全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (2): 212-219, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-02-01; 接受日期: 2007-05-10
基金项目: 高等学校博士学科点专项科研基金(No. 20060225010)和大庆市科技计划项目“大庆地区抗旱耐盐绿化树种资源的选择、
引种及产业化繁殖技术研究”
* 通讯作者。E-mail: yaguangzhan@126.com
.组织培养简讯.
茶条槭愈伤组织的再生体系建立及其
没食子酸含量的测定
李海艳, 宋继园, 董杰, 詹亚光 *
东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨 150040
东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
摘要 通过愈伤组织诱导途径, 建立了快速高效的茶条槭再生体系。成熟种子在MS+1.0 m g·L-1 6-BA的培养基中萌发, 以茎
段作为外植体, 在WPM+0.002-0.01 m g·L-1 TDZ+0.1 m g·L-1 6-BA中培养3周诱导形成愈伤组织, 诱导频率平均为98.0%。
愈伤组织转入WPM+0.01 m g·L-1 TDZ+0.1 m g·L-1 6-BA培养基中得到再生芽, 分化频率为42.0%,平均每块愈伤产生再生芽
10个左右。转到WPM+0.3 m g·L-1 IBA的培养基上的再生芽均可生根并长成完整植株, 小苗移栽成活率达到89.0%。实验还
建立了愈伤组织中没食子酸的提取和HPLC检测方法。对深绿色愈伤组织连续培养2个继代后, 没食子酸含量达到2.8%。
关键词 茶条槭, 愈伤组织, 没食子酸, HPLC
李海艳 , 宋继园 , 董杰 , 詹亚光 (2008). 茶条槭愈伤组织的再生体系建立及其没食子酸含量的测定. 植物学通报 25, 212-219.
茶条槭(Acer ginnala Max im)是槭树科槭树属的落
叶灌木或小乔木, 别名茶条、茶条木或茶条子。茶条
槭主要分布在我国东北山地、内蒙古及华北山地,长江
流域也有生长, 黑龙江省主要分布在小兴安岭、完达山
和张广才岭等山区, 属阳性树种, 耐寒, 抗风雪。茶条
槭树形优美, 叶形清秀, 尤其是秋后叶色鲜红艳丽, 极具
观赏价值, 加上生长快, 耐修剪, 在东北地区园林绿化中
应用较普遍。有报道显示, 茶条槭对汽车尾气、土壤
中的重金属污染和水分胁迫都有很强的适应能力(孙志虎
和王庆成, 2004; 马树华等, 2005), 因此茶条槭是东北
地区园林绿化尤其是城镇绿化的优良树种。除此之外,
茶条槭的嫩叶可以加工制成茶叶, 具有生津止渴和退热
明目的功效。更重要的是, 茶条槭还是一种重要的药用
植物资源, 其叶片中含有大量的没食子酸, 即3, 4, 5-三
羟基甲苯酸, 每公斤干叶含没食子酸 200 g左右, 目前
工业上每 1 kg干叶提取没食子酸已达 80-100 g。而
没食子酸被广泛应用于医药、化工、食品、轻工、印
染和军工等方面, 目前销售价格在 20-30万元 / t (祁永
会等, 1998), 仍处于供不应求的状态。
孟月娥等(2005)以幼嫩枝条为外植体, 在WPM+
0.1 mg·L-1 IBA+3% 蔗糖中培养, 不经过愈伤组织阶段,
从叶腋处直接增殖, 1个月内能够增殖 3倍。有关槭属
其它树种组织培养的研究报道较多, 如Wilhelm(1999)对
假挪威槭(Acer pseudoplantanus L.)、Durkovic (2003)
对尖尾槭(Acer caudat ifolium Hayata)幼树进行离体再
生技术的研究都获得了成功, 目前尚未见茶条槭愈伤组
织培养再生和次生代谢产物合成调控的研究。
为了更加充分利用茶条槭这一珍贵的植物资源, 本
文以种子为初始材料, 通过愈伤组织形成和分化实现了
茶条槭的快速繁殖, 并对愈伤组织的继代培养中没食子
酸含量进行了测定, 初步选出了没食子酸含量较高的愈
伤组织类型。
213李海艳等: 茶条槭愈伤组织的再生体系建立及其没食子酸含量的测定
1 材料和方法
1.1 植物材料
将茶条槭(Acer ginnala Max im)成熟种子在适宜的培养
基中萌发后, 切掉胚根, 以胚轴及胚芽部分作为不定芽直
接再生途径的材料; 以组培苗的茎段和叶片为外植体, 诱
导愈伤组织, 进一步分化不定芽并生根。
1.2 种子的消毒处理
成熟种子剥开外种皮后用自来水浸泡 1天, 待种子充分
吸水变得饱满之后, 置于超净工作台上, 用 70% 乙醇浸
泡30-40秒, 再用3%次氯酸钠或10%次氯酸钙溶液浸
泡 10-15分钟, 最后用灭菌蒸馏水冲洗 4-5次。接种
于附加0.1 mg·L-1 6-BA 的MS(顾淑荣等, 1989)萌发培
养基上。
1.3 愈伤组织培养及植株再生
取组培苗的幼嫩叶片和茎段, 接种于WPM+0.5-1. 0
mg·L-1 2, 4-D+0.1-0.25 mg·L-1 KT和WPM+0.002-
0.01 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA 中分别诱导愈伤组
织。以颜色浓绿、结构致密、表面光滑、生长旺盛
的块状愈伤组织为材料, 在W PM +0-0. 02 m g·L-1
TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA 中继代培养。选择浅绿疏松、
具有光泽且表面略显红色的愈伤组织为材料 , 在
WPM+0.01 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA 中进行不定
芽分化。当不定枝长到 2-3 cm时, 将其切下接种于生
根培养基中, W PM、NT(顾淑荣等, 1989 )、MS 和
1/2MS 分别添加 0-0.35 mg·L-1 IBA+0-0.32 mg·L-1
NAA。生根培养 20天后将培养瓶放置于温室内, 打开
瓶盖炼苗 2-3 天后, 移栽至盛有草炭土基质的营养钵
内。培养条件均为温度(25±1)°C,每天光照 12 小时,光
照强度 2 000 mmol·m-2·s-1。外植体的取材和接种都随
机进行, 且每个处理至少保证 30 个外植体。
1.4 愈伤组织中没食子酸含量的检测
将新鲜的愈伤组织烘干至恒重, 用甲醇超声2分钟后, 加
入 10%稀硫酸 60°C水浴 1小时, 静置几分钟后将得到
的样品溶液经0.2 mm筛孔过滤, 用HPLC法检测没食子
酸含量(图 1, 图 2)。将测得的峰面积按照下列关系式计
算得出样品中没食子酸的含量:
Cx=(Ax×Cb)/Ab×稀释倍数 /样品重量
其中, Cx 为样品中某种组分(没食子酸)的含量(mg·g–1
DW); Ax为样品中该组分的吸收峰面积; Cb为该组分标
样的含量; Ab 为该组分标样的吸收峰面积。
色谱条件为: 色谱柱HiQ s il C18W 4.6 mmf × 250
mm; 流动相甲醇:水为 40%:60%; 流速 0.5 mL·min-1;
进样量 5 mL; 检测波长 270 nm。
2 结果与分析
2.1 不同消毒方式对种胚污染率及萌发效果的
影响
采用不同消毒方式其种胚萌发率及成苗率都不同(表 1),
用 70%乙醇浸泡40秒, 再用 3%NaClO处理 15分钟的
图 1 没食子酸标准样品图
Figur e 1 HPLC chart of gallic acid s tandard sample
图 2 愈伤组织样品图
Figur e 2 HPLC chart of callus sample
214 植物学通报 25(2) 2008
种胚污染率最低(12.3%), 种子萌发率最高, 达到75.0%
以上。所有培养基中的种胚, 在接种后 1天之内都表现
出明显的褐化现象, 内种皮及周围的培养基呈深褐色。
可在接种后种胚萌发的前期, 先进行 2-3天的暗培养,
再给以光照, 同时对种胚进行转移。
2.2 不同基本培养基和BA浓度对种胚萌发的影
响
将种子按照最佳方式消毒后, 分别接种于附有不同浓度
6-B A 的WP M、IS、MS 和 NT 4 种基本培养基中。
结果表明, 种子在这4种培养基上均能生长, 只是种胚萌
发率及苗的长势不同(表 2 )。
相同激素水平下, WPM基本培养基中萌发率较高,
而且苗的长势良好; MS和NT次之, 而IS不仅萌发率低,
而且苗的长势明显不及其它。其中以WPM+1.0 mg·
L-1 6-BA 培养基中的种子萌发率最高, 达到 89.0%。
另外可以看出, 激素浓度对种胚的萌发也有明显的
影响。在含有 1.0 mg·L-1 6-BA 的WPM 中, 种子接种
7天, 胚根部位即出现浅绿色, 随后绿色部位继续膨胀,
胚轴外露伸长, 接着种皮脱落, 12天展开子叶。而不加
激素的培养基中, 接种 20天左右胚根部位才显现绿色,
萌发则需要更长的时间。由此可见, 细胞分裂素 6-BA
在种子萌发过程中起了明显的促进作用。
2.3 愈伤组织诱导与植株再生
2.3.1 愈伤组织的诱导培养
取组培苗的幼嫩叶片和茎段为外植体, 分别接种于附加
有不同种类和浓度激素的WPM培养基中(表3), 比较不
同外源激素对茎段和叶片愈伤组织诱导的影响。实验
结果显示, 在添加有 0.005-0.01 mg·L-1 TDZ的 6、7
号组合中最早出现愈伤组织。培养 5天后, 茎段的一端
及叶片的叶柄部位开始膨大, 并显现出红色, 随后逐步形
成愈伤组织。茎段诱导出的愈伤组织为浅绿色, 表面带
紫红色小点, 而浓度为0.002 mg·L-1 TDZ(5号)培养基中
的外植体直到 2周后才开始形成愈伤组织。但培养至 4
周时, 各组合之间愈伤组织在生长量和色泽上没有明显
差别, 所诱导出的愈伤组织均为接近透明的浅绿色, 表面
略带红色, 含水量较大。2,4-D与 KT组合, 在愈伤组织
诱导的第 7天, 茎段两端和叶片、叶柄及叶脉处开始膨
大, 随后逐渐形成浓绿或浅褐色愈伤组织, 15天即达到
生长最旺盛点, 随后开始出现褐化(图 3A)。在所测试的
浓度范围内, 随着2,4-D浓度的升高, 愈伤组织生长的速
率也逐渐增加, 褐化现象却逐渐加重。将由 2,4-D +KT
组合诱导出的愈伤组织在 0.004 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·
表 1 不同的消毒方式对种子生活力的影响
Table 1 Effects of different s ter ilizing methods on the energy of seeds
No. of seeds 70% ethanol Ca(ClO)2 or NaClO Contamination rates (%) Germination rate (%)
100 40 s 10%Ca(ClO)2, 15 min 21.9 78.6
100 30 s 3%NaClO, 15 min 40.0 66.5
100 40 s 3%NaClO, 10 min 29.0 71.8
100 40 s 3%NaClO, 15 min 12.3 88.2
表 2 不同的培养基和 6-BA 浓度对种子萌发效果的影响
Table 2 Effects of different media and concentrations of 6-BA on bourgeon of seeds
Cultural types No. of seed Germination rate (%) Grow th state
WPM+0.5 mg·L-1 6-BA 100 86.4 Vigorous , dark-green
WPM+1.0 mg·L-1 6-BA 100 89.0 Vigorous , dark-green
WPM+0 mg·L-1 6-BA 100 82.8 Vigorous , dark-green
IS+1.0 mg·L-1 6-BA 100 63.4 Tenuous, yellow -green
MS+1.0 mg·L-1 6-BA 100 78.4 Vigorous , dark-green
NT+1.0 mg·L-1 6-BA 100 79.2 Vigorous , dark-green
215李海艳等: 茶条槭愈伤组织的再生体系建立及其没食子酸含量的测定
L-1 6-BA组合培养基中继代培养, 颜色渐渐变为灰白色,
培养 20天后,大部分愈伤组织死亡。而在 0.5 mg·L-1
NAA+0.5 mg·L-1 6-BA组合中继代培养, 愈伤组织保持
绿色, 但无明显生长, 只是质地变得更加坚硬, 最后也褐
化死亡。在 NAA与 KT或者 BA 的组合中, 只有少数外
植体诱导出愈伤组织, 呈黄褐色, 无光泽。
在所尝试的所有激素组合中, 叶片出愈率低, 而且愈
伤组织质量和生长量都不及茎段。相同的外植体在含
有不同激素种类的培养基中其诱导愈伤组织的能力也有
很大差异。含 2, 4-D的培养基诱导的愈伤组织具有较
高的生长活性, 外植体能够迅速出愈并在短期内达到生
长顶峰。而 TDZ+6-BA诱导出愈较晚, 生长速度也相对
较慢, 但诱导出的愈伤组织更易分化出新植株。另外,
两者所诱导出的愈伤组织在颜色和质地上也有明显不同,
TDZ+6-BA诱导出的愈伤组织呈晶莹的浅绿色, 并且表面
带有紫红色小点(图 3 B ) , 这是细胞快速分裂的标志
(Durkovic, 2003), 最终能够分化形成玻璃化小植株。2,
4-D +KT诱导出的愈伤组织, 呈浅绿或灰白色、颗粒状
且疏松易碎, 继代培养难以存活。
2.3.2 愈伤组织的继代增殖培养
以不定芽直接再生途径中幼苗基部产生的浓绿色, 结构
较致密的愈伤组织为材料, 仍然以WPM为基本培养基,
降低或升高 TDZ浓度, 或者添加少量的生长素。1个月
后愈伤组织生长情况见表 4。
愈伤组织的生长量随着 TDZ浓度的增加而增加, 4
周后新生长的愈伤组织呈浅绿色、质地疏松、色泽鲜
艳且生长速度也较快, 在WPM+0.005-0.008 mg·L-1
TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA中连续继代培养多次, 生长状态
依然良好(图 3D)。
表 3 不同外源激素组合对茎段和叶片愈伤组织诱导的影响
Table 3 Ef fec ts of dif ferent plant grow th regulators on callus induc tion f rom stems and leaves
No. Plant grow th regulators No. of callus f ormation Callus induction rate(%)
Stem Leaf Stem Leaf
1 0.5 mg·L-1 2,4-D+0.25 mg·L-1 KT 24 30 26.7 33.3
2 1.0 mg·L-1 2,4-D+0.10 mg·L-1 KT 42 24 46.7 26.7
3 0.5 mg·L-1 2,4-D+0.10 mg·L-1 KT 30 33 33.3 36.7
4 1.0 mg·L-1 2,4-D+0.25 mg·L-1 KT 48 36 53.3 40.0
5 0.002 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA 60 45 66.7 50.0
6 0.005 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA 54 39 60.0 43.3
7 0.01 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA 66 54 73.3 60.0
8 0.5 mg·L-1 NA A+0.25 mg·L-1 KT 45 18 50.0 20.0
9 1.0 mg·L-1 NA A+0.25 mg·L-1 KT 42 24 46.7 26.7
10 0.5 mg·L-1 NA A+0.5 mg·L-1 6-BA 48 24 53.3 26.7
11 1.0 mg·L-1 NA A+0.5 mg·L-1 6-BA 33 30 36.7 36.7
表 4 不同激素组合对愈伤组织继代增殖培养的影响
Table 4 Ef fec ts of dif ferent plant grow th regulators on callus subculture
No. Plant grow th regulators Grow th state Callus s tatus
1 0 mg·L-1 TDZ+0 mg·L-1 6-BA - Severe brow ning and death of 80%
2 0.001 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA + Brow ning and death of 20%
3 0.005 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA ++ Dark-green in centre, sur rounding light-green
4 0.01 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA +++ Dark-green in centre, sur rounding light-green
5 0.02 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA ++++ Dark-green in centre, sur rounding light-green
6 0.005 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1NA A ++ Dark-green in centre, surrounding yellow -green
-: 不生长; +: 少量生长; ++-++++: 生长量逐级增加
-: no grow th; +: less grow th; ++-++++: incremental- load grow th
216 植物学通报 25(2) 2008
图 3 愈伤组织途径的植株再生
(A) 2,4-D 和 KT诱导的愈伤组织;
(B) TDZ和 6-BA 诱导的愈伤组织;
(C) 愈伤组织分化不定芽;
(D) 适合继代培养的愈伤组织;
(E) 去玻璃化培养;
(F) 不定枝生根
Figur e 3 Callus regeneration for Acer ginnal a Max im
(A) callus induced us ing 2,4-D and KT;
(B) callus induced us ing TDZ and 6-BA;
(C) adventitious buds differentiation f rom callus;
(D) callus suitable f or subculture;
(E) normal culture of v itr if ied buds;
(F) rooting of shoots
2.3.3 愈伤组织的分化培养
2.3.3.1 愈伤组织不定芽的分化
TDZ 诱导的表面显红色的愈伤组织在 0 . 01 m g ·L-1
TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA 的培养基中继代 2次后, 有部分
愈伤组织表面布满丛芽(图3C), 愈伤组织分化率为42%,
平均不定芽数目为 10。实验显示, 不定芽一旦被诱导
分化, 便可以多次继代, 实现快繁; 另外, 也发现分化出
的不定芽有玻璃化现象。
2.3.3.2 丛生芽的去玻璃化培养
将带有玻璃化丛芽的愈伤组织分割成0.5 mm左右的
小块, 分别接种于以改良WPM为基本培养基且附加
各种不同激素组合的培养基中(表 5) , 观察玻璃化苗
的变化。
由表 5可知, 玻璃化幼苗转移至 TDZ浓度降低的培
养基中, 1 cm以上幼苗能够伸长生长, 并产生正常茎尖,
这样采用二次培养的方法, 即用正常茎尖再培养就可以
使玻璃化问题得到解决(图 3E)。值得注意的是, 在不含
激素的1号培养基上, 1 cm以上的幼苗长势茁壮, 20天
后能够长至 5-8 cm, 同时茎增粗, 叶片长大, 并会有部
分生根。而 1 cm 以下的幼苗却表现生长不良或变黄,
甚至停止生长。
2.4 不同浓度的NAA、IBA对不定芽生根的影响
把壮苗培养后 2-3 cm的幼苗接入按表 6设计的不定根
诱导培养基中, 在培养1周和2周后, 分别记录不同处理
下外植体根诱导效果(表 6 )。
WPM+0.3 mg·L-1 IBA生根效果好(图 3F), 外植体
首先生根, 而不加植物激素或只含有 NAA 的培养基中,
外植体则需要在培养半个月后才可以诱导产生不定根。
从表6可以看出, IBA对外植体的生根具有明显的促进作
用, 且随着 IBA 浓度的增加, 生根率和生根数目都有所
增加。不加生长素, 外植体也可生根, 但生根数量少, 且
细弱, 必然影响移栽后的成活率。
生根培养21天后, 将培养瓶移至温度(23±2)°C、光
照强度 400-600 µmol·m-2·s-1、湿度 85% 以上的温室
内, 打开瓶盖炼苗 2-3天。移栽时洗净根部培养基, 栽
至基质黑土: 草炭土: 河沙 = 3: 2: 1的小营养钵内。每
天喷雾状水 4-5次, 保持相对湿度90%, 15天左右移栽
217李海艳等: 茶条槭愈伤组织的再生体系建立及其没食子酸含量的测定
苗有新根生出, 成活率达到 89%。
2.5 愈伤组织中没食子酸的含量
以深绿色愈伤组织为材料, 继代培养 2次后取材。
我们得到样品没食子酸平均含量为 2.80%。自然状态
下, 茶条槭叶片中没食子酸含量为 20%, 目前工业上提
取的最大含量为 10%(祁永会等, 1998)。虽然愈伤组织
与天然树叶中的没食子酸含量有一定差距, 但茶条槭愈
伤组织生长迅速, 每 4周一个继代, 可循环再生, 按年生
产量计算可达到甚至超过天然树木叶片中的产量。这
样既减少对树木的破坏, 又不受季节和场地的限制。结
合诱导子技术及基因工程手段, 实现用细胞培养的方法
生产没食子酸, 具有很强的可行性和广阔的应用前景。
更为重要的是, 本实验为没食子酸的生物来源提供了一
条新的途径。
3 讨论
在植物组织培养中, 减轻和控制外植体褐变是一项重要
的研究内容。目前认为, 组培过程中的褐变主要是由酶
促引起的, 引起褐变的酶主要是多酚氧化酶(polyphenol
oxidase, PPO)(姚红军等, 1999)。许多研究者在培养
基中加入抗氧化剂和吸附剂等来抑制或减轻褐变(刘兰
英, 2002; 张俊琦和罗晓芳, 2006)。茶条槭是一种酚类
物质含量丰富的树种, 实验中, 种胚接种1天之内即表现
出明显的褐化现象。由于光照是多酚氧化酶活性的促
进因子, 我们采用多次转移结合暗培养的方法, 有效控制
了外植体的褐变。具体做法是在外植体接种后褐化之
前, 迅速将外植体转移至新的培养基或者是同一培养瓶
的不同部位, 并在接种的初期适当遮光, 待种子萌发后再
给以光照。此方法比较经济, 简单易行, 应是控制褐变
的首选方法。褐变的发生主要在外植体接种期和初期
培养阶段外植体的伤口处, 经多次继代培养的愈伤组织
则无褐变现象发生。
据报道, 由于受到原料限制, 目前没食子酸的出产国
只有中国和日本(李志国, 2004)。我国没食子酸的生产
主要是以五倍子和塔拉为原料加工制成的, 目前原料供
应紧张。近几年, 茶条槭因为其丰富的没食子酸含量而
表 6 不同的激素浓度配比对诱导生根的影响
Table 6 Ef fec ts of dif ferent plant grow th regulators on roots induction
Plant grow th regulators No. of Rooting Rooting rate Average No.of Grow th s tate of explants and roots
explants in a w eek (%) roots per explant
0.0 mg·L-1 IBA+0.0 mg·L-1 NA A 24 No 58.3 1-2 Plantlets grew vigorously,
root tenuous
0.0 mg·L-1 IBA+0.3 mg·L-1 NA A 30 No 63.6 2-3 Plantlets grew not remarkably, partial
leaves became yellow
0.1 mg·L-1 IBA+0.0 mg·L-1 NA A 32 Yes 81.8 2-3 Plantlets grew vigorous ly, root
vigorous
0.3 mg·L-1 IBA+0.0 mg·L-1 NA A 30 Yes 100.0 3-4 Plantlets grew vigorous ly, root
vigorous
表 5 不同激素对玻璃化丛芽苗培养的影响
Table 5 Ef fec ts of dif ferent plant grow th regulators on vitrif ied buds
No. Plant grow th regulators Plants grow th state
1 0.0 mg·L-1 TDZ+0.0 mg·L-1 6-BA Shoots more than 1 cm grew normally , otherw ise grew poor ly and the leaves
became yellow
2 0.0 mg·L-1 TDZ+2.0 mg·L-1 6-BA Partial shoots grew normally, partial plantlets vitrif ication w ith full-grow n calli
3 0.001 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA Status near ly the same as above, jus t the amount of calli inc reased, and their
colour became light red
4 0.1 mg·L-1 IBA Shoots more than 1 cm grew normally w ith less leaves became yellow ,
otherw ise grew s low ly and died
218 植物学通报 25(2) 2008
备受关注, 同时也成为了没食子酸生产的一种新的原料
来源。但目前所需的茶条槭原料主要还是依靠野生资
源, 产量和质量都不稳定, 同时这种掠夺式开发对茶条槭
资源造成了极大的浪费和破坏(潘侠, 2005)。寻找一种
适宜的方法来解决目前所面临的问题意义重大。
根据已有的报道, 应用细胞培养生产有用的次生物
质, 以其不受地理、气候条件的限制, 成本低、周期
短、易调控且易实现工业化生产等诸多优点而备受关
注并迅速发展。自 20世纪 80年代以来, 人们便以细胞
工程为基础(Verpoorte et al. , 2002), 从外植体选择、
高产细胞系筛选、两相法培养、培养基条件以及物理
因子、化学因子的调控(马玉芳和许继宏, 2003)到前体
饲喂(曲均革等, 2006; Liu et al., 2007), 在培养基中添
加代谢产物合成抑制剂(曲均革等, 2006 )或是诱导子
(Komaraiah et al., 2002; Huang and Wu, 2005; Ge
and Wu, 2005; Zhang et al., 2007), 甚至是利用基因工
程的手段对次生物质合成途径进行修饰, 积极探索各种
物种组培规模化生产次生代谢产物的技术与方法, 并取
得了可喜的成绩。其中, 紫草宁、小檗碱和人参皂苷
等已经成功实现了商业化大规模生产。
由于茶条槭愈伤组织生长迅速且没食子酸含量较高,
而且其已摆脱了褐化的干扰, 因此可作为进一步生产没
食子酸的生物反应器。茶条槭愈伤组织培养体系和再
生技术的建立一方面可为次生代谢产物的利用、生物
合成途径等疑难问题的研究提供一个很好的技术平台,
也为今后通过诱导子技术及基因工程手段对没食子酸的
代谢途径进行调控打下基础; 另一方面又为茶条槭无性
繁殖利用提供技术支持。茶条槭愈伤组织再生途径的
建立和愈伤组织培养获取没食子酸的研究使利用细胞培
养及植物基因工程手段生产没食子酸成为可能, 因此具
有广阔的应用前景。
参考文献
顾淑荣 , 刘淑琼 , 桂耀林 (1989)．园艺植物组织培养技术和应
用．北京: 北京科学技术出版社. pp. 53-53.
李志国 (2004)．塔拉基地建设与系列产品开发．农业科技成果
24, 60-60.
刘兰英 (2002). ‘薄壳香’核桃组培中的褐化及防止措施研究．园
艺学报 29, 171-172.
马树华 , 王庆成 , 李亚藏 (2005)．汽车尾气对四种北方阔叶树叶
绿素荧光特性的影响．生态学杂志24, 15-20.
马玉芳 , 许继宏 (2003)．提高植物细胞培养中次生代谢产物产量
的方法．云南大学学报(自然科学版) 25(增刊), 142-145.
孟月娥 , 周子发 , 李艳敏 , 赵秀山 (2005)．茶条槭的组织培养和
快速繁殖. 植物生理学通讯 41, 790-790.
潘侠 (2005)．经济植物茶条槭的开发利用及其展望．防护林科
技 67, 71-72.
祁永会 , 吴晓春 , 张金荣 (1998)．茶条槭的开发展望．经济植
物 3, 32-32.
曲均革 , 虞星炬 , 张卫 , 金美芳 (2006)．前体饲喂、诱导子和
光照联合使用对葡萄细胞培养合成花青素的影响．生物工程学
报 22, 299-305.
孙志虎 , 王庆成 (2004)．土壤含水量对三种阔叶树苗气体交换及
生物量分配的影响．应用与环境生物学报10, 7-11.
姚洪军 , 罗晓芳 , 田砚亭 (1999)．植物组织培养外植体褐变的研
究进展．北京林业大学学报 21, 78-84.
张俊琦 , 罗晓芳 (2006)．牡丹组织培养中褐化的发生原因与防止
方法的研究. 沈阳农业大学学报 37, 720-724.
Durkovic J (2003)． Regeneration of Acer caudatifolium Hayata
plantlets from juvenile explants . Plant Cel l Rep 21, 1060-
1064.
Ge XC, Wu JY (2005). Tanshinone produc tion and isoprenoid
pathw ays in Sal via milti orrhi za hairy roots induced by A g+
and yeast elicitor．Plant Sc i 16, 487-491.
Huang YF, Lan WZ, Che n C, Yu LJ (2005). The role of
lipoxygenase in elicitor -induced taxol production in Taxus
chinensis cell cultures. Proc Bi ochem 40, 2793-2797.
Kom ar aiah P, Naga Am r utha R, Kav i Kis hor PB,
Ram akris hna SV (2002)．Elicitor enhanced production of
plumbagin in suspens ion cultures of Pl umbago rosea L．
Enzyme Microb ial Technol 31, 634-639.
Liu JY, Guo ZG, Ze ng ZL (2007) . Improved accumulation of
pheny-ethanoid glycosides by precursor feeding to suspen-
sion culture of Ci stanche salsa．Bi ochem Engi neer J 3,
88-93.
Ver poorte R, Contin A, Meme link J (2002). Biotechnology
f or the produc tion of plant secondary metabolites．
Phytochem Rev 1, 13-25.
Wilhelm E (1999)．Micropropagation of juvenile sycamore maple
via adventitious shoot formation by use of thidiazuron． Plant
Cell Tissue Organ Cult 57, 57-60.
Zhang CH, Fever eiro PS, He GY, Chen ZJ (2007)．En-
hanced paclitaxel productivity andrelease capacity of Taxus
chinensi s cell suspens ion cultures adapted to chitosan．
Plant Sci 172, 158-163.
219李海艳等: 茶条槭愈伤组织的再生体系建立及其没食子酸含量的测定
Establishment of Callus Regeneration System for Acer ginnala
Maxim and Determination of Gallic Acid in Callus
Haiyan Li, Jiyuan Song, Jie Dong, Yaguang Zhan*
Co lle ge of L ife Scien ces, North east Fore stry Unive rsi ty, Ha rbi n 1 5004 0, Chi na
Ke y L aborato ry of Fore stry Tree Gen eti cs Improve men t, Mini stry o f Ed uca tio n, Northea st
Fo restry Un ive rsi ty, Harbin 15 004 0, Chi na
Abstr act A reproducible system for callus induction of Acer gi nnal a Max im is desc ribed. The system involves mature seeds
sprouted on MS medium supplemented w ith 0.1 mg·L-1 6-BA, the stems of young seedling as explants, and calli easily induced on
w oodyplant medium (WPM) supplemented w ith 0.002-0.01 mg·L-1 TDZ and 0.1 mg·L-1 6-BA 3 w eeks f ollow ing induction. The
frequency of callus induction can be as high as 98.0%. On WPM containing 0.01 mg·L-1 TDZ and 0.1 mg·L-1 6-BA , 42% of calli
differentiated, and the mean number of buds per piece of callus w as about 10. The buds developed roots on WPM medium w ith
0.3 mg·L-1 IBA and f ormed plantlets, 89% of w hich survived on transplantation to the greenhouse. Methods to extrac t and determine
gallic acid from callus w ere es tablished and show ed 2.8% content of gallic acid in bottles of green callus subcultured tw ice.
Ke y w ords Acer gin nal a M axi m, cal lus, ga ll i c a cid , HPLC
Li HY , Song JY , Dong J, Zha n YG (200 8). Estab lish men t o f call us rege nerati on system for Acer ginn ala Ma xim an d d etermin ati on of
ga ll i c a cid in ca llu s. Ch in Bull Bo t 25 , 21 2-21 9.
* Author for correspondence. E-mail: yaguangzhan@126.com
(责任编辑: 白羽红)
科学出版社新书推介
水稻基因设计育种
钱前 主编
978-7-03-020098-3／Q.1958 ￥98.00 2007年12月12日出版
本书系统地介绍了水稻转基因技术、花药培养、分子标记辅助育种和基因组辅助育种的基本原理和方法, 阐述了水稻
产量性状、抗病虫性、抗逆性状、营养品质和特异种质的遗传研究及分子育种的最新进展、水稻基因设计育种数据库建
设和水稻基因设计育种的展望, 反映了在水稻分子育种方面获得的成果。全书共分12章, 各章节前后呼应, 又独立成章, 是
一本涵盖了水稻遗传学、分子标记辅助选择及水稻重要性状的分子育种等多方面理论和实践知识的参考书。
本书可供作物遗传育种、分子遗传学、生物学、农学和生物工程等专业的教师、学生及相关领域的科研人员及管理
工作者阅读参考。
邮购地址: 北京东黄城根北街 16号 科学出版社科学出版中心生命科学分社 邮编: 100717
联系人: 阮芯　 电话: 010-64034622(带传真)
欢迎各界人士邮购科学出版社各类图书(免邮费)
更多精彩图书目录请登陆 http : //www.lifescience.com.cn