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Structure of the Pollen Tube and the Mechanism of Tip Growth

花粉管细胞结构与生长机制研究进展



全 文 :植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (3): 340-354, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-01-08; 接受日期: 2007-02-02
基金项目: 国家自然科学基金(No. 0768013A)
* 通讯作者。E-mail: linjx@ibcas.ac.cn
.综述.
花粉管细胞结构与生长机制研究进展
.王晓华, 郝怀庆, 王钦丽, 郑茂钟, 林金星*
中国科学院植物研究所植物光合作用与分子环境生理重点实验室, 北京 100093
摘要 花粉管的极性顶端生长是一个复杂的动力学过程, 在高等植物有性生殖过程中起着重要的作用。花粉管的生长过程
包括许多方面, 其中最为重要的是花粉管细胞骨架动态和胞质运动。本文较全面地综述了花粉管的结构、细胞骨架、胞质运
动、囊泡转运及循环、线粒体运动以及内质网和高尔基体之间囊泡运动等。
关键词 胞质运动, 细胞骨架, 花粉管, 顶端生长, 囊泡转运
王晓华, 郝怀庆, 王钦丽, 郑茂钟, 林金星 (2007). 花粉管细胞结构与生长机制研究进展. 植物学通报 24, 340-354.
花粉的萌发和花粉管的生长是一个复杂的动力学过
程。花粉管作为一个研究植物细胞生长的模式体系, 对
于深入研究细胞极性生长、细胞间相互作用以及信号
转导等均有重要的意义。近年来, 国内外不少实验室都
以花粉管作为实验模式系统, 开展了一系列深入的研究,
其中包括: (1)花粉管细胞壁的组成、构建及其在花粉管
生长过程中的动态变化等; (2)花粉管细胞骨架系统, 包
括微管驱动蛋白(dynein和 kinesin)和微丝马达蛋白
(myosin, 肌球蛋白)家族的特定成员在囊泡及细胞器转
运中的作用, 以及微丝和微管系统的组装及其功能; (3)
花粉管生长过程中胞质环流的特征和模式以及囊泡转运
的动力学研究。关于花粉管的基本结构和成分等, 我们
曾经做过概述(郝怀庆等, 2003), 因此不再赘述。结合
国内外文献和本实验室的工作, 本文将着重介绍花粉管
生长过程中细胞骨架系统、胞质运动和囊泡转运等方
面研究进展。
1 花粉管的基本结构
1.1 花粉管的整体结构与分区
正常生长的花粉管中的细胞器呈典型的区域化分布, 如
图1所示, 即花粉管顶端生长区富含大量的分泌囊泡, 但
几乎没有其它的细胞器;其后的亚顶端区的细胞质中则含
有丰富的线粒体、网状高尔基体、内质网和小泡等各
种细胞器。被子植物花粉管细胞质中这种特殊的分布
模式, 被认为是花粉管顶端生长的必备条件。但是我们
通过研究裸子植物松科花粉管的超微结构后认为, 松科
植物花粉管中细胞器并不像被子植物花粉管中那样呈明
显的极性分布(Wang1 et al., 2005; Kong et al., 2006;
Sheng et al., 2006)。
Franklin-Tong(1999)认为, 细胞质集中在花粉管的
顶端生长区, 其它的细胞器包括线粒体、高尔基体和内
质网等也主要集中在这个区域, 胼胝质塞将细胞质与花
粉管的其它部分分隔开。分泌囊泡在花粉管的生长顶
端累积, 花粉管顶端区域含有两类囊泡, 一类直径为300
nm, 另一类为 50 nm (de Win et al., 1999)。较大的
囊泡来自高尔基体, 含有细胞壁前体物质, 它们与细胞膜
在顶端区融合, 囊泡膜成为组成质膜的一部分, 其内含物
被释放到细胞外。
裸子植物花粉管里细胞器并未形成明显的从顶端到
基部区域性分布, 分泌囊泡在顶端也不形成倒圆锥形
(Wang1 et al., 2005; Wang et al., 2006)。可见, 花粉
管里细胞器的极性分布或区域性分布并非与花粉管极性
生长有关, 而是与生长速度相关。裸子植物与被子植物
341王晓华等: 花粉管细胞结构与生长机制研究进展
花粉管内细胞器分布的差异反映了不同种属之间的差异
及其对环境的适应等。
1.2 花粉管中的细胞骨架
微丝与微管作为细胞骨架的主要成分广泛存在于真核生
物中, 并参与细胞形态建成、细胞器和囊泡运输、染
色体迁移、细胞壁构建、细胞分裂与分化以及信号
转导等各种生命过程。同时微丝与微管与其马达蛋
白构成细胞内重要的动力系统, 参与细胞内的各种运
动。因而对微丝和微管的研究一直是细胞生物学的
前沿研究领域。
微管、微丝骨架系统在植物有性生殖的重要环
节— — 花粉萌发、花粉管生长中也具有重要的作用(朱
澂和徐是雄, 2002)。对于在花粉管中微丝骨架的动态
组装, 尤其是其顶端和亚顶端微丝的组装与排布等已有
许多报道。例如早期利用化学试剂固定和鬼笔环肽荧
光标记技术, 发现花粉管顶端存在密集的微丝网络结构
(Derksen et al., 1995)。但采用快速冷冻、冷冻置
换、电子和光学显微镜技术, 则仅观测到一些短小的微
丝束随机地分布在花粉管顶端(Hepler et al., 2001;
Cheung et al., 2002)。如果通过显微注射技术将荧光
标记的鬼笔环肽导入百合的花粉管中, 以活体标记花粉
管内的微丝结构, 结果在花粉管顶端并未见到任何微丝
结构的存在(Miller et al., 1996)。由此怀疑花粉管顶端
的微丝网格结构可能是由于化学固定引起的假象。当
利用转基因的方法将连有GFP基因的mTalin (mouse
talin)转入烟草后, 没有观测到微丝结构在花粉管顶端透
明区的存在(Kost et al., 1998)。人们根据上述研究结
果认为, 花粉管顶端透明区是一个不存在束状微丝结构
的区域, 而且这一观点已逐步被大多数的研究者所接
受。李岩等用改进的化学固定方法进行实验后发现, 虽
然花粉管顶端不存在浓密的微丝网络, 却存在较高浓度
的单体肌动蛋白, 并从顶端向基部呈梯度分布(Li et al.,
2001)。Fu等(2001)将经过改良并提高了荧光强度的
GFP基因与mTalin基因片段连接, 再利用花粉特异性
启动子使其在烟草花粉和花粉管中表达。通过应用激
光共聚焦显微技术, 在花粉管顶端透明区观测到了高度
动态的细微丝束结构, 同时其存在与否与花粉管的生长
和停滞相一致。此项研究结果与本实验室在裸子植物
花粉管中观察到的微丝骨架排布模式基本相同(Chen et
al., 2006; Sheng et al., 2006; Wang et al., 2006)。
微丝的动态特性实际上就是丝状肌动蛋白(F-actin)
快速聚合和解聚的过程, 因此在花粉管顶端应同时存在
微丝快速合成与快速解聚的两种调控因子。当微丝快
速合成时, 需要有大量的单体肌动蛋白(G-actin)的存在,
以提供 F-actin形成所需的底物。李岩等利用 FITC-
图 1 花粉管顶端区域的结构示意图
Figure 1 Diagrammatic representation of the structure of the tip region of a pollen tube (Lennon and Lord, 2000)
342 植物学通报 24(3) 2007
DNase I 标记G-actin观测百合花粉管中G-actin的分
布, 发现花粉管顶端存在大量的G-actin, 且其浓度自顶
端到基部呈现由高到低的梯度分布。此结果为这一推
测提供了实验依据(Li et al., 2001; Wang2 et al.,
2005)。微丝在花粉管基部的分布相对较稳定, 其动态
平衡主要存在于花粉管的顶端。在大多数被子植物花
粉管中, 微丝或多或少与花粉管的长轴向呈现平行分布,
并位于花粉管主干部分的近质膜区域(Yu et al., 2006;
Zhao and Ren, 2006)。另外也有研究发现, 在花粉管
中标记的微丝成束地出现在花粉管的主体部分, 它们并
无明显的排列方向或呈网络状轴向分布(Justus et al.,
2004)。杨贞标实验室研究发现, 烟草与拟南芥花粉管
中微丝骨架对顶端生长的调节依赖于小G蛋白, 同时花
粉管顶端的微丝骨架动态变化与钙离子的动态变化之间
存在着相互作用(Fu et al., 2001; Gu et al., 2003, 2005;
Hwang et al., 2005)
近年来, 基于固定或活体实验得出了一个比较普遍
的观点, 即在一个生长的花粉管中微丝排布有3个明显
不同的区域。在花粉管顶端由于缺乏明显较粗大的微
丝束, 所以经常被看作 “微丝缺失区 ”( a c t i n - f r e e
zone)。其实此区域仍含有高度动态的微丝, 这些微丝
有时被称作“短微丝束”(short actin bundles, SAB)(Fu
et al., 2001)。在亚顶端区域存在一个浓密的微丝束网
络, 它们分别形成环状、衣领状或篮状排列(Smith and
Oppenheimer, 2005; Liu et al., 2005; Samaj et al.,
2006)。任海云实验室成功地在BY-2细胞中获得稳定
表达的GFP-mTalin, 并对BY-2细胞周期和细胞极性生
长过程中微丝骨架的动态变化规律进行了研究, 发现微
丝骨架的动态对细胞分裂核胞质运动起着至关重要的作
用(Yu1 et al., 2006)。此外, 由表达了GFP-myosin结
合蛋白(如成蛋白、前纤维蛋白)的花粉管活体细胞图像
显示, 上述2个区域包含高度动态的微丝群体, 它们在时
空上与花粉管的生长相对应(Guo and Ren, 2006)。在
亚顶端区域之后, 具有更稳定的长微丝束充满花粉管胞
质, 这些微丝束通常呈纵向或螺旋状排列于整个花粉管
的中部区域(Yu1 et al., 2006; Zhao and Ren, 2006)。
在不同植物种类的花粉管中, 微管的分布模式各有
不同, 即使在同一花粉管的不同部位, 微管的分布也有很
大差异(Smith and Oppenheimer, 2005; Vassileva et
al., 2005)。通常在被子植物花粉管的极顶端缺乏微管,
微管在花粉管中被组装成束并沿花粉管纵轴延伸
(Lazzaro et al., 2003)。通过应用 b或 g微管蛋白特异
抗体实验也显示, 微管是沿花粉管呈纵轴组装, 并由花粉
粒直到花粉管的亚顶端区域 , 但未伸进最顶端区域
(Justus et al., 2004)。然而, 与微管蛋白抗体相互作
用的多肽却在花粉管顶端被检测到, 说明未被组装成束
的短微管, 可能存在于花粉管的顶端(Romagnoli et al.,
2003)。据此推断, 在花粉管顶端可能有一个微管蛋白
库聚合形成短的微管, 它们在花粉管亚顶端部位进一步
与已存在的微管结合(Cai et al., 2005)。因此花粉管顶
端的短微管可能代表了单体和亚顶端成束微管间的中间
状态。Mao等(2005)通过花粉管端部膜上中心体相关
蛋白的定位, 进一步证实了微管在端部的聚合, 但g微管
蛋白却尚未在花粉管中被准确定位。
值得注意的是, 在裸子植物(如松树)花粉管中, 微管
在质膜下面形成一个网状轴向列阵并与核相连, 而在花
粉管的端部, 富集的微管在质膜下形成一个垂直于生长
方向的列阵, 这个区域可延伸至距顶端20 mm处, 显然
这与被子植物花粉管中微管的组装有很大差别(Wang et
al., 2006; Sheng et al., 2006)。微管在花粉管顶端区
域以一个网状辐射列阵的形式从透明区延伸到顶部, 这
个列阵在极顶端与纤维素微纤丝的沉积相关(Lazzaro et
al., 2003)。通常, 被子植物花粉管中微管的排列方式
几乎完全平行于花粉管的长轴, 而裸子植物花粉管中微
管呈清晰的螺旋状或者网状排列(Justus et al., 2004;
Sheng et al., 2006)。不过因材料和观察时期的不同微
管的排列方式也可能有所差异, 特别在某些松树(如白皮
松)幼嫩的花粉管中, 微管呈现倾斜或几乎横向的排列
(Terasaka and Niitsu, 1994)。
1.3 花粉管的细胞壁
在植物体中大多数细胞呈各向均一生长, 而花粉管的生
长方式为顶端生长, 即生长部位仅限于花粉管的顶端区
域。花粉管的顶端生长依赖于细胞壁及细胞质前体物
343王晓华等: 花粉管细胞结构与生长机制研究进展
质源源不断地运往顶端, 从而花粉管得以伸长。在这个
过程中, 花粉管细胞壁的组成及构建是花粉管生长和伸
长的一个极为重要的前提。
花粉管细胞壁的组成成分比较复杂。现在已经知
道花粉管壁主要的组成成分为多糖, 如纤维素、半纤维
素、胼胝质和果胶质等(Nishikawa et al., 2005; Parre
and Geitmann, 2005a, 2005b; Bosch et al., 2005); 单
糖组分主要是葡萄糖, 其次是阿拉伯糖或半乳糖(Mollet
et al., 2002; 秦源等, 2006)。Bosch等(2005)利用快
速冷冻置换技术(rapid freeze-freeze substitution, RF-
FS)对百合的花粉管进行研究, 发现与花粉管的稍后部位
相比, 花粉管顶端区域的细胞壁较厚, 并且具有较高的可
塑性。通常情况下, 被子植物花粉管壁可以分为2层结
构, 外层以果胶 - 纤维素为主, 内层则以胼胝质为主
(Parre and Geitmann, 2005a, 2005b)。但是不同植
物中花粉管细胞壁的结构并不完全相同。研究表明, 裸
子植物花粉管壁的结构与被子植物有很大差异, Kong等
(2006) 杄观察到青 (Picea wislonii)花粉管的初生壁含有
纤维素、胼胝质、果胶质以及其它一些尚未鉴定的成
分, 其顶端区域的细胞壁较厚, 且较均匀; 另外花粉管壁
上并没有胼胝质层的沉积。傅立叶转换红外光谱显微
技术(fourier transform infrared microspectroscopy,
FTIR)是一种直接、快速、对细胞壁无损伤的检测技
术。目前已利用 FTIR技术测定了植物材料的细胞壁、
内皮层细胞壁(Wu et al., 2003, 2005)以及花粉管细胞
壁(Hao et al., 2005; Wang1 et al., 2005; Kong et al.,
2006; Sheng et al., 2006)的化学组分, 快速无损地得
到了细胞壁中纤维素、半纤维素、胼胝质等相对含量
及成分的变化。
花粉管细胞壁除了含有常规的纤维素、果胶质等
多糖大分子外, 还含有多种的糖蛋白, 其中包括可溶性的
阿拉伯半乳糖蛋白和不可溶的伸展素(extensin)、富脯
氨酸蛋白、杂合脯氨酸蛋白、钙调素、膨胀素
(expansin)、各种酶和凝集素(lectin)等。细胞壁的组
成成分、机械特性及细胞壁区间定位物质蕴涵重要的
信息并影响花粉管的形态构建及生长, 如凝集素在植物
受精过程中参与了花粉与柱头的相互作用等生殖过程
(Fang and Sun, 2005; Fang et al., 2006)。对细胞壁
成分及功能的研究正成为一个新的研究热点。
2 花粉管的生长
2.1 花粉管的生长特点
细胞极性的特征主要表现在亚细胞结构及分子的不对称
分布, 它是所有真核有机体发育的基础。植物细胞的细
胞极性的独特性在于其形态发生是根据细胞壁的空间形
成而定义的。此外, 在决定细胞命运方面, 固着细胞比
起它们的谱系细胞具有更加优越的地位。由于组织或
器官均由多种类型的细胞组成, 从而使得在组织或器官
中研究细胞的极性变得非常困难, 因此对植物细胞极性
的研究都集中在合子、根毛以及花粉管等具有顶端生
长的细胞中。当花粉或花粉管细胞感知外部信号后, 通
过信号转导级联反应控制花粉萌发、调整花粉管生长
方向, 这一系列动力学的细胞事件关系到受精的成败。
花粉管生长受到细胞内环境的控制, 以维持合适的离子
浓度、肌动蛋白、胞吐和胞吞的平衡来实现花粉管的
顶端生长。
花粉管的生长方式和其它多数植物细胞有所不同,
后者的生长发生在整个细胞的表面, 而花粉管的生长仅
仅局限在花粉管顶端5-30 mm的区域, 即花粉管生长属
于一种典型的顶端极性生长。顶端生长依赖于高尔基
体囊泡运动到细胞单一位点的正向(anterograde)胞吐作
用, 它以囊泡发生锚定和融合的细胞内皮层区位点的选
择和建立作为开始(Parton et al., 2003; Malho et al.,
2006)。这些过程需要信号网络来识别内部和外部密
码, 从而决定位点和顶端生长的方向。信号网络必须以
高尔基体囊泡在特定位点锚定和融合这一标准来调控分
泌机制。为了维持顶端生长, 分泌的囊泡必须通过细胞
骨架运送到顶端(Malhó et al., 2005)。因此, 具顶端生
长的细胞包括囊泡富集的顶区, 含有细胞核和各种细胞
器的亚顶区以及富含液泡的基区。微管参与维持细胞
质极性, 所以肌动蛋自和微管的动力学调控需要和顶端
生长信号事件相耦联, 以便能调节顶端生长方向和速率
(Camacho and Malho, 2003; Justus et al., 2004)。
344 植物学通报 24(3) 2007
早期人们对Ca2+在花粉萌发和花粉管生长中作用
的研究表明, 外源Ca2+对离体培养及原位生长的花粉萌
发和花粉管生长是必需的(Schiott et al., 2004)。当向
花粉管内注射Ca2+特异性鳌合剂— — b类缓冲液, 则会
使其顶端Ca2+梯度消失, 从而导致花粉管顶端生长受到
抑制(Lazzaro et al., 2005)。对于已被抑制生长的花
粉管, 其顶端Ca2+梯度的再形成将是其恢复生长的先决
条件(Messerli and Robinson, 2003; Kong et al., 2006;
Yoon et al., 2006)。此外, 顶端 Ca2+梯度还控制着花
粉管生长的方向。利用离子渗透法、施加电场或笼化
Ca2+ (caged-Ca2+)光解释放技术, 人为改变花粉管顶端
Ca2+梯度的对称性, 由此将导致花粉管生长方向的改变
(Camacho and Malho, 2003; Rato et al., 2004)。花
粉管顶端胞质Ca2+的局域性升高可诱导花粉管在Ca2+
升高区域形成新的生长轴 , 并转向此方向继续生长
(Yoon et al., 2006)。上述研究结果均表明, Ca2+信
号系统具有类似开关的作用, 它启动花粉的正常萌发和
花粉管生长。
当体外生长的百合花粉管生长到一定程度之后(>
700 mm), 花粉管的生长速率开始出现明显的周期性变
化, 变化范围在0.1-0.4 mm.s-1之间, 生长振荡的平均
周期为23秒, 花粉管长度小于700 mm时, 生长速率的
变化表现为无规则的波动(Lovy-Wheeler et al., 2006)。
在烟草和矮牵牛等植物的花粉管中也相继检测到这种振
荡生长方式。花粉管的振荡式生长受许多因素的调节,
如 Ca2+、硼和酸碱度等的影响(Holdaway-Clarke et
al., 2003)。在花粉管振荡生长过程中, 参与调控花粉
管极性生长的许多因子表现出周期性变化的特性。作
为花粉管极性生长的重要调控因子, 顶端Ca2+浓度在花
粉管振荡生长的过程中呈现明显的周期性变化, 而且其
振荡周期与花粉管生长振荡周期相同, 由此说明顶端
Ca2+振荡与花粉管生长密切相关(Messerli et al., 2000;
Messerli and Robinson, 2003)。通过使用改进的水母
发光蛋白测 Ca2+技术, 以及调整更高的时间分辨率,
Messerli等(2000)清楚地证实了顶端Ca2+振荡出现在
生长振荡之后, 同时两者的间隔时间很短, Ca2+振荡仅
比生长振荡滞后 4秒, 即 10.5度的相位(振荡周期为
38.7秒)。Lovy-Wheeler等(2006)通过检测生长中百合
花粉管顶端的 pH值变化, 发现花粉管的振荡式生长模
式与其中酸碱性动态变化密不可分。pH值的变化会
导致花粉管内微丝骨架的聚合和解聚, 最终影响到花粉
管的生长。
2.2 花粉管中的胞质运动
花粉管生长与其它类型的细胞(如根毛、神经细胞的轴
突)相似, 其生长部位仅限于顶端区域。花粉管生长的
速率依植物属种及其生长条件而变化, 如松属花粉管的
生长速率小于1 mm.h-1 (Hao et al., 2005), 而玉米和虎
眼万年青(Ornithogalum virens)花粉管的生长速率则分
别可达160 mm.h-1 和 900 mm.h-1 (Stepka et al., 2000;
Suen et al., 2003)。显然, 裸子植物花粉管的生长速
率及伸长长度均远远小于被子植物。通常, 花粉管顶端
生长的速率与花粉管壁的化学组成、花粉管中的细胞
器分布、胞质流动与细胞骨架特征等均有密切关系。
在生长的花粉管中胞质环流现象异常活跃, 并与花
粉管内细胞器的运动息息相关。Justus等(2004)的研
究表明,松胞素B能显著降低花粉管内胞质环流的速率,
而秋水仙碱则不具抑制作用。究其作用原理在于松胞
素B影响了肌动蛋白的多聚化, 破坏了微丝的功能; 而秋
水仙碱能引起微管解聚(Cardenas et al., 2005)。由此
表明微丝参与了花粉管内的胞质运动,而微管并未参与。
从百合花粉管中提取的一种myosin, 该蛋白具有F-ac-
tin激活的内在ATP酶活性。通过细胞免疫荧光分析发
现, 此种myosin定位在百合花粉和烟草花粉管的细胞器
膜表面, 而且在体外能够以 5-8 mm.s-1的平均速度在
F-actin上滑行, 这一速度正好与百合花粉管内胞质流的
速度相一致(Holweg et al., 2003; Higaki et al., 2006)。
说明myosin与F-actin可能是花粉管内细胞器运动和胞
质环流的动力来源。
在被子植物与裸子植物花粉管中, 胞质环流的方向
也不相同, 例如被子植物花粉管中细胞质呈典型的倒喷
泉式( reverse fountain-like)运动, 即细胞质从花粉管两
侧流向顶端, 然后再从中央向后返回(Cardenas et al.,
2 0 0 5 )。而在冷杉植物的花粉管中 , 微管解聚剂
345王晓华等: 花粉管细胞结构与生长机制研究进展
Amiprophosmethyl抑制了细胞器的流动, 并导致顶端囊
泡透明区的瓦解, 同时还打乱了微丝在顶端的排列, 但并
不破坏细胞膜。Propyzamide和 oryzalin则会导致细
胞膜小管和液泡在顶端的聚集, 因而改变了环流方向形
成倒喷泉模式(Anderhag et al., 2000; Justus et al.,
2004)。例如松杉类植物的花粉管顶端约30 mm范围的
透明区内, 细胞器呈现喷泉式的运动。而在花粉管的中
心, 细胞器沿着规定的途径运动到顶端, 并在顶端呈现随
机性的运动, 然后它们又从顶端的细胞膜下面离开。上
述细胞器的这种运动模式恰与微管和微丝的排列方式相
吻合 , 而且与被子植物花粉管中的倒喷泉模式相反
(Anderhag et al., 2000; Justus et al., 2004; Sheng et
al., 2006)。
2.3 囊泡的转运、胞吞与胞吐
真核细胞通过胞吞 ( e n d o c y t o s i s )和胞吐作用
(exocytosis)完成大分子与颗粒性物质的跨膜运输。在
转运过程中, 质膜内陷, 形成包围细胞外物质的囊泡, 因
此又称膜泡运输。细胞的内吞和外排活动总称为吞排
作用(cytosis)。某些大分子物质通过形成小囊泡从细
胞内部移至细胞表面, 小囊泡的膜与质膜融合, 将物质排
出细胞之外, 这个过程称为外排作用(exocytosis)。细
胞内不能消化的物质、合成的蛋白质与多糖等物质都
是通过这种途径排出的。而胞吞则和胞吐的顺序相反,
胞吞作用开始是由内涵蛋白(clathrin)结合在一起形成构
架。内涵蛋白可以把其它分子吸引到膜上, 形成凹陷小
窝, 然后细胞膜再收缩形成囊泡, 脂质双层融合、箍断,
形成细胞内的独立囊泡(Yang et al., 2005; McNiven and
Thompson, 2006; Radulescu et al., 2006)。胞吞作
用可分为两类, 即批量内吞(bulk-phase endocytosis)和
受体介导的内吞(receptor mediated endocytosis,
RME)。在受体介导的内吞作用研究上, 孙蒙祥实验室
利用新型的量子点(QDs)探针研究发现 g - 氨基丁酸
(GABA)在调节花粉管伸长和植物细胞的生长方向中有
着重要的作用, 证实了植物细胞中也存在GABA信号通
路。此外量子点具有宽的激发光谱、窄的发射光谱、
高的量子产率、较高的生物亲和性及较低的毒性等特
点, 显示了量子点技术在受体标记中的优越性(Yu2 et al.,
2006)。
在植物中, 研究囊泡的运动通常采用生长速度快、
具有极性生长的材料, 如花粉管(Parton et al., 2003;
Wang et al., 2006)、根毛(Morenilla-Palao et al.,
2004; Voigt et al., 2005)以及真菌菌丝(Gupta and Brent
Heath, 2002; Marash and Gerst, 2003)。在这些材
料中胞吐作用几乎都发生在细胞的顶端区域, 由此便可
通过研究一个小的细胞表面区域来揭示整个细胞的扩张
过程。花粉管极性生长实际上是细胞极性分泌的过程,
分泌囊泡单方向运动, 与质膜融合以扩大质膜面积, 并同
时将囊泡内新合成的细胞壁物质外排到质膜外侧, 促进
花粉管向前延伸。一般认为, 分泌囊泡从高尔基体向花
粉管顶端的运动过程是以细胞骨架为轨道, 从而保证其
运动方向的准确性。对花粉管透明区微丝结构的研究
发现, 花粉管顶端的微丝有可能控制分泌囊泡的运动, 由
此推测这可能是影响花粉管生长的机制之一。另外, 花
粉管透明区微丝的高度动态特性, 还为其生长方向和速
度的精确调控提供了可能的机制。通过不同细胞骨架
杄抑制剂处理白 花粉管后 , 我们应用隐失波显微镜
(evanescent wave microscopy, EWM)跟踪了花粉管内
单个囊泡的运动(图2), 结果发现微丝在囊泡的转运中起
着主要的作用(Wang et al., 2006)。
胞吐与胞吞都涉及囊泡的循环加工问题, 胞吐囊泡
为细胞的扩张提供了原材料, 而多余的材料则通过胞吐
过程得到回收。新近又提出了“kiss and run” 转运模
式, 即分泌囊泡与目标膜并未完全的融合, 而是通过短时
间形成的融合孔释放内含物, 然后分开朝不同方向循环
加工,囊泡的停泊和释放并不一定需要多余的融合。通
常植物细胞的胞吐与胞吞速度也很快, 如拟南芥花粉管
中的胞吐速度达到每分钟3 238个, 胞吞速度估计为每
分钟21 265个, 而在拟南芥根毛中的胞吐与胞吞速度分
别可达到每分钟 4 202个和 6 901个(Ketelaar et al.,
2003)。但值得注意的是, 由于上述研究结果都是从经
化学固定后的“死细胞”中获得的, 这与活体细胞所得的
结论可能相同(Lencer and Blumberg, 2005)。因此, 广
泛应用新的技术和方法对囊泡转运的动态进行活体分析
346 植物学通报 24(3) 2007
已是势在必行(Wang et al., 2006)。
由于囊泡转运是一种高度有组织的定向运输, 它们
在马达蛋白的作用下, 经过复杂的细胞骨架系统被转运
到特定的区域。囊泡之所以能够准确地与靶膜融合, 是
因为囊泡表面的标志蛋白能被靶膜上的受体识别
(Ungermann and Langosch, 2005)。在囊泡转运过程
中, 通常需要多种蛋白和调节因子的参与, 其中两类关键
的蛋白家族分别是SNAREs (soluble NSF attachment
protein receptor)和 Rabs (ras-related in rat brain)。
SNAREs分布于特定的膜上, 位于转运囊泡上的称为v-
SNAREs, 位于靶膜上的叫作 t-SNAREs。这两者都具
有一个螺旋结构域, 并能相互缠绕形成跨SNAREs复合
体(trans-SNAREs complexes), 再通过这个结构将囊泡
的膜与靶膜连在一起, 以实现转运囊泡特异性停泊和融
合(Mossessova et al., 2003)。Rab蛋白是一种单体
形式的GTP结合蛋白, 自身具有GTPase活性, 属于小
G蛋白家族中的Ras亚家族。Rab蛋白通过结合GDP/
GTP构像转换和准确膜定位, 在特定的时间和地点连接
或激活特异的效应子, 并在囊泡的形成、转运、粘附、
锚定、融合等过程中执行特定的生理功能(Ward et al.,
2005)。在植物中对于 Rab蛋白的研究, 主要集中在
Rab蛋白家族成员的生化、分子结构特征、亚细胞定
位及在突变情况下的功能研究(Nahm et al., 2003; Sohn
et al., 2003)。另外, 对 Rab蛋白中的GEF、GDI和
GAP 3种调控因子的作用, 也有一些报道(Yaneva and
Niehaus, 2005), 但对其效应因子的研究尚不多见。总
之, 与调节蛋白Rabs相比, 人们对 SNAREs的研究较
多, 其机理也较清楚(Ungermann and Langosch,
2005)。尽管植物细胞与动物细胞在胞内囊泡转运机制
上具有相似性, 但植物细胞却表现出一些特殊的转运机
制(图3)(Rutherford and Moore, 2002; Molendijk et al.,
2004)。例如拟南芥的Rab蛋白 Ara6具有独特的结构
特征, 它以植物特有的方式调节囊泡转运,但其机理仍不
清楚。因此, 深入开展对Ara6蛋白的研究及其效应因
子的筛选与鉴定、生化分子特征、结构功能等方面工
作, 以及在分子水平上研究Ara6蛋白与其效应因子之
间的相互作用及其对囊泡定向转运的调控等, 对于进一
步阐明植物特有的囊泡转运分子机制无疑具有十分重
要的意义。
2.4 线粒体运动
线粒体是真核细胞生成ATP的主要场所, 合成的ATP进
入细胞质后参与细胞的各种需能过程, 因此线粒体被誉
为“细胞动力站”。近年来, 人们还发现线粒体除了能
图 2 杄白 花粉管顶端单个囊泡融合过程
数字为对应的时间(秒), 下图为融合过程中后 5幅的三维表面图
Figure 2 Individual exocytotic events of a FM4-64-labeled vesicle
Numbers indicate time (in seconds) relative to the moment of fusion. Lower sections show three-dimensional luminance plots of
five successive frames starting one frame before fusion
347王晓华等: 花粉管细胞结构与生长机制研究进展
量转换功能外, 还有生成活性氧自由基、调节细胞的氧
化还原电势和信号转导、维持细胞内钙离子浓度、调
控细胞凋亡和某些基因的表达等功能(Barsoum et al.,
2006; Davidson and Duchen, 2006; Kuba et al., 2006;
Szabadkai et al., 2006)。由于线粒体在细胞凋亡中的
关键性作用, 又被称作“细胞生存和死亡之马达”。目
前, 线粒体的研究已深入到生物的发育、代谢、衰老、
疾病、肿瘤以及进化、遗传等许多重要领域, 成为当
前生命科学和分子医学中最活跃的前沿领域之一。
在动物细胞中, 线粒体的长距离移动被认为是沿微
管运动, 短距离运动被认为是沿微丝移动的, 而在神经细
胞中线粒体沿微丝移动(Chang et al., 2006)。肌细胞
中的研究发现, 72%的线粒体沿微管运动, 15%的线粒
体沿微丝移动(Yi et al., 2004)。酵母细胞中, 线粒体
运动的情况就更复杂, 在不同种的酵母中线粒体运动的
轨迹也有所不同。而线粒体在植物细胞中的转运和其
调控机制研究还很少。van Gestel等(2002)利用骨架抑
制剂处理烟草悬浮培养细胞, 发现线粒体移动是能量依
赖的并且其移动方向主要沿F-actin, 而在皮层细胞质下
的停泊由微丝、微管共同作用。这一结论与在植物细
胞中质体的运动相似。从百合花粉管中分离出的myo-
sin受钙的调节(Yokota et al., 1999), 因此在生理Ca2+
条件下, 它能被可逆地调节, 当[Ca2+] 10-6 mol.L-1时活
性被抑制, 而在10-6-10-5 mol.L-1 [Ca2+]间是可逆性抑
制, 若[Ca2+]>10-5 mol.L-1则抑制不可逆。同时研究还
发现, 共沉淀的还有 18 kDa的蛋白, 可能是CaM结合
于myosin重链, 以调节myosin活性。其在体外F-actin
上移动的平均速度为 6.2 mm.s-1, 并受钙调节, 使其易
于脱落或出现短暂的停止(Yokota et al., 1999)。然而
从烟草花粉管中分离出来的细胞器碎片(被认为主要是线
粒体), 能够利用 kinesin相关的动力蛋白沿微管运动。
因而Romagnoli等(2003)认为, 花粉管中的线粒体沿微
管进行短距离运输。
通过应用100 nmol.L-1 Jasplakinolide (Jas)处理
杄白 花粉管, 结果发现其微丝骨架并无显著变化, 细胞器
的分布也未改变。然而在激光共聚焦显微镜下观察, 发
现线粒体运动性却降低了 27.6%。通过进一步分析还
发现, 用Jas处理花粉管时, 线粒体运动中的混合运动消
失, 而只剩下稳定的移动, 可能是由于微丝动态的抑制而
引起线粒体运动的变化。另外, 利用抑制肌球蛋白ATP
酶活性的BDM (butanedione monoxime)处理花粉管后,
微丝的结构没有大的变化。有趣的是, BDM 的处理却
抑制了 61.1%的线粒体的移动。在隐失波显微镜下观
察, 发现线粒体在花粉管中稳定且较匀速地移动消失, 余
下线粒体的移动表现出大范围的变动, 这与Jas处理的
线粒体的结果刚好相反。由此说明, Jas和 BDM处理
结果是由于不同的原因造成的, 二者的效果表现出叠加
性, 暗示着线粒体的移动由微丝的聚合所推动。
由于花粉管中存在着顶端钙离子浓度梯度, 因而合
适的钙离子梯度正是花粉管正常生长的基础。在花粉
管中线粒体随细胞质流在花粉管内循环, 可能担负着维
持其顶端钙浓度梯度的作用。在裸子植物花粉管中, 线
图 3 花粉管和根毛中囊泡转运途径以及与囊泡转运相关的一些
重要蛋白质在细胞内如细胞膜、反面高尔基体网、多泡体和高
尔基体中的分布示意图
Figure 3 Model highlighting crucial proteins such as diverse
small GTPases within growing tips of root hairs and pollen
tubes that are associated either with the plasma membrane
(PM), trans-Golgi network (TGN), multivesicular bodies (MVB),
and/or with Golgi (Samaj et al., 2006)
348 植物学通报 24(3) 2007
粒体运动速度较慢, 其原因可能与其花粉管中Ca2+的浓
度梯度低, 花粉管伸长所需能量和Ca2+浓度较低等有关
(Kong et al., 2006)。最近, 我们通过对百合花粉管中
线粒体的移动进行检测, 结果发现其移动的速度明显高
于裸子植物。由此也进一步验证了上述的推测。
2.5 内质网、高尔基体与囊泡循环
内质网和高尔基体都是由膜结构组成的细胞器, 二者在
形态和化学组成上都有一定的相似性, 其功能也有很大
的联系。内质网膜约占细胞总膜面积的一半, 是真核细
胞中面积最多的膜。内质网是内膜构成的封闭的网状
管道系统。具有高度的多型性。可分为粗面型内质网
(rough endoplasmic reticulum, RER)和光面型内质网
(smooth endoplasmic reticulum, SER)两类。RER呈
扁平囊状, 排列整齐, 膜围成的空间称为ER腔(lumen),
膜外有核糖体附着。SER呈分支管状或小泡状, 无核
糖体附着。细胞中不单独存在RER或SER, 它们分别
是 ER连续结构的一部分。ER主要功能是合成蛋白质
和脂类, 分泌性蛋白和跨膜蛋白都是在 ER中合成的。
ER合成的脂类除满足自身需要外, 还提供给高尔基体、
溶酶体、内体、质膜、线粒体、叶绿体等膜性细胞
结构(Mancias and Goldberg, 2005; Appenzeller-
Herzog and Hauri, 2006)。高尔基体是由数个扁平囊
泡堆在一起形成的高度有极性的细胞器。它常分布于
内质网与细胞膜之间, 呈弓形或半球形, 凸出的一面对着
内质网称为形成面(forming face)或顺面(cis face); 凹进
的一面对着质膜称为成熟面(mature face)或反面(trans
face)。顺面和反面都有一些或大或小的运输小泡, 在
具有极性的细胞中, 高尔基体常大量分布于分泌活性活
跃的细胞质中(Kim et al., 2005; Pimpl et al., 2006)。
高尔基体负责对细胞合成的蛋白质进行加工、分
类并运出。其过程是在 SER上合成蛋白质并进入 ER
腔, 接着以出芽形成囊泡而进入 CGN, 然后在medial
Golgi中加工并在TGN形成囊泡, 最后囊泡与质膜融合
并排出。这个过程是一个顺式的过程, 因此整个囊泡转
运称为顺行运输(anterograde traffic)(Sannerud et al.,
2003; Samaj et al., 2005, 2006)。ER到Golgi的物
质运输主要是由COP和COPII包被小泡介导的, COP
主要介导ER到Golgi和Golgi内部各扁平囊间的运输,
而COPII在胞吞和TGN (trans Golgi network)向质膜的
运输途径中发挥作用(Duden, 2003; da Silva et al.,
2004; Mancias and Goldberg, 2005; Yang et al.,
2005)。
内质网产生的囊泡一般仅在内质网和顺面高尔基体
网(cis-Golgi network)之间循环(Lisenbee et al., 2003;
Siddiqi et al., 2003), 而参与物质转运和质膜融合的囊
泡大多来自反面高尔基体网(trans-Golgi network)
(Lobstein et al., 2004; Ovecka et al., 2005; Samaj et
al., 2005)。成熟的囊泡从高尔基体脱落后, 以动力蛋
白提供能量沿细胞骨架运动, 被转运到特定位置, 这个过
程称为囊泡转运。一般认为, 分泌囊泡在花粉管中的定
向运输依赖于花粉管中的细胞骨架, 尤其是微丝骨架系
统(Vidali et al., 2001; Wang et al., 2006)。
这个生物合成分泌途径可以高效地将新合成的物质
运送到质膜、胞外空间以及不同的细胞内区域。在每
个运输步骤, 正向的运输被逆向的膜流动所平衡, 逆向的
膜流动是用来回收在分泌货物的分选或媒介的形成中起
作用的蛋白质和脂类, 以及参与分泌途径的细胞器的剩
余蛋白质的。另外, 膜的回收被认为参与了分泌货物的
质量控制和主要发生在内质网-高尔基体边界的浓缩。
分泌途径的逆向运输可以示意性的分为3步: 第一步, 从
早期内吞作用的区室到反式高尔基网络(TGN)的运输; 第
二步, 高尔基体内的运输; 第三步, 从高尔基体到内质网
的运输(Sannerud et al., 2003)。目前至少已鉴定了 3
个独立的从高尔基体到内质网的逆向运输途径(图 4)。
与整个分泌途径相关的正向运输的实现是由逆向运
输(retrograde traffic)环节来平衡的, 这方面的认识相对
较晚。逆向运输包括高尔基体向ER的逆向运输和高尔
基体内部从反面向顺面的逆向运输(Sannerud et al.,
2003; da Silva et al., 2004)。虽然我们对逆向运输的
了解有限, 但是已经清楚这些途径相当复杂。在每一个
主要途径的步骤中, 多种逆向运输途径同时发挥作用而
行使不同的功能, 当然在有些时候似乎为运输提供一些
冗余的机制(Lee et al., 2004)。在哺乳动物中, 逆向运
349王晓华等: 花粉管细胞结构与生长机制研究进展
输可能由COP I囊泡介导, 并由 ArflpGTP酶调控。体
外转基因烟草可产生融合了定位信号HDEL的a-淀粉
酶, 从烟草中诱导COP I囊泡发现, COP I囊泡包含了
经过修饰的分泌标记以及钙网织蛋白(ER固有蛋白), 从
而第一次在植物中发现 COP I 囊泡与逆向运输有关
(Pimpl et al., 2000)。Lobstein等(2004)研究发现, 拟
南芥中与酵母Vps52p同源的蛋白质在囊泡从高尔基体
向内质网逆向运输过程中起重要作用。高尔基体的膜
无论是厚度还是在化学组成上都处于内质网和质膜之间,
因此高尔基体执行着膜转化的功能。在内质网上合成
的新膜转移至高尔基体后, 经过修饰和加工, 形成运输泡,
与质膜融合, 使新形成的膜整合到质膜上(da Silva et al.,
2004; Pimpl et al., 2006)。
3 总结与展望
在有花植物中, 花粉管作为一个特殊的细胞结构, 对于深
入研究植物细胞壁的构建、信号转导以及细胞间通讯
图 4 细胞中逆向运输途径示意图
(a): 不依赖 COPI的逆向转运途径, 且此途径在高尔基体和内质网之间可以实现双向运输; (b)-(e): 依赖 COPI的逆向转运途径; (f): 非常
靠近的反面高尔基网与内质网之间的逆向运输
Figure 4 A working model depicting COPI-dependent and -independent retrograde transport routes operating between the Golgi
complex, IC and the ER (Sannerud et al., 2003)
(a): a COPI-independent retrograde pathway between Golgi cisternae and peripheral ER sites; (b)-(e): COPI-dependent process.
( f ) : a possible direct retrograde transport route from a close Golgi compartments to the ER
350 植物学通报 24(3) 2007
都是一个非常理想的实验模式系统。同时花粉管作为
植物受精过程中一个重要的细胞体系, 对其生长过程中
的细胞生物学和分子生物学的深入研究, 在理论和生产
实践上均有重要的意义。尽管目前人们对于花粉管生
长的机理有了一定的了解, 但是大多数的研究都采用体
外实验的方法。而在植物正常传粉过程中, 柱头与花柱
引导组织内许多分子参与了花粉萌发和花粉管的生长与
调控。为此, 在体内条件下花粉管生长过程中复杂的生
理活动和细胞器的运动将有待于进一步的探讨。
方法学是现代细胞生物学和分子生物学的基础, 现
代生物学的研究进展和一切重大发现都离不开新技术和
新方法。一些新兴的标记和成像技术, 譬如各种荧光蛋
白活体标记技术、多分子荧光标记技术、量子点标记
技术、细胞导肽导入技术、全内反射荧光显微镜成像
技术和旋转式激光共聚焦成像技术等得到了飞速发展,
并不断被应用于植物细胞生物学研究中。我们有理由
相信, 随着这些新技术的发展与广泛应用, 作为模式系统
的植物花粉管内更加精细的结构及其生长机制将会被揭
示出来。
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Structure of the Pollen Tube and the Mechanism of Tip Growth
Xiaohua Wang, Huaiqing Hao, Qinli Wang, Maozhong Zheng, Jinxing Lin*
Key Laboratory of Plant Photosynthesis and Molecular Environment Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences,
Beijing 100093, China
Abstract The pollen tube is the polarized tip-growing system that involves a complicated kinetic process essential for sexual
reproduction in higher plants. The process of pollen tube growth involves many aspects, especially the dynamics of the cytoskel-
eton and cytoplasmic movement. The present paper reviews the structure of the pollen tube, cytoskeleton, and vesicles, as well
as mitochondria trafficking and vesicle recycling in pollen tubes.
Key words cytoplasmic movement, cytoskeleton, pollen tube, tip growth, vesicle trafficking
Wang XH, Hao HQ, Wang QL, Zheng MZ, Lin JX (2007). Structure of the pollen tube and the mechanism of tip growth. Chin Bull Bot
24, 340-354.
* Author for correspondence. E-mail: linjx@ibcas.ac.cn
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dynamics and control the tip growth of lily pollen tube. Sex
Plant Reprod 19, 83-91.
(责任编辑: 白羽红)
新书介绍 — — 《细胞遗传学》
《细胞遗传学》是由李集临和徐香玲教授编著, 科学出版社出版(定价: 38.00元)的新书。
本书以染色体遗传为重点, 在经典细胞遗传学基础上应用现代分子遗传学的研究成果, 探讨细胞遗传的机制。全书共分
10章。 第一章: 细胞遗传学的进展; 第二章: 染色体成分; 第三章: 染色体的结构; 第四章: 染色体组(基因组); 第五章: 细胞增
殖、细胞周期与细胞分化; 第六章: 染色体功能; 第七章: 染色体水平的调控; 第八章: 染色体变异; 第九章: 细胞质遗传(重点
介绍细胞质遗传研究的最新进展和细胞质雄性不育的机制); 第十章: 植物染色体工程(以小麦的染色体工程为重点, 理论联系
实际, 经典的染色体工程与现代的染色体操作相结合)。
细胞遗传学是遗传学与细胞学的交叉学科, 它侧重于染色体(包括细胞质的基因组)的结构、功能、调控机制、染色体
组、染色体操作等方面的研究, 通过染色体、染色体组、细胞质、细胞质基因组来研究遗传与变异的机制。细胞遗传学
与普通遗传学、细胞生物学有着密切的关系。由于植物远缘杂交、染色体工程、单倍体、多倍体及雄性不育和杂种优
势等研究成果广泛应用于农业生产, 因此细胞遗传学具有重要的理论意义和应用价值。
本书文字简练, 引用大量图表, 深入浅出, 可读性强。适于高等院校遗传学专业的本科生、研究生、教师以及从事育
种的科研工作者参考。