全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
硫堇蛋白及细胞防御素在植物抗病性育种中的研究
宗晓娟 王甲威 刘庆忠
(山东省果树研究所 山东省果树生物技术育种重点实验室,泰安 271000 )
摘 要: 硫堇蛋白及细胞防御素是一类广泛存在于植物细胞中并对细菌、真菌等病原微生物具有抑制或杀灭作用的小
分子量多肽抗生素。二者在分子量、空间结构及某些化学性质具有相似性 ,近年来在植物抗病性育种中得以应用。对植物硫
堇蛋白及细胞防御素的分类、结构、作用机制以及在植物抗性育种的应用实例进行综述。
关键词: 硫堇蛋白 细胞防御素 植物抗病性
Researches on Thionins and Defensins in Plant
D isease Resistance Breeding
Zong X iao juan W ang Jiawe i L iu Q ingzhong
(Shandong Institute of Pom ology, Taian 271000)
Abstrac:t P lants Th ion ins and Defensins are sm allm o lecular we ight peptides antibiotics wh ich are invo lved in plant de fense re
sponses such inh ibiting the grow th of pathogens. Ove rexpressing the th ionins or defensins genes in p lants confers improvem ent in pro
tection against pathogen attack. To da te, seve ra l types of plants th ion ins or defensins have been applied in p lant d isease resistance
breed ing. This rev iew briefly descr ibed the c lassifica tion, structure and potentia l applications o f those tw o types o f plant antib io tics.
Key words: Th ionins Defensins P lant disease res istan t
收稿日期: 20100104
基金项目:国家 863!计划项目 ( 2008AA10Z157 )
作者简介:宗晓娟,助理研究员,博士,研究方向:果树生物技术育种; Em ai:l xjzong812@ 163. com
通讯作者:刘庆忠,研究员, Em ai:l qzliu001@ 126. com
植物的生长发育过程不可避免地受到病原微生
物的影响,在长期进化过程中, 植物自身形成了独特
的防御机制以抑制病原微生物在植物体的传播。植
物的防卫反应主要表现为活性氧 ROS( react ive oxy
gen speciese)爆发、次生代谢物, 例如植物抗毒素、
单宁、酚类化合物等 )的积累、病程相关蛋白 PR
( pathogenesisrelated protein )的表达等 [ 1]。小分子
量抗菌肽在植物自身防御反应中起重要作用, 迄今
多种不同植物的抗菌肽已被分离, 硫堇蛋白 ( Th i
on ins)及细胞防御素 ( Defensins)即为其中之一。
Th ionins是一类小分子量 (约 5 kD )、富含半胱氨酸
的碱性蛋白, 谷类单子叶植物及双子叶植物 (包括
槲寄生物种及短柔毛檀梨 )中均能分离到该类小分
子肽, 目前已从 15种植物物种中分离出 100多种
Th ionins
[ 2]。
植物 Tefensins与 Th ionins某些性质相似, 分子
量较小,通常具有 45- 54个氨基酸,富含半胱氨酸、
碱性、带正电荷。因此, 最初将植物防御素划分为
Thion ins的一个亚族,即 th ionins。
植物基因工程是在细胞及分子水平上改良植物
抗病性的有效策略。体外试验证明, 许多抗菌肽抑
制植物病原真菌或细菌生长,并且具有广谱性。将
抗菌肽过表达于转基因植物中, 提高其内源抗菌肽
水平, 可提高植物抗病性 [ 3]。对植物 Th ionins及
Defensins的分类、结构、作用机制以及在植物抗性
育种的应用实例进行综述。
1 Thionins及 Defensins的分类及结构特征
1. 1 Thion ins
迄今,已有来自 15种不同物种的 100多个 Thi
onins被分离得到,其基因编码序列也有报道。根据
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
进化关系, 将植物 Th ionins划分为 / th ionins及
thion ins, 尽管 th ionins与 / th ionins命名规则
相似, 但是它们三维结构相差甚远, 因此 th ionins
独立成为一个蛋白家族, 命名为植物防御素 ( de
fensins)。通常, / thion ins进而划分为 5个亚族,
即 I, II, III, IV和 V [ 2 ]。 I型 Thion ins存在于禾本科
谷类植物胚乳中,其蛋白碱性较强, 具有 45个氨基
酸,其中 8个半胱氨酸。 II型 Th ionins的主要从寄
生植物短柔毛檀梨的叶片及果实, 以及大麦叶片分
离得到,该类蛋白碱性较 I型 Th ion ins弱, 通常含有
46- 47个氨基酸。 I型及 II型 Th ion ins均含有 4个
二硫键。 III型 Th ionins从槲寄生植物例如 Viscum
album, P horadendron tom entosum, Phoradendronliga及
D endrophthora clavata的叶片及茎中分离得到,包含
45- 46个氨基酸,具有 3个保守的二硫键, 碱性与
II型 Th ion ins相当。 IV型 Th ion ins通常含有 46个
氨基酸, 3个二硫键, 蛋白电荷成中性, 已从阿比西
尼亚甘蓝种子中分离得到。相比较其它几种 Th i
on ins, V型 Thion ins肽段较短,多从谷类植物例如小
麦中分离。
应用 X射线晶体学研究已对植物 cramb in、1
and puro th ionins、 hordo thion in、v isco tox inA3的
三维结构进行分析。以 1puroth ionins为例, 多功
能圆二色光谱仪 ( C ircu lar D ichro ism )以及核磁共振
波谱分析 ( NMR )揭示植物 Th ionins的空间结构。
1 puro thion ins与 ciscotox in A3、cramb in具有相似的
二级结构,其空间构象类似希腊字母 ! (图 1)。如
图 1所示, 竖直柄状结构由一对反向平行的 螺旋
组成, 而水平臂由单链构成, 呈现反向平行的 转
角。若干盐键、氢键及其它共价键稳定了该空间构
象,由半胱氨酸形成的 4个二硫键进一步加固各结
构域。此外, 1 puroth ionins分子表面具有两性分子
的特征 [ 4, 5]。
1. 2 Defensins
由于分子量、带电性及二硫键等性质的相似性,
最初把 Defensins划分为 thion ins, 随后研究发现
thion ins与 / th ionins在空间结构上差别较大,
而与哺乳动物、昆虫的防御素的空间构象及生物学
功能相似, 因此将其命名为植物防御素 ( p lant de
fensins)。第一个植物防御素从小麦中分离得到,继
而大麦也分离到该类蛋白 [ 6 ]。近年来,多种单子叶
及双子叶植物中均分离到该类抗菌肽的编码基因。
来自不同物种的植物 Defensins其一级结构呈现多
样性,氨基酸组成差别较大,但有 8个保守的半胱氨
酸, 形成稳定的二硫键 [ 7]。这种一级结构的多样性
可能与 De fensins的生物学功能的特异性相关。植
物 Defensins的空间构象与昆虫及哺乳动物 de
fensins相似, 相比较昆虫 Defensins, 植物 Defensins
的 N末端具有一个 链构成的结构域。 B loch Jr和
R ichardson分离到 3个昆虫 淀粉酶的抑制剂, 即
SI1、S I2、S I3,它们与小麦 puroth ionins序列高
度同源 [ 8]。 B loch Jr[ 9]利用 H NMR分析了 SI1的
三维结构,发现其与 charybdotox in( 2CRD )的拓扑结
构相似, 2CRD是一个从蝎子毒液中分离的一个小
分子量碱性蛋白, 具有 37个氨基酸和 3个二硫键。
功能分析显示, SI1特异性的抑制昆虫细胞质膜上
的 K离子通道。
图 1 1puroth ion in s的三维结构预测
2 Thionins及 Defensins的生物学功能及作
用机理
研究表明,植物 Th ionins及 Defensins是植物非
特异性防御系统的重要组成部分, 对多种病原微生
物的生长具有抑制作用。目前, 已分离的大多数植
物 Thion ins及 Defensins都有广谱抗真菌或细菌的
特性,体外试验分析显示, 它们具有 淀粉酶活性
以及抑制离子通道的特性。Terras等 [ 10 ]研究发现,
若干种从十字花科植物中分离到的 Defensins对几
种植物植物致病真菌如 B. cinerea、A. brassicicola、F.
culmorum的菌丝生长具有抑制作用。R sAFP2、Dm
AMP1分别是从萝卜、大丽花属植物中分离到的植
物防御素,二者细胞作用机理研究较为详细。它们
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2010年第 3期 宗晓娟等:硫堇蛋白及细胞防御素在植物抗病性育种中的研究
分别与真菌质膜上鞘脂类分子葡糖苷脂酰鞘氨醇
( g lucosy lceram ide ) 及 manosy ldiinositolphosphory l
ceram ide特异性结合, 因而对不同真菌菌株表现特
异性抑制效应 [ 11, 12]。关于其它植物 Defensins作用
机理的研究相对较为欠缺。
与 Defensins的细胞生物学效应相似,植物 Th i
on ins通过影响致病菌细胞膜的通透性而具有抗菌
活性。新近研究表明, Th ionins与靶细胞的膜上特
异分子结合互作。应用电镜显微技术及体外及体内
试验均表明,若干种 Thion ins与细胞磷脂双分子层
互作, 并表现为剂量依赖性, 通常 Th ionins作用 1 h
后即能检测到细菌生物膜的渗透及裂解, Th ionins
的作用剂量约为 1 ∀M或 5 ∀g /mL[ 13]。Th ionins与
靶细胞磷脂分子的结合可能是由于静电效应,与膜电
位基团或特定结构域或作。这种静电结合互作效应
可被二价阳离子如 Ca2+等抑制 [ 14 ]。Hughes等 [ 15]研
究表明, Thionins的细胞毒性是由于与质膜结合后形
成离子通道,而影响靶细胞内离子平衡。除导致细
胞裂解, Thion ins还可引发靶细胞的次级信号转导。
例如, 体外试验证明 puroth ionin抑制蛋白激酶 C
的活性,并于钙调素结合, 而以上两种分子均为重要
的细胞信号转导组分 [ 16 ]。Th ion ins与硫氧环蛋白相
似,作为细胞调控蛋白,参与硫醇的次级信号转导,
影响主要代谢酶的氧化还原状态。这些细胞机制在
导致生物膜裂解后继续将 Th ion ins的细胞毒性效应
放大, 影响主要的细胞代谢过程,进而导致靶细胞的
死亡 [ 17]。Thion ins参与调控细胞信号转导使对其机
制的研究更为复杂。
3 Thionins及 Defensins在植物抗性育种的
应用
由于体外试验证明 Th ion ins及 Defensins对多
种植物病原菌有广谱杀菌活性,近年来采用分子生
物学手段将二者的基因过表达于植物中, 以改善植
物的系统抗病性。同源或异源过表达 Th ionins提高
转基因植物抗病性已积累了较多报道。例如, 同源
过表达拟南芥 Thi2. 1基因,增强了转基因拟南芥对
尖胞镰刀菌 ( Fusarium oxy sporum )的抗性。 Chan
等 [ 3]发现在番茄中过表达 Thi2. 1基因, 转基因番茄
对细菌性及真菌性萎蔫并均表现良好抗性。在烟草
中高水平表达一个从大麦中分离的 Hordo thion in基
因提高了转基因烟草的对丁香假单胞菌 (P seudo
monas syringae)的抗性 [ 18 ]。水稻种过表达一个从燕
麦中分离到的细胞壁结合硫堇蛋白基因,显著提高
了转基因水稻对多种细菌病害的抗性 [ 19]。关于过
表达 Th ionins基因在植物育种应用的报道较多, 但
利用反义技术或 RNA i敲除该类基因的研究较少,
其在植物育种中的应用也鲜有报道。
通过改变植物内源 De fensins的表达水平是改
善植物抗病性的有效策略之一。将紫花苜蓿的 de
fensin基因组成型表达于马铃薯中, 使其对大丽轮
枝菌 (Dahliae )的抗性增强, 而 D ahliae为马铃薯早
死病 ( early dy ing disease)的主要致病因子。同时该
防御素蛋白对早疫菌 (A lternaria so lani)及黄色镰刀
菌 (Fusarium culmorum )的菌丝生长具有抑制作用,
以上二者分别为番茄早疫病和禾谷类植物稻瘟病的
致病菌 [ 18]。稻瘟病和水稻白叶枯病是影响水稻减
产的主要病害, 分别将芸苔 ( B. campestris )及甘蓝
( B. oleracea)中分离到的防御素基因通过点突变遗
传操作,将某些特异氨基酸修饰, 组成型表达于水稻
中, 有效减轻了以上两种病害的发生,并且经过遗传
修饰的植物防御素对病害的防御效果更为明显 [ 20]。
4 存在问题及展望
利用 Th ionins及 D efensins改善植物系统抗病
的研究在其它植物如烟草、豌豆、萝卜等也有成功应
用实例。相比较使用化学药品的传统病害方法,
Thion ins及 Defensins具有两大优点。 Thion ins及
Defensins是从植物组织中提取的天然产物, 对人体
无害; Thion ins及 D efensins为小分子肽,完成生物学
功能后迅速降解,没有农药残留的问题,因此对环境
无害。但 Th ion ins及 Defensins在农业生产中未实
现规模应用,一方面是由于蛋白表达量及生物活性
等因素限制了工厂化蛋白制剂的生产,另一方面相
比较化学农药, Th ionins及 Defensins的杀菌效果温
和, 作用时间较慢, 针对这一问题可以考虑采用多种
抗菌肽复合使用, 以达到较高的杀菌效率。尽管抗
菌肽的应用存在以上不足, 但不能否认其在植物抗
病遗传育种中巨大意义。今后的研究,一方面可通
过建立高频遗传转化体系, 评价该两类抗菌肽在不
同植物中的抗病效果;另一方面应对其抗病机理做
深入分析,为植物抗病育种工作提供理论指导。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
参 考 文 献
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