7
.
2 免疫小鼠 将碾成粉末状的表达产物用
PBS 悬浮 , 腹腔注射于 2 只健康的 IC R 小鼠 , 每只
。.2 m l (约 20 林g ) , 每周免疫 1 次 , 免疫 5 次后 , 摘
峨物杖术通银 B 勿te eh n oto gy B u le 瓦n 20 08 年增刊
眼球采血 , 分离血清 , 置于 一加℃备用 。 冲液(pH S.2) , 恒压 70 V 转印Zho
1.8 间接免疫荧光试验 染色:转印结束后取出 N C 膜晾干后 , 浸人 l x
将 REV SNV 株接种于 % 孔板中的单层鸡胚成 丽春红染色液对膜上的总蛋白进行染色5 一 10 m in ,
纤维细胞(C EF ) , 维持 7d 后 , 甩去培养基 , 用预冷 取出于蒸馏水中漂洗至条带清晰 , 检测转印效果 , 并
的丙酮/乙醇(3:2) 固定后 , 同时以未感染病毒的 用标记笔标出蛋白质标准分子量 。
c E F 作对照 , 。 检测:将丽春红染色后的 N C 膜转移至封闭液
将制备的上述鼠抗 R EV 血清作 l: ro 的稀释 , 中 ,室温轻摇 1 一 1 . s h 后 4℃封闭过夜 , 倾去封闭
吸取一定量的抗体加人接种 RE V 的单层鸡胚成纤 液 , 用洗涤液 PBS 一T 洗膜 3次 ,每次5 m in , 然后加入
维细胞(CE F) 板孔中和未感染病毒的 CE F 作对照 适当稀释度的鼠抗 RE V 一抗体溶液 (以封闭液
孔中 , 置于 37 ℃作用 45 m in , P B S 洗涤 3 次 , 加人 1 1: 10 稀释的抗 RE V 标准阳性血清 )中 , 室温下振: 150 稀释的异硫氰酸荧光素(FITC )标记的羊抗鼠 荡 1.5 一 Z h ; P B S 一 T 洗膜 3 次 , 每次 10 m in , 然后加
IgG ,
50 闪/孔 , 置于 37 ℃作用 45 m in , P B S 洗涤 3 次 , 人适当稀释度二抗溶液 (以封闭液 1: 40 稀释的
加覆 50 % 甘油的 PBS , 在荧光显微镜下观察 。 H R P 一羊抗鼠 IgG 酶标二抗 ) , 室温振荡 1.5 一 Z h ;
1
.
9 重组蛋 白的 w es te m 一b l ot 分析 PBS 一T 洗膜 3 次 , 每次 10 m in , 然后置于底物溶液中
转印:裁剪大小与凝胶面积一致的 W ha tm an 滤 显色 , 条带清晰后迅速用蒸馏水终止显色反应 。
纸 6 张和硝酸纤维素膜(N C 膜 )l 张 , 于转印缓冲液 2 结果
中浸透(需要大约 20 m in 左右)。 转印电极装置从 2.1 重组克隆的测序结果
负极到正极依次放置海绵垫 、滤纸 、凝胶 、 N C 膜 、滤 所得到的阳性克隆送交北京博尚展新生工公司
纸和海绵垫 , 放置时用试管轻轻滚动排除所有气泡 。 进行测序 , 测序结果如下 。
固定好转印电极后 , 将电极插人电转槽 , 注满转印缓
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年增刊 牛星等:禽网状内皮组织增生症病毒 。二 基因的原核表达及检测 29 9
序列分析发现 , 测序结果与已经发表的 SN V 株
en :基因序列一致 , 没有发现由于 PC R 的原因而引
起的碱基突变 , 而且阅读框正确 。
2
.
2 重组质粒的鉴定
2 .2. 1 P C R 检测 PCR 产物经 0 .8% 琼脂糖凝胶
电泳结果表明 ,所得的 PCR 产物的分子量大小为 1
20 0b p , 该 DNA 条带大小与理论设计的核酸片段大
小相符 ,结果见图 1 。
2
.
2
.
2 酶切鉴定 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回
收 , 与载体连接 , 转化大肠杆菌感受态细胞 , 挑取单
个菌落进行筛选 、鉴定 , 最后获得数个克隆 , P G E X -
6 P
一
l
一e n 。即90 ,结果见图 2 。
2
.
3 重组菌菌体裂解物的凝胶电泳
与非重组的 pG EX石P 一1 菌体裂解物相 比 , 重组
菌裂解产物在相对分子质量约 72kD 的位置额外出现
1条蛋白条带 , 而相对分子质量约 29 kD 的 G ST 条带
消失 ,其他蛋白带未出现任何变化 ,结果见图 3 。
图 3 菌体裂解物的凝胶电泳结果
1:I脚c 诱导的 pG E x石P 一1 质粒裂解物
2 :重组菌菌体裂解物的SD S一 PA C E 标准蛋白分子量标
记;3 、4 : I盯G 诱导的重组菌菌体裂解物
图 1
D[2 0(刃 一 M a r k e r ; 2 一 3 .
P C R 扩增
PCR 产物(1 20() )bp
2 .4 间接荧光试验
2.4 .1 用制备的抗血清作 1:10 倍稀释 对 R EV
感染鸡胚成纤维细胞 (CE F) 进行间接免疫荧光实
验 。 结果显示 , R E V 感染鸡胚成纤维细胞(CEF )发
生阳性反应 , 而未感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF )无
特异性荧光出现 , 表明制备的多抗效价已达 1:ro ,
且特异性强 。 结果见图 4 。
图 4 1 :ro 抗血清染色出现的感染
图 2
D匕000一 M a r k e r ; 2 一 3
酶切鉴定
酶切产物 2
.4 . 2 W e stern
病毒细胞出blot分析 现的荧光W estern 一b l o t 检测结果
生物杖术通报 B to te chn ole gy 20 08 年增刊
图5 阴性对照
表明 , 在 目标条带72kd 处出现一棕红色印迹 , 结果
如图 5 。
图6 W estem 一b l o t 结果
1:IPTC 诱导的重组菌菌体裂解物
2:1盯C 诱导的pG EX 石P 一 1 质粒裂解物
3:重组菌菌体裂解物的 SD S一 P A C E 标准蛋白分子量标记
3 讨论
3.x 禽网状内皮组织增生病病毒(R etieuloendothe-
110515 V iru ses, R E V
) 可感染多种家禽和野鸟 , 在不
同的群体可有不同的病变表现 ,诸如肿瘤 、生长迟缓
或免疫抑制综合征等(W ite r, 19 83 ) 。 R E V 感染在
我国非常普遍 。 它是造成疫苗污染的最常见的外源
病毒 , 它与其它病毒共感染时可造成鸡群的免疫抑
制加重 , 从而降低多种灭活疫苗的免疫效力 , 也常与
其它肿瘤病毒混合感染后大大提高了肿瘤的发病
率。 因此 , R E V 感染已在我国养鸡业中造成很大危
害 , 对其 env 表达蛋白的研究将有助于我们认识其
危害并为最终控制 RE V 提供科学依据。
3
.
2 大肠杆菌表达载体是一个较为成熟的原核表
达系统 ,利用这个载体成功的表达了许多外源基因 。
p G E X 系列是其中的一种较为常用的载体 , 它是一
种融合蛋白表达载体 , 它含有一个编码谷胧甘肤 S
(琉基 )转移酶(GST) 的开放阅读框架 , 其下游为限
制性内切酶位点区 。 它的启动子为乳糖操纵子
(肠c)和色氨酸(饰)组合的杂合启动子 (Ta c ) , 启
动效率比其中任何单一启动子高4 一 5 倍 。 当未加
I盯G 时 , La c 阻蛋白(La d 基因的表达产物 )与 Ptac
杂合启动子结合 , 阻止 G ST 融合蛋 白表达 , 但 经
IPr G 诱导后 , 发生解阻作用 , 使得 G ST 融合蛋白得
以表达 。 该体系具有蛋白表达产率高、表达产物纯
化方便 , 以及利于抗体制备等特点 。 G S T 融合蛋白
可溶于水 , 可从细菌裂解液中提取 , 在不变性的条件
下通过亲和层析得到 。 G S T 融合蛋白可被位点特异
性蛋白酶裂解 , 从而除去 G ST 蛋白 。 实验所用载体
pG EX 将外源基因克隆到强启动子下游 , 经 I盯G 诱
导表达后 , 可显著提高融合蛋白的表达产率。
3
.
3 该研究以 R E v SN v 株的前病毒全基因组克隆
为模板 , 通过 PCR 扩增出该病毒囊膜糖蛋白en 。基
因部分片段 , 并将该片段定向克隆进 pGE x一P 一 1 载
体中谷胧甘肤一 S 一转移酶 (G ST )的下游构建成了重
组质粒 , 该质粒转化进宿主菌 B皿1 中后 , 在 H 盯G
的诱导下 , 。n : 基因成功表达了融合蛋白。
3
.
4 用 REv sN v 株免疫小鼠制备了多抗血清 , 通
过间接免疫荧光试验证明 , 该抗体活性高 、特异性
强 。 另外 , 用制备的多价抗体对 RE V e二 基因的表
达蛋白进行了 W es te m 一 b l ot 检测 , 结果显示 , 在 72kd
目标条带处出现一条较清晰的棕红色印迹 , 证实了
表达产物的特异性 , 同时表明制备的多抗具有很好
的生物学活性(但用单抗进行的 W es te m 一bl ot 目标
条带显色却不明显 , 图未列出) 。
3
.
5 囊膜蛋白是糖蛋白 , 包括 en :基因编码的 2 个
糖蛋白即90 和 即20 (Tsai et al . , 1 9 8 6 ) 两条肤链 , 较
小的 gP 20 贯穿病毒的囊膜 , 称为穿膜蛋白(TM ) , 较
大的 gP 90 通过二硫键和氢键与 TM 相连 , 暴露于囊
膜之外 , 称之为表面蛋白(SU ) , T M 和 SU 是 。n : 基
(下转第306 页 )
生物技术通报 B io te ch no to gy B “le 血 2008年增刊
Jian g Y L , L I N , W u C X . J o u rn al Of A 颤eultu司 Bio一T e e h n o l o留 ,
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010群 Part B , 2 《刃2 , 1 3 1 : 7 9 4 一 8 0 5 .
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:
5 6 7 5
一 5 6 7 9
.
( 上接第300 页)
因编码的前体蛋白经水解后产生的 。 其中gP 90 作
为病毒的囊膜外糖蛋白 , 是 R EV 的免疫显性蛋白
(Davidson et al. , 1 9 9 5 ) , 且具有病毒的型特异性
(C hen etal. , 1 9 8 7 ) ; g p 9 0 还是诱导宿主产生中和抗
体的主要蛋白质 , R E V 抗原的高度变异性主要体现
在这一蛋白上 。
据报道 ,在真核系统中表达 gP 90 的表达产物 ,
可以抵抗病毒对宿主细胞的侵害 , 但在原核系统中
表达 gP 90 功能如何 , 还未见报道 , 该研究结果为进
一步探明在原核系统中表达 gP 90 产物的功能提供
了保证 , 为准确监测 R EV 和防治 RE 奠定了坚实的
基础 :
参 考 文 献
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