全 文 ：植物学通报 2005, 22 (5): 594~598
Chinese Bulletin of Botany
①国家自然科学基金项目(30470283, 30370126, 30200030)、广东省教育厅项目(Z02018)资助和留学回国人员
科研基金项目资助启动。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: lishsh@scnu.edu.cn
收稿日期: 2005-04-26 接受日期: 2005-07-29 责任编辑: 于昕
技术与方法
拟南芥CHS基因表达的实时荧光定量 PCR检测①
1,2王 艳 1蒋 磊 1李韶山②
1(华南师范大学生命科学学院 广州 510631) 2(暨南大学理工学院环境工程系 广州 510632)
摘要 在简要介绍实时荧光定量PCR反应和定量原理的基础上, 采用TaqMan荧光定量PCR技术, 研
究了UV-B辐射对拟南芥(Arabidopsis thaliana)CHS(查耳酮合成酶基因)表达的诱导, 获得了与传统
Northern杂交一致的结果。实时荧光定量PCR用于基因表达的定量检测, 具有特异性强、自动化程度
高、高效快捷, 避免使用放射性同位素, 能同时对多个样品中的起始模板进行准确定量等特点, 因此该
方法已逐渐被广泛用于基因表达的定量分析。
关键词 拟南芥, 查耳酮合成酶基因, 基因表达定量分析, 实时荧光定量PCR
Quantitative Analysis of CHS Gene Expression in Arabidopsis
thaliana by Real-time RT-PCR
1, 2WANG Yan 1JIANG Lei 1LI Shao-Shan②
1(College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631)
2(College of Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632)
Abstract Fluorescent-based real-time PCR is widely used for quantification of nucleic acids. It
is becoming one of the most important techniques for molecular biology and biotechnology.
Real-time PCR assay is easy to perform, capable of high throughput, and can combine high
sensitivity with reliable specificity. The technique is evolving rapidly with the knowledge of new
enzymes, chemistry and instrumentation. The principle of real-time PCR and its application in
quantifying plant nucleic acids is reviewed.
Key words Arabidopsis thaliana, Chalcone synthase gene (CHS), Quantitative analysis of
gene expression, Real-time PCR
实时荧光定量PCR技术是由美国Applied
Biosystems公司(ABI) 率先于 1996年推出。
所谓实时PCR是指在PCR的每一个循环中连
续检测荧光信号的强弱来即时获知特异性扩
增产物的量 , 并据此计算初始模板的量
(Montgomery and Dallman, 1997)。实时PCR
与常规的定量PCR相比有着明显的优势。它
具有特异性强、操作简便、自动化程度高、
快速高效、同时能对起始模板进行准确定量
的特点。由于在封闭的体系中完成PCR扩增
5952005 王艳等: 拟南芥CHS基因表达的实时荧光定量PCR检测
和实时测定, 大大降低了污染的可能性并且无
须在扩增后操作 , 而常规的所谓“定量”
P C R 仅仅是一种半定量的终点检测法
(Freeman et al., 1999; Schmittgen, 2001; Wall
and Edward, 2002)。
实时荧光定量PCR是在常规PCR的一对
引物之外, 加入一个两端带有荧光标记的寡核
苷酸探针。在探针完好的状态下, 5 端´报告荧
光基团的激发光被3 端´的淬灭荧光基团所抑
制。PCR反应过程中, 随着链的延伸, Taq酶
沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位
置, 发挥它的5 →´3 外´切核酸酶活性, 将荧光
探针切断, 释放出报告荧光基团的荧光信号, 每
合成一个模板, 就有一个报告基团的信号释放,
被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR产
物是一对一的关系。通过定量PCR仪定时动
态监测每一循环, 可以得到样品实际扩增曲线,
找到PCR扩增的对数期。软件通过标准品和
待测品的对数期比较 , 得到每一样品模板
DNA的起始拷贝数(Bustin, 2000, 2002)。
实时PCR的Ct值表示每个PCR反应管内
荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环
数。研究表明, 各模板的 Ct值与该模板的起
始拷贝数的对数值存在线性关系, 起始拷贝数
越多, Ct值越小, 反之亦然。利用已知起始拷
贝数的标准品可做出标准曲线, 其中横坐标代
表起始拷贝数的对数, 纵坐标代表 Ct值。因
此, 只要获得未知样品的Ct值, 即可从标准曲
线上计算出该样品的起始拷贝数(McMaugh
and Lyon, 2003)。
本文采用TaqMan荧光定量PCR技术, 对
UV-B诱导的拟南芥查耳酮合成酶基因(CHS)
表达变化进行了定量分析, 获得了与传统的
Northern blotting一致的结果。
1 材料和方法
实验材料为 30日龄的拟南芥(Arabidop-
sis thaliana, Col-0)。紫外光源经过 cellulose
diacetate 薄膜(波长292 nm以下被滤除), UV-
B辐射处理的辐照度为0.42 W.m-2 (UV-BBE),
每日11: 00~14: 00处理3小时, 培养箱内的光
合有效辐射(PAR, 400~700 nm)为 100 µmol.m-2.
s-1; 透过Mylar film(波长315 nm以下被滤除)
的光源作为UV-A。每日 16: 00时取样, 立即
用液氮固定。总 R N A 提取、电泳检测及
Northern杂交按照Strid等(1996)的方法进行。
逆转录以随机六核苷酸寡聚合物(PdN6)为引
物, 采用 Invitrogen 公司的 SuperScriptTM II
RNase H- Reverse Transcriptase 试剂盒进行;
实时荧光定量 PCR在美国 ABI PRISM 7000
SDS上进行。按照 TAIR数据库 (Http://www.
a r a b i d o p s i s . o r g )提供的 C H S 基因序列
(At5g13930), 用Primer Express 2.x 版本软件
(Applies Biosystems) 设计TaqMan® 引物和
荧光探针序列, 进行 CHS基因表达检测(表
1)。实时荧光定量 PCR方法同 Li和 Strid
(2005)。采用 TaqMan ® Universa l PCR
Master Mix (Applied Biosystems) 在96孔
板上(MicroAmp® Optical 96-well plate)进
行, 每一管的反应总体积为25 µL, PCR的温
度循环设计为: 50℃, 2分钟→95℃, 10分钟
→[95℃, 15秒 → 60℃ 1分钟] 40个循环。
用 A s s a y - o n - D e m a n d T M ( A p p l i e d
Biosystems)来检测18S rRNA 基因表达, 以
18S rRNA 基因对CHS基因表达的定量检测
结果进行校对。
表 1 CHS基因表达检测的 TaqMan® 引物和荧
光探针序列
Table 1 Sequences of TaqMan® primers and
probe for quantitative analysis of CHS gene
expression with real-time PCR
CHS gene TaqMan primer/probe sequences (5→ 3)
Forward CTCATGTCGTCTTCTGCACTACCT
primer
Reverse GAAGCTTGGTGAGCTGGTAGTCA
primer
Probe CGGCGTCGACATGCCTGGTG
596 22(5)
2 实验结果
本实验提取的RNA样品经分光光度法检
测, OD260/280在 1.8~2.0之间, OD260/230大于
2.3, 表明 RNA质量高, 可用于进一步分析。
图1是Northern杂交的结果。3小时UV-
B处理引起了拟南芥CHS基因转录的大量增
加, 而在接下来的2天中, UV-B处理的拟南芥
CHS基因表达下降, 但转录水平均高于对照;
在整个UV-A处理过程中, 检测不到CHS基因
表达。
图2是实时荧光定量PCR检测CHS基因
表达的标准曲线。从图中可见, Ct与起始模
板浓度的对数呈现高度的相关性 ( R 2 =
0.99754)。
图 3是紫外辐射处理引起的CHS基因表
达变化的实时荧光定量 PCR检测结果。3小
时UV-B处理引起了拟南芥CHS基因转录大量
增加, 到对照(0小时)的20倍, 在随后的两天处
理(6小时和9小时)中, CHS基因转录下降至
1/3左右; 而在UV-A处理, CHS基因表达始终
处于极低的水平。
3 讨论
本实验通过Northern杂交和实时荧光定
图 1 Northern杂交图谱
(每孔点样量为 10 µg总 RNA)。cDNA探针分别
是 32P标记的 CHS 和核糖体 18S rRNA基因。拟
南芥植株分别进行 UV-A或 UV-B辐射处理时间
为：0，3，6 或 9 小时。A 为经过 U V - A 处理
的样品，B 为经过 U V - B 处理的样品。用 1 8 S
rRNA基因的 cDNA探针杂交是为了验证凝胶电
泳点样量和印迹转移效率的均一性
Fig.1 Autoradiography of Northern blot (containing
10 µg total RNA in each lane) hybridised with [32P]-
labelled cDNA probes for CHS and 18S ribosomal RNA
cDNA, respectively. Arabidopsis thaliana plants were
exposed to UV-B or UV-A radiation for 3, 6 or 9 h. A.
Samples irradiated by UV-A; B. Samples irradiated by
UV-B. Hybridisation with cDNA for the 18S rRNA
was performed in order to ascertain even loading of
total RNA samples on the gel and complete transfer of
the RNA from the gel to the membrane
图 2 实时荧光定量 PCR检测 CHS基因表达的
标准曲线
Fig. 2 Quantitative real-time RT-PCR using prim-
ers and a TaqMan® probe for CHS gene, the stan-
dard curve of Ct value vs. log concentration of cDNA
图 3 CHS基因表达的实时荧光定量 PCR检测
Fig. 3 CHS gene expression profiles determined
by real-time RT-PCR
5972005 王艳等: 拟南芥CHS基因表达的实时荧光定量PCR检测
量PCR两种方法证实, 3小时0.42 W.m-2 UV-
B辐射诱导了拟南芥CHS基因的强烈表达, 而
对照(UV-A)的CHS基因表达量没有变化; 在
随后的两天UV-B处理中, CHS基因表达量有
所下降, 但始终维持在比对照较高的水平(图1
和图 3 )。
实时荧光定量PCR具有引物和探针的双
重特异性, 故与传统的半定量RT-PCR相比, 特
异性大为提高。TaqMan技术的实时荧光定
量 PCR无需内标, 理由是: 1)Ct值的重现性
好。由于 PCR循环在到达 Ct值所在的循环
数时, 刚刚进入真正的指数扩增期, 此时微小
的误差尚未放大, 因此Ct值重现性好, 即同一
模板不同时间扩增或同时间不同管内扩增, 得
到的Ct值是稳定的。2)由于Ct值与起始模板
的对数存在线性关系, 实时荧光定量PCR是一
种采用外标准曲线的定量方法, 无需做内对照
(Klein, 2002)。3)内标会对实时荧光定量PCR
产生不利影响。若在待测样品中加入已知起
始拷贝数的内标, 则PCR反应变为双重PCR,
双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和
竞争, 尤其当两种模板的起始拷贝数相差较大
时, 这种竞争会表现的更为明显。由于待测
样品的起始拷贝数是未知的, 所以无法加入合
适数量的已知模板作为内标。也正是这个原
因, 传统PCR定量方法虽然加入内标但仍然是
一种半定量的方法(McMaugh and Lyon,
2003)。
Northern杂交方法首先是对RNA样品进
行电泳分离, 然后进行印迹转移。尽管电泳
点样尽可能控制一致, 但实际操作时, 由于点
样误差及印迹转移效率的差异, 使得转移到硝
酸纤维素膜上 RNA量发生变化, 严重影响
Northern杂交的准确性。虽然本实验操作过
程中严格控制点样量(每孔10 mg RNA), 并采
用压力转移法控制均一的转移效率, 但North-
ern杂交结果显示, 从18S rRNA杂交斑点可以
看出, 各泳道的总RNA量并不完全一致, 第3
和 6泳道的总RNA量较低, 而第 1、5和 7泳
道的总 RNA量较高(图 1)。放射性探测仪器
可以给出Northern杂交信号强度的数值, 但由
于以上诸多因素的影响, 使得Northern杂交仅
仅是一种基因表达变化的定性检测方法。
实时荧光定量PCR的检测范围广, 可达到
7 ~ 8 个数量级。结果的重现性好 , 在使用
Taqman探针定量检测时, Ct值的变异系数小
于2%(Bustin, 2000)。实时PCR可以分辨出5
个拷贝的基因表达差异, 精确性非常高(Klein,
2002)。实时荧光定量PCR是一个全自动的过
程, 无PCR后操作, 使得交叉污染的几率降到
最低, 结果更具有可信性。在 96孔板上, 同
时进行的96个PCR反应可在2~3小时内完成,
检测效率高, 因此实时荧光定量PCR适宜大量
的基因表达定量分析。实时PCR作为一种高
效的核酸定量分析方法, 已逐渐被广泛接受用
于基因表达的定量分析, 并与微阵列等分子生
物学技术一起, 在后基因组时代的生命科学研
究中发挥重要作用。
参 考 文 献
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