全 文 ：植物学通报 2006, 23 (3): 281~285
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2005-10-24; 接受日期: 2006-01-05
基金项目: 国家自然科学基金项目(30471049)、江苏省青年科技创新人才学术带头人项目(BK2004417)、南京农业大学
SRT项目(0409B08和 0506B03)和国家理科基础科学研究与教学人才培养生物学基地 SRT开放基金项目
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: wbshenh@njau.edu.cn
.技术与方法.
一种微量、快速测定植物种子 b -淀粉酶活性的方法
凌腾芳 林锦山 刘辉 张博 李静 余阗 叶茂炳 沈文飚*
(南京农业大学生命科学学院 南京 210095)
摘要 针对3, 5-二硝基水杨酸(DNS)法的缺点, 以对硝基苯酚麦芽五糖(PNPG5)为底物, 建立并改进了植
物种子b-淀粉酶活性测定的方法。本方法具有微量和快速的特点; 进一步通过对4种植物材料种子的酶
活性测定以及a-淀粉酶的干扰评估实验, 证实了该法可以运用于植物种子b-淀粉酶活性的专一性测定。
关键词 b-淀粉酶, 测活方法, 对硝基苯酚麦芽五糖, 植物种子
A Rapid Micro-volume Method for Determining b-amylase
Activity in Plant Seeds
Tengfang Ling, Jinshan Lin, Hui Liu, Bo Zhang, Jing Li, Tian Yu,
Maobing Ye, Wenbiao Shen*
(College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)
Abstract In view of the disadvantages of the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method, we developed
a rapid micro-volume procedure utilizing p-nitrophenyl-a-maltopentaoside (PNPG5) as a substrate
for specific determination of b-amylase activity. The assay procedure was evaluated with seeds
from 4 plant species, and the exact degree of interference by a-amylase was determined. This
modified method could be applied to the selective measurement of b-amylase activity in different
plant seeds.
Key words b-amylase, method for determining enzyme activity, PNPG5, plant seed
淀粉的降解代谢是禾谷类作物种子萌发过
程的关键步骤(Zhang et al., 2005)。通常, a-淀
粉酶(EC 3.2.1.1)首先直接水解完整的淀粉粒, 释
放出糊精, 然后由b-淀粉酶(EC 3.2.1.2)等将其进
一步水解为麦芽糖和葡萄糖。已经知道, 植物
种子b-淀粉酶往往以游离态(free b-amylase)和
结合态(bound b-amylase)2种形式存在(Ziegler,
1999)。
目前, 测定植物种子b-淀粉酶活性最常用
的方法是根据a/b-淀粉酶的酶学特性采用选择
性失活的技术, 并结合3, 5-二硝基水杨酸(DNS)
来进行定量测定淀粉酶降解产物还原糖的含量
(以下简称DNS法)(巩普遍, 2000)。由于有时植
物种子中a/b-淀粉酶的生化特性差异并不十分
明显, 使得b-淀粉酶的活性测定受到严重的干
扰。例如某些耐高温的 b-淀粉酶对于 70℃处
理的敏感性较低; 在大量 a-淀粉酶存在时, 低
pH 处理对 a - 淀粉酶也往往无效(Z i eg l e r ,
1999)。另一方面, 目前在动物和微生物研究中
已经建立了以对硝基苯酚麦芽五糖 ( p -
282 23(3)
nitrophenyl-a-maltopentaoside, PNPG5)和对硝
基苯酚麦芽六糖(p-nitrophenyl-a-maltohe-
xaoside, PNPG6)作为人工底物, 以微生物来源的
a-葡萄糖苷酶(a-glucosidase)为辅助酶的b-淀
粉酶活性测定新方法, 且开发了相应的试剂盒
(Megazyme International Ireland Ltd., Bray
Business Park, Bray, Co.Wicklow, Ireland), 并
开始运用于植物种子 b - 淀粉酶活性的测定
(Mathewson and Seabourn, 1983; McCleary and
Codd, 1989)。不过, 由于 PNPG5和 PNPG6均
为人工合成底物, 价格昂贵, 且在反应体系中用
量较大, 所以试剂盒的价格不菲(Sopanen and
Laurière, 1989), 因此在实际应用中存在着不小的
难度。针对上述问题, 通过优化和改进, 我们
建立了以 PNPG5为底物的微量、快速测定b-
淀粉酶活性的方法。该法具有测定时间短、
专一性强(与DNS法相比)和微量的优点(包括
降低了PNPG5和a-葡萄糖苷酶的用量以及反
应总体积), 因此在大批量检测植物种子b-淀粉
酶活性的研究中具有明显的优势。
1 材料和方法
1.1 实验材料和试剂
实验中的植物材料小麦扬麦158(Triticum
aestivum ‘Yangmai 158’)、大麦西引 2号
(Hordeum vulgare ‘Xiyin 2’)和水稻武运粳7号
(Oryza sativa ‘Wuyunjing 7’)均为江苏省农科院
提供; 绿豆明光(Phaseolus radiatus ‘Minggu-
ang’)由安徽燕之坊食品有限公司销售。对硝
基苯酚麦芽五糖 ( p - n i t r o p h e n y l - a -
maltopentaoside, PNPG5)、a-葡萄糖苷酶(a-
glucosidase)以及木瓜蛋白酶(papain)购自Sigma
公司, a-淀粉酶购自北京奥博星生物技术责任
有限公司(来自枯草芽孢杆菌, 酶活性单位>
4 000 U·g-1), 其他生化试剂均为国产分析纯。
1.2 游离态和结合态b-淀粉酶的提取
植物干种子用研磨机磨至粉状后保存于4
℃冰箱中待用。另选取大小均匀的各品种种
子进行黑暗条件下的萌发实验, 其中小麦和大麦
的萌发温度为25℃, 水稻和绿豆则为30℃, 上述
材料均在萌发 2天后制备样品。
游离态(free)和结合态(bound)b-淀粉酶的
提取参考Sopanen和Laurière(1989)介绍的方法,
略有修改。其中游离态 b-淀粉酶的制备过程
如下: 取上述样品1 g左右, 加入4 mL 的0.1 mol.
L-1 NaCl溶液(含1 mmol.L-1 EDTA), 混合均匀
后在空气摇床中(25℃)以60 r.min-1的转速提取
10分钟, 10 000 g离心15分钟后取上清液, 重复
上述操作2次, 合并各上清液并定容至12 mL, 4
℃冰箱中保存。结合态 b-淀粉酶的制备过程
如下: 在游离态样品制备后剩余的沉淀中加入4
mL含0.5%木瓜蛋白酶的磷酸氢二钠 -柠檬酸
缓冲液(pH 6.5), 37℃空气摇床中以60 r.min-1 的
转速振荡 30分钟, 10 000 g离心 15分钟, 重复
上述操作, 合并各上清液, 并用含1.0 mmol·L-1
EDTA的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.5)定
容至9 mL。如无特殊说明, 各研究中的实验样
品均为小麦干种子中的游离态 b-淀粉酶。
1.3 b-淀粉酶反应体系的优化
通过预实验, 我们对前人采用的酶反应体
系(Mathewson and Seabourn, 1983; McCleary
and Codd, 1989)进行了相关调整和优化。其中
底物PNPG5和辅助酶a-葡萄糖苷酶的浓度分
别调为1.7 mmol.L-1和3.2 U.mL-1, 总反应体系
由3.40 mL降至0.33 mL, 而且不影响检测的灵
敏度。开始的反应体系为 30 mL(10 mL 酶液 +
20 mL 底物, pH6.5), 保温处理后(如无特殊说明,
反应条件为 40℃反应 4分钟, 而McCleary和
Codd(1989)建立的PNPG5法则为40℃反应10分
钟), 再用300 mL的0.25 mol.L-1 的Na2CO3终止
反应(反应体系的 pH >10.0), 并测定反应液在
410 nm处的吸光值。已知对硝基苯酚(PNO)在
pH>10.0的摩尔消光系数为 1.78×104 (Mathe-
wson and Seabourn, 1983; McCleary and Codd,
1989), 因此定义每分钟水解产生1 mmol.L-1 PNO
所需的酶量为一个酶活单位(U)。a/b-淀粉酶
2832006 凌腾芳 等: 一种微量、快速测定植物种子 b-淀粉酶活性的方法
活性测定的DNS法按照巩普遍(2000)介绍的方
法, 以每分钟水解产生1 mmol.L-1 麦芽糖所需
的酶量定义为一个活性单位(U)。
1.4 酶促反应产物的吸收光谱
将酶液分别稀释至原酶液的 2、3和 4倍,
分别记作 2×、3× 和 4×, 原酶液记为 1×, 分别
加入反应体系。终止反应后 , 反应液用
Beckman Coulter DU® 800 分光光度计进行波长
扫描, 扫描速度为 600 nm.min-1, 波长范围为
230~500 nm。
1.5 酶促反应的时间进程曲线
将酶液分别稀释至原酶液的 2、4、6和
8倍, 记为 2×、4×、6× 和 8×, 原酶液则为 1×。
分别加入底物后反应 1、2、3、4和 5分钟,
再加入Na2CO3终止反应, 测定各自的吸光值。
1.6 酶促反应的最适pH和温度
将酶液和底物用 pH为 5.0、5.5、6.0、
6.5、7.0和7.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配
制, 分别在30、40和50℃下进行反应, Na2CO3
终止反应后分别测定各吸光值。
1.7 a-淀粉酶干扰评估实验
将购来的 a-淀粉酶进行初步纯化。首先
是硫酸铵分部沉淀, 收集30%~70 %饱和度的沉
淀溶解于pH 6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液
中, 过Sephadex-G25柱, 收集酶液于4℃保存待
用, 纯化倍数为 5.2倍。将纯化后的酶液分别
稀释至纯化酶液的 75%、50%、25%、17%
和12.5%, 各稀释液的活性范围为6~50 U(DNS
法测定)。取上述不同浓度的 a-淀粉酶液, 分
别加入相同活性的小麦干种子游离态b-淀粉酶
(以不加a-淀粉酶的为对照), 分别采用DNS法
和 PNPG5法测定酶活来完成干扰评估实验。
1.8 数据分析
各实验均至少重复处理 3 次 , 采用
Microsoft Excel 2003软件统计分析所得数据。
2 结果与讨论
2.1 酶促反应产物的吸收光谱
利用对硝基苯酚麦芽五糖(PNPG5)作为底
物测定b-淀粉酶活性大小的原理是: 人工合成
底物PNPG5能够专一性地被b-淀粉酶水解成
小分子的寡糖苷, 寡糖苷再经a-葡萄糖苷酶水
解释放出生色基团对硝基苯酚(PNO), 最后通过
监测405或410 nm下的PNO产生量作为b-淀
粉酶活性大小的判定标准。因此, 产物发色基
团 PNO的检测是十分重要的。
如图 1所示, 从小麦干种子中提取的游离
态b-淀粉酶的酶促反应产物在230~500 nm范围
内有2个吸收峰, 分别位于303和398 nm处, 前
者可能是蛋白质以及游离氨基酸等物质的吸收
所导致, 而后者则是发色基团 PNO的吸收峰。
尽管405/410 nm均不是本实验中PNO最大吸光
值的吸收波长, 但通过计算发现, 在380~415 nm
之间吸光值与酶促反应产物之间均呈非常好的
线性关系(R2达到0.99), 因此在本实验中我们选
取 410 nm作为测定波长(McCleary and Codd,
1989)。
2.2 小麦 b-淀粉酶酶促反应的时间进程曲
线
由图2可知, 不同稀释度的小麦种子b-淀
图 1 不同浓度的小麦种子 b-淀粉酶的反应产物
在不同波长下的吸光值
Fig. 1 Absorbance of the reaction products of differ-
ent concentrations of wheat seed b-amylase extract
scanned by Beckman Coulter DU® 800
284 23(3)
粉酶酶促反应速度至少在1~5分钟内都具有良
好的线形关系(R2值在0.95~0.99之间), 而5~10
分钟后只有低浓度酶液的酶促反应产物生成速
度与时间才有较好的线形关系, 而高浓度的线形
关系则较差(数据未列)。为了保证线形关系和
加快测定速度, 在本法中我们选择反应4分钟作
为酶促反应的测定时间。
2.3 小麦b-淀粉酶酶促反应最适pH和温度
进一步将不同 pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.
0和 7.5)的 3×酶液与相同 pH的底物混合后,
在不同温度(30、40和 50℃)下进行反应。如
图3所示, 在pH6.5和40℃的反应条件下, 小麦
种子b-淀粉酶的催化能力最大(Mathewson and
Seabourn, 1983)。
2.4 a-淀粉酶的干扰评估实验
DNS法是目前常用的测定b-淀粉酶活性
的方法。由于淀粉廉价易得, 因此DNS法在植
物种子的研究中得到了广泛使用。我们进一
步采用同一稀释度的酶液, 分别用2种方法进行
检测, 发现PNPG5法比DNS法省时(如DNS法
需 40分钟, PNPG5法则最多只需 5分钟)。同
时, 在抗a-淀粉酶干扰方面, PNPG5法更具有明
显的优势。例如不同浓度的a-淀粉酶液对DNS
法测定 b-淀粉酶有着明显的干扰作用, 而对
PNPG5法则基本无影响(图 4)。
2.5 不同植物材料的 b-淀粉酶活性
按照植物的种类不同, 种子b-淀粉酶分为
2大类(Sopanen and Laurière, 1989; Yamaguchi
et al., 1999; Ziegler, 1999): 一类是小麦属作物(小
麦和大麦等)种子籽粒发育和成熟过程中形成的
胚乳专一型 b-淀粉酶(endosperm-specific b-
amylase), 另一类是非小麦属作物(水稻和玉米
等)种子萌发时糊粉层细胞从头合成的普遍型
b-淀粉酶(ubiquitous b-amylase), 例如水稻种子
在萌发 4~8 天时的胚乳中合成的 b -淀粉酶
(Yamaguchi et al., 1999)。进一步采用上述改良
的方法对不同植物来源的种子b-淀粉酶活性进
行检测, 发现小麦和大麦的干种子以及在其萌发
后2天均能检测到较高的b-淀粉酶活性, 而水
稻和绿豆种子中则基本检测不到b-淀粉酶活性
(绿豆只有在萌发后第 2天时检测到微弱的活
性); 同时2种麦属作物种子在萌发过程中不同
形式的b-淀粉酶活性变化也是不同的, 其中小
图 2 不同酶浓度和反应时间与PNPG5法测定b-
淀粉酶活性的线形关系
Fig. 2 Linearity of the PNPG5 b-amylase assay with
different enzyme concentrations and incubation time
图 3 pH和温度对 PNPG5法测定 b-淀粉酶活性
的影响
Fig. 3 Effects of pH and incubation temperature on
the PNPG5 b-amylase assay
2852006 凌腾芳 等: 一种微量、快速测定植物种子 b-淀粉酶活性的方法
(责任编辑: 孙冬花)
麦结合态 b-淀粉酶活性在萌发 2天时比干种
子提高了约 33.8 %, 大麦则降低了 44.5 %; 而
且在萌发过程中无论是小麦还是大麦中的
游离态 b - 淀粉酶活性均呈上升趋势(表 1 )
(Sopanen and Laurière, 1989), 上述结果进一步
验证了本方法的可靠性。
2.6 小结
通过优化和改进, 我们建立了一种微量和
快速的专一性测定植物种子b-淀粉酶活性的方
图 4 a-淀粉酶对 PNPG5法和DNS法测定 b-淀
粉酶活性的影响
Fig. 4 Effects of a-amylase on the determination of
wheat seed b-amylase by using DNS and PNPG5 meth-
ods
法, 该测定体系的最佳反应条件为: 底物
PNPG5和辅助酶 a-葡萄糖苷酶的浓度分别
为1.7 mmol·L-1和3.2 U·mL-1, 最适反应pH为
6.5, 温度为 40℃(小麦和大麦种子), 每分钟酶
促产物吸光值的变化不宜超过 0.25, 酶促反
应的测定时间为 4分钟。本方法尤其适用于
含有大量 a- 淀粉酶活性的植物种子材料。
参 考 文 献
巩普遍 (2000). 淀粉酶活性的测定. 见: 植物生理生化
实验原理和技术,李合生主编 (北京:高等教育出版社),
pp.169-172.
Mathewson, P.R., and Seabourn, B.W. (1983). A
new procedure for specific determination of b-amy-
lase in cereals. J. Agric. Food Chem. 31, 1322-1326.
McCleary, B.V., and Codd, R. (1989). Measurement
of b-amylase in cereal flours and commercial enzyme
preparations. J. Cereal Sci. 9, 17-33.
Sopanen, T., and Laurière, C. (1989). Release and
activity of bound b-amylase in a germinating barley
grain. Plant Physiol. 89, 244-249.
Yamaguchi, J. , Itoh, S., Saitoh, T., Ikeda, A.,
Tashiro, T., and Nagato, Y. (1999). Characteriza-
tion of b-amylase and its deficiency in various rice
cultivars. Theor. Appl. Genet. 98, 32-38.
Ziegler, P. (1999). Cereal b-amylases. J. Cereal Sci.
29, 195-204.
Zhang, H., Shen, W.B., Zhang, W., and Xu, L.L.
(2005). A rapid response of b-amylase to nitric oxide
but not gibberellin in wheat seeds during the early
stage of germination. Planta 220, 708-716.
表 1 不同植物种子在萌发期间的b-淀粉酶活性(U·g-1)
Table 1 The activities of b-amylase in different plant seeds during germination period
Plant materials 0 d 2 d
Free Bound Free Bound
Triticum aestivum 30.63±2.74 26.00±0.61 65.05±0.26 34.80±1.70
Hordeum vulgare 26.75±1.68 26.95±0.35 38.10±0.12 14.95±0.71
Oryza sativa - - - -
Phaseolus radiatus - - 0.08±0.00 -