全 文 ：植物学通报 2005, 22 (1): 27~31
Chinese Bulletin of Botany
①国家重点基础研究发展规划项目(2003CB114305)、国家自然科学基金(30370765)和河南省自然科学基金
(111010500)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: Songcp@henu.edu.cn
收稿日期：2004-06-08 接受日期：2004-10-18 责任编辑：崔郁英,白羽红
研 究 论 文
不同培养条件对拟南芥根细胞膜片
钳记录的影响①
张国增 安国勇 宋纯鹏②
(河南大学生命科学学院植物逆境生物学实验室 开封 475001)
摘要 本文以沙培养法、蛭石培养法、土培养法、水培养法和MS培养基等不同的方法培养拟南芥
(Arabidopsis thaliana)，分析了不同培养方法对根生长发育的影响，并分别分离根的原生质体。在膜片
钳记录中对不同来源的根原生质体状态进行了比较。结果表明，土培养法分离的原生质体最适于膜片钳
记录。
关键词 拟南芥，培养方法，原生质体，膜片钳
Patch Clamp Recording of Arabidopsis Root Cells Under
Different Cultural Conditions
ZHANG Guo-Zeng AN Guo-Yong SONG Chun-Peng②
(Laboratory of Plant Stress Biology, College of Life Science, Henan University, Kaifeng 475001)
Abstract We analyzed the effects of different cultural conditions — sand, vermiculite, nutritive soil,
water and Murashige-Skoog medium — on the development of root protoplasts isolated from
Arabidopsis thaliana. Patch clamp recording revealed that the quality of root protoplasts was supe-
rior with nutritive soil culture.
Key words Arabidopsis thaliana, Culture methods, Protoplast, Patch clamp
植物体内所需要的无机营养物质大部分是
由根从土壤中获取的。营养物质跨膜运输过
程中，膜中的离子通道起了重要作用
(Maathuis et al., 1997)。在营养吸收和盐胁迫
机制的研究中，通过膜片钳(patch clamp)技术
研究质膜上通道特性的变化可以得到许多有价
值的信息。目前利用膜片钳技术已从根细胞
中发现多种吸收营养物质的通道蛋白
(Schachtman and Schroeder, 1994；Roberts and
Tester, 1995)和通过钠离子的通道(Maathuis and
Sanders, 2001; Demidchik and Tester, 2002)。由
于拟南芥(Arabidopsis thaliana)遗传背景简单
并具多种类型的突变体，为这方面研究提供
了丰富的遗传材料。尽管也有文献报道用拟
南芥根分离原生质体 (Maathuis and Sanders,
1995; Demidchik and Tester, 2002)，但在膜片
28 22(1)
钳记录中，特别是进行药理学分析而加入试
剂处理时，存在封接成功率低、记录时间短
和封接不稳等问题。本文从培养条件及酶解
时间等方面探讨了如何得到高质量并适于电生
理学分析的拟南芥根细胞原生质体的方法，
为研究拟南芥根细胞通道电生理特性提供了技
术方法。
1 材料与方法
1.1 植物材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh )
是 Columbia 生态型。
1.2 培养方法
1)沙培法：取粗糙的不受污染的河沙，
洗去沙中杂物，将种子直接播于沙中，用塑
料保鲜膜将盆覆盖4天，以利于种子萌发和幼
苗生长。由于拟南芥种子小，撒播时先将种
子倒在质地较硬的纸上，然后轻轻振动纸张
便可均匀撒播。2)蛭石培养法：将种子直接
播于蛭石中，覆膜 4天。由于沙和蛭石都不
含养分，在培养时浇灌改良的Hoagland溶液
(陈敏和白书农，1995)。3)土培养法：将种
子播于花卉营养土和蛭石按 1∶2混合的培养
介质中，覆膜 4天。4)水培养法：将在垂直
放置、含 1.2%琼脂的MS培养基中生长 7天
的幼苗转入水培系统，为了缓苗，转入的前
3天以自来水代替营养液，随后更换培养介质
时改用 1/2MS营养液。5)MS培养基法：MS
盐、3%蔗糖、0.6%琼脂、pH5.7(KOH)培养。
6)1/2MS培养基法：1/2MS盐 、3%蔗糖、
0.6%琼脂 、pH5.7(KOH)培养。方法 5、6中，
种子先经 0.1%的升汞消毒 6~7分钟，再用无
菌水冲洗5次，点种于相应的灭过菌的培养基
上。以上 6种培养方法中，种子都于 4 ℃春
化 48 小时后，再转入光照培养间。
1.3 培养条件
光 /暗周期 16/8小时，光照温度 22 ℃，
黑暗温度 18 ℃。相对湿度 70% 左右。光照
强度 120 µmol·m-2·s-1。
1.4 试验溶液
(1)基本介质：10 mmol·L-1谷氨酸钾
(Sigma)，5 mmol·L-1 Mes，1 mmol·L-1 CaCl2，
2 mmol·L-1 MgCl2，10 mmol·L-1蔗糖，pH5.5
(KOH),用甘露醇调节渗透浓度为300 mOsmol·
k g-1。
(2 )酶液：1 .5% 纤维素酶 ( ce l lu lase ,
Sigma)，0.1%果胶酶(pectolyase Y-23, seishin
pharmaceutical, Japan)，0.1%小牛血清蛋白
(Sigma) 溶于基本介质中，pH5.5 (HCl)。试验
用的所有溶液使用前经直径为0.2 mm的微孔滤
膜过滤。
1.5 酶解原生质体
水培养法取材的时间和方法参照Maathuis
和 Sanders(1995)。MS培养基培养法、蛭石
培养法、沙培养法和土培养法等培养方法取
材时，除从MS培养基中用镊子直接取苗外，
其他3种培养方法都是先将培养拟南芥的培养
盆倒扣在筛网上，再用自来水充分冲洗，直
至洗去大部分培养介质，然后将幼苗转入培
养皿中并用毛笔轻轻刷去根前端吸附的杂物，
刷洗时要特别小心，防止根尖断裂。原生质体
的分离过程参照于川江和武维华(1999)的方法。
2 结果与讨论
2.1 根生长和发育情况的比较
由图 1可以看出，水培时通气状况较差，
因此根毛特别多。MS和 1/2MS培养基培养
时，与其他培养条件相比营养更充分，因此
根毛几乎没有发育，可能由于培养基疏松的
缘故，细胞与细胞之间连接不紧密，因而根
显得粗大。沙培、蛭石培养时，虽然也模拟
自然条件，但透气性差，营养也存在缺陷，
根的生长发育不太好(李俊华等，2004)。土培
时完全模拟自然条件，根生长的粗大健壮。
2.2 酶解时间的控制
由于酶试剂的批号和拟南芥生长状况及操
292005 张国增等: 不同培养条件对拟南芥根细胞膜片钳记录的影响
作情况略有不同，游离细胞所需时间可能不
同。一般经过显微观察确定酶解情况。酶解
时间一般控制在 30分钟左右。不同文献中报
道的酶解时间相差很大( M a a t h u i s a n d
Sanders，1995；Demidchik and Tester，
2002)，我们的经验是酶解时间太长或太短所
得到的原生质体膜状态都不是太好，因为酶
解时间过短，证明酶浓度高，对细胞直接伤
害大。酶解时间过长，说明酶浓度低，会对
已解离在酶液中的细胞膜造成伤害。因此对
不同批号的酶试剂和不同时期种植的拟南芥，
可灵活调整纤维素酶的浓度来控制酶解时间。
图2示土培时根酶解的过程及游离得到的根皮
层细胞。
2.3 根原生质体状态的比较
由表 1可以看出，受营件条件、通气状
况和光照条件的影响，酶解得到根原生质体
的状态差别很大。
虽然有水培条件下分离根原生质体的报道
(Maathuis and Sanders, 1995), 但在水培条件
下，通气状况较土壤及培养基中的差。因此
分离得到的根原生质体质膜发粘且无弹性，
不适宜膜片钳纪录。多数文献中用 MS 或
1/2MS培养基培养的幼苗来分离根原生质体(于
川江和武维华，1999；Demidchik and Tester，
2002)。这种条件下分离出根原生质体的膜质
量较水培时的好，在一般钾通道的研究中可
以作为理想材料。另外，根据我们的经验，
图 1 不同培养条件下根生长发育情况
图中均是生长 14天的根，箭头示根毛生长情况
Fig.1 The development of the 14d-old roots in different cultural conditions
Arrows indicate the root hairs
图 2 土培的拟南芥根酶解过程及游离得到的根皮层细胞
图中标注为酶解的时间
Fig. 2 Isolation of root protoplasts from Arabidopsis thaliana cultured with nutritive soil
The digesting time by the cellulase was indicated
30 22(1)
表 1 不同培养条件下拟南芥的根原生质体对膜片钳纪录的影响
Table 1 The effects of different cultural conditions on patch clamp recording of Arabidopsis thaliana root cells
Culture method The percent of successful sealing (%) The recording time (min)
(1) 25.7 20
(2) 30.2 30
(3) 43.5 35
(4) 50.6 48
(5) 65.4 60
(1) 水培; (2) 沙培; (3) 蛭石培养; (4) MS中培养; (5) 土培
(1) Water culture; (2) Sand culture; (3)Vermiculite culture; (4) MS medium culture; (5) Nutritive soil culture
MS或1/2MS培养基分离出来的根原生质体质
量没有太大差别。
土壤中的盐分(主要是钠盐)影响着地球上
约1/3的耕地，极大的限制了农业生产和作物
产量(Flowers and Yeo, 1995)。在盐胁迫机制
的研究中，胞外一般处于高钠状态(高达 100
mmol·L-1)，膜片钳记录时对原生质体质量提
出了更高要求。MS或1/2MS培养基虽然营养
充分，但是，光不可避免的要照射于根上。
光对根的生长和发育有重大影响(潘瑞炽，
2004)。自然条件下根是深埋于地下，大部分
时间是不见光的。因此我们用土培养法、沙
培养法和蛭石培养法等培养的拟南芥来分离根
原生质体。虽然有利用这些方法培养拟南芥
图 3 胞外Na+对根细胞原生质体质膜内向K+通道电流的影响
A.胞外液中无钠离子；B.胞外液中加入 50 mmol·L-1钠离子；C.稳态时的 I-V曲线
Fig.3 Effects of Na+ on the inward K+ channel currents of root protoplasts
A. No NaCl in external medium; B. Same cell with the external medium containing 50mmol·L-1 NaCl; C. Current/
Voltage relationship
312005 张国增等: 不同培养条件对拟南芥根细胞膜片钳记录的影响
的报道，但用这些方法分离拟南芥根原生质
体则尚未见有文献报道。3种培养方法中，虽
然根都未见光, 但受通气和营养等条件影响，
根的生长情况差别很大。蛭石培养时，蛭石
本身虽质地疏松，但浇营养液后却变得黏
重，透气性较差，根系活力降低。沙培养
时，沙土的保水性虽比蛭石弱，但透气性不
理想。因此这两种方法虽然是模拟拟南芥自
然生长条件，但分离的根原生质体不太适宜
膜片钳纪录。
土与蛭石混合培养时，克服了沙培养法
和蛭石培养法的不足，不但利于管理，而且
能满足拟南芥根系生长所需的透水和透气性，
又能使水、肥和氧气供应均衡，因此幼苗长
势好，其根系也强壮。酶解出的根原生质体
质膜弹性好，不易破碎，膜片钳试验封接时
阻抗高，容易形成全细胞。酶解后得到根原
生质体封接记录全细胞K+通道电流(图 3 A)，
即使用50 mmol.L-1的Na+处理后也能记录到典
型的K+通道电流(图 3 B)，Na+可以明显抑制
K+内向电流，抑制范围在 20%~40%左右。
3 结语
目前对拟南芥的研究已进入功能基因组学
时代。而拟南芥25 000个左右基因中约有5%
的编码膜转运蛋白(Mäser et al., 2001)。对这
类蛋白功能研究中，相当一部分工作要借助
于电生理学方法。而分离出原生质体状态的
好坏，又是电生理学研究中关键步骤。因此
本文对不同培养方法及酶解时间下拟南芥根原
生质体分离的探索，在膜转运蛋白研究中将
发挥重要的作用。
参 考 文 献
陈敏，白书农 (1995) 拟南芥菜培养经验点滴．植物
生理学通讯，31: 436-438
李俊华，张艳春，徐云远，种康，王辉 ( 2 0 0 4 ) 拟
南芥室内培养技术．植物学通报，21: 201-204
潘瑞炽 (2004) 植物生理学．高等教育出版社, 北京,
232
于川江，武维华 (1999) 拟南芥根皮层细胞质膜内向
K+通道电生理特性分析．中国科学(C辑)，29: 316-
323
Demidchik V，Tester M (2002) Sodium fluxes through
nonselective cation channels in the plasma membrane
of protoplasts from Arabidopsis roots．Plant
Physiology，128: 379-387
Flowers TJ，Yeo AR (1995) Breeding for salinity resis-
tance in crop plants: where next ? Australian Journal
Plant Physiology, 22: 875-884
Maathuis FJM， Sanders D (1995) Contrasting roles in
ion transport of two K+-channel types in root cells of
Arabidopsis thaliana．Planta, 197: 456-464
Maathuis FJM, Ichida AM, Sanders D, Schroeder JI (1997)
Roles of higher plant K+ channels. Plant Physiology,
114: 1141-1149
Maathuis FJM，Sanders D (2001) Sodium uptake in
Arabidopsis roots is regulated by cyclic nucleotides.
Plant Physiology, 127: 1617-1625
Mäser P, Thomine S, Schroeder JI, Ward JM, Hirschi K,
Sze H, Talke IN, Amtmann A, Maathuis FJM, Sanders
D, Harper JF, Tchieu J, Gribskov M, Persans MW, Salt
DE, Kim SA, Guerinot ML (2001) Phylogenetic rela-
tionships within cation transporter families of
Arabidopsis. Plant Physiology, 126: 1646-1667
Roberts SK, Tester M (1995) Inward and outward K+-
selective currents in the plasma membrane of proto-
plasts from maize root cortex and stele. The Plant
Journal, 8: 811-825
Schachtman DP, Schroeder JI (1994) Structure and trans-
port mechanism of a high-affinity potassium uptake
transporter from higher plants. Nature, 370: 655-658